Introduction
Mehrere Plattformen für die Diagnose von Krankheiten wurden auf Basis von nanoskaligen Materialien 1,2 wie Nanodrähte entwickelt, 3 - Nanopartikel, 4 - Nanoröhrchen, 5 und Nanofasern (NFS) 6-8. Diese Nanomaterialien bieten hervorragende Perspektiven bei der Gestaltung neuer Technologien für die hochsensiblen Biotests aufgrund ihrer einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften. Zum Beispiel haben mesoporösen Zinkoxid - Nanofasern für die Femto-molar empfindlichen Nachweis von Brustkrebs Biomarkern verwendet worden. 9 Kürzlich Basis Nanomaterialien auf Titandioxid (TiO 2) wurden für bioanalytische Anwendungen 10 unter Berücksichtigung ihrer chemischen Stabilität, 11 vernachlässigbar Proteindenaturierung untersucht , 12 und Biokompatibilität. 13 Außerdem erleichtern die Hydroxylgruppen auf der Oberfläche der TiO 2 chemische Modifikation und die kovalente Anlagerung von Biomolekülen. 14,15 Patterned TiO 2 thin Filme 16 oder TiO 2 -Nanoröhren 17 die Detektionsempfindlichkeit eines Zielproteins zu verbessern , verwendet worden sind , durch den Oberflächenbereich zu erhöhen; jedoch ist das Herstellungsverfahren ziemlich komplex und erfordert eine teure Ausrüstung. Auf der anderen Seite, elektro NFs Aufmerksamkeit wegen ihrer hohen Oberfläche erhalten sowie einfache und kostengünstige Herstellungsverfahren; 18,19 noch die zerbrechliche oder lose Charakteristik des elektro TiO 2 NF Matte macht es schwierig zu handhaben und Integration mit mikrofluidischen Systemen. 6,20 Daher wurden die TiO 2 NF Matten selten in bioanalytischen Anwendungen eingesetzt, insbesondere solche , erfordern harte Waschbedingungen.
In dieser Studie wurden diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir durch die Verwendung eines dünnen Polydimethylsiloxan (PDMS) Haftschicht, eine neue Technologie für die Übertragung der NF elektroMatten auf die Oberfläche eines beliebigen Zielsubstrat entwickelt. Furthermore haben wir erfolgreich zeigte die Integration der elektro TiO 2 NF Matten auf eine zentrifugale Mikrofluidikvorrichtung aus Polycarbonat (PC) hergestellt. Mit diesem Gerät wird eine hochempfindliche, vollautomatische und integrierte Detektion von C-reaktivem Protein (CRP) sowie kardialem Troponin I (cTnI) wurde aus 10 & mgr; l Vollblut innerhalb von 30 min erreicht. 21 aufgrund der kombinierten Vorteile der Eigenschaften des NFS- und die zentrifugale Plattform der Assay einen breiten dynamischen Bereich von sechs Größenordnungen von 1 pg / ml (~ 8 fM) bis 100 ng / ml (~ 12.08) mit einer unteren Nachweisgrenze zeigten von 0,8 pg / ml (~ 6 fM) für CRP und einem dynamischen Bereich von 10 pg / ml (~ 12.04) bis 100 ng / ml (~ 4 nM) mit einer Nachweisgrenze von 37 pg / ml (~ 01.05) für cTnI. Diese Nachweisgrenzen sind ~ 300 und ~ 20-fach niedriger im Vergleich zu ihren entsprechenden herkömmlichen ELISA-Ergebnisse. Diese Technik könnte zum Nachweis von irgendwelchen Zielproteine verwendet werden, mit entsprechenden Antikörpern. Insgesamt ist dieses Gerät could tragen wesentlich zur in-vitro - Diagnostik und biochemische Tests , da sie auch von sehr geringen Mengen an biologischen Proben selten Mengen von Zielproteinen mit großer Sensibilität erkennen kann, beispielsweise 10 & mgr; l Vollblut. Obwohl wir nur die Serumproteinnachweis mittels ELISA in dieser Studie gezeigt, die Übertragung und Integration Technologie der elektro NFs mit mikrofluidischen Vorrichtungen breiter in anderen biochemischen Reaktionen angewendet werden kann, die eine große Oberfläche für eine hohe Detektionsempfindlichkeit erfordern.
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Protocol
HINWEIS: Es wurde Blut von gesunden Individuen gezogen und wurde in einem Blutsammelröhrchen gesammelt. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Freiwilligen erhalten.
1. Herstellung von TiO 2 NF Mat
- Herstellung der Vorläuferlösung 22
- Man löst 1,5 g Titantetraisopropoxid (TTIP) in einer Mischung aus Ethanol (99,9%, 3 ml) und Eisessig (3 ml) und mische die Lösung bei RT (25 ° C) für 30 min auf einem Magnetrührer.
- Man löst 11 Gew% Polyvinylpyrrolidon (PVP) in 3,64 g Ethanol (99,9%) und rührt die Lösung bei 65 ° C für 1 Stunde einer Heißplatte Magnetrührer.
- Kombinieren Sie und rühren die beiden Lösungen bei 65 ° C für 4 Stunden auf einer heißen Platte Magnetrührer.
- Elektroverspinnen
- Laden die hergestellte Lösung in eine Spritze mit einer Nadel aus rostfreiem Stahl von 200 um Innendurchter. Füllen Sie die Lösung direkt in die Spritze nach den Kolben zu entfernen.
- Einführung der Lösung ständig mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,3 ml / h für 10 min auf einen Si-Wafer (2 cm x 2 cm), die auf einem geerdeten Substrat bei einer hohen DC-Spannung (15 kV). Während der Elektro, stellen Sie den Abstand zwischen der Nadel und dem geerdeten Substrat bis 10 cm.
- Die Calcinierung der Matte NF
- Platzieren Sie die NF - Matte in einem Ofen und erhöhen die Temperatur bis zu 500 ° C mit einer Anstiegsrate von 3 ° C / min unter Hochvakuum - Bedingungen (5 x 10 -5 Torr).
- Man hält die Temperatur bei 500 ° C für 3 Stunden. Abkühlen, um die Temperatur der Proben auf den RT (25 ° C) in dem Ofen.
2. Integration von TiO 2 NF - Matte in eine Zentrifugal Mikrofluidik - Disc
- Herstellung einer Scheibe
- Verwenden Sie die 3D - Design - Software (zB SolIDWorks oder ähnliches) darstellen Kammern, Kanäle und Ventile jeder Schicht der Scheibe. Konvertieren Sie die Design - Dateien auf Computer numerischen Steuerung (CNC) Code Generierung von Code - Software (zB Edgecam oder ähnliches). Verwenden Sie die Software gemäß der Bedienungsanleitung 23,24 . Hinweis: Die typischen Kanal verwendeten Dimensionen in diesem Gerät sind 1,0 mm x 0,3 mm (Breite x Tiefe).
- Öffnen Sie die Betriebssoftware der CNC - Fräsmaschine (z. B. DeskCNC oder ähnliches) und laden CNC-Code in die Betriebssoftware und klicken Sie auf den folgenden in dieser Reihenfolge: "AUTO" -> "G CODE OPEN" -> Wählen Sie die CNC generierten Code.
- Bringen Sie die PC-Platte auf der CNC-Fräsmaschine: Verwenden Sie 1 mm PC-Platten für die obere Schicht und 5 mm PC-Platten für die Disc-Schicht. Führen Sie die CNC-Fräsmaschine, jede Schicht der Scheibe zu schneiden, indem Sie die Schaltfläche "Start" klicken.
- Übertragung von TiO 2 NF - Matte auf die Platte
- Platzieren ein Siliziumsubstrat und eine kleine Petrischale mit 40 ul (Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-trichlorsilan in einer Vakuumkammer unter Vakuum für 30 min. Das Fluorsilan verdampft und wird auf dem Substrat beschichtet.
- Mix Polydimethylsiloxan (PDMS) Vorpolymer mit einem Härter in einem Verhältnis 10: 1 und Entgasen in einer Vakuumkammer. Spin-Beschichtung der PDMS auf ein Siliciumsubstrat bei 650 rpm für 60 sec.
- Härten des PDMS beschichtet auf einem Siliziumsubstrat in einem Ofen bei 65 ° C für 10 min eine haftende Zustand zu erreichen.
HINWEIS: Die Härtungszeit kann in Abhängigkeit von den Umgebungsbedingungen variiert werden und Haftkraft kann durch ein Klebrigkeitstest mit einem Rheometer geprüft werden. - Übertragen Sie die TiO 2 NF - Matte durch Elektrospinnen und Brennen auf der PDMS-beschichteten Silizium unter Verwendung einer Pinzette vorbereitet. Wenden Sie dann manuell einen konformen Druck auf die TiO 2 übertragen NF - Matte mit einem flachen Gegenstand (z. B. Glasträger) und das Objekt entfernen. Stellenin dem Ofen dieser Probe bei 65 ° C für 4 Stunden oder bei 80 ° C für 1 Stunde die PDMS-Schicht vollständig auszuhärten.
- Coat Bindungsreaktionskammern in der Platte mit 20 ul der PDMS / Härter - Mischung (10: 1), die wirkt als Haftschicht TiO 2 NF Matte auf die Platte zu befestigen.
- Dispense 50 ul Ethanol (99,9%) auf der TiO 2 NF - Matte auf dem PDMS - Schicht, schneiden Sie die NF - Matte mit einem Stanzloch von 6 mm Durchmesser und übertragen den Schnitt TiO 2 NF Matte zu den Bindungsreaktionskammern , beschichtet mit 20 & mgr; l der PDMS in dem vorherigen Schritt.
HINWEIS: In diesem Schritt wird Ethanol wird hilfreich sein , die geschnittenen TiO 2 NF Matte aus dem Si - Substrat zu lösen. - Inkubieren der TiO 2 NF Matte integrierten Scheibe in den Ofen bei 65 ° C für 4 Stunden oder bei 80 ° C für 1 Stunde die PDMS vollständig auszuhärten.
- Oberflächenmodifizierung der TiO 2 NF Matte auf der Disk
- Prepare 1% v / v Lösung von (3-Glycidoxypropyl) methyldiethoxy Silan (GPDES) in Ethanol (99,9%).
- Behandeln Sie die TiO 2 NF Matte integrierte Scheibe mit Sauerstoffplasma bei 140 W, 50 sccm Sauerstoffstrom für 180 Sekunden. Dispense 100 ul GPDES Lösung auf jeder Nanofasermatte und Inkubation bei RT (25 ° C) für 2 Stunden.
- Waschen Sie die Substrate kurz durch Ethanol (99,9%) unter Verwendung einer Waschflasche Dispensen, entfernen Sie dann das Ethanol vollständig durch die Scheibe Umkehren und es gegen einen sauberen Blotting abzuwischen. Härtung bei 80 ° C für 1 Stunde. Zweimal waschen mit Ethanol (99,9%) in der gleichen Weise wie oben angegeben, die physikalisch adsorbiert und ungebundener GPDES Moleküle zu entfernen.
- Föhnen mit einem Stickstoffstrom, unter Vakuum getrocknet.
HINWEIS: Die Scheibe kann in einem verschlossenen Behälter bei RT gelagert werden (25 ° C) bis zum Gebrauch.
- Immobilisierung von Antikörpern auf der Oberfläche
- Machen Sie eine Lösung von 200 ug / ml Fänger-Antikörper (monoklonale Maus-Antimenschliche hsCRP oder monoklonaler Maus-anti-cTnI) durch die Antikörper mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) -Puffer (pH 7,4) verdünnt. Verzichtet werden 5 ul der Lösung auf jede NF Matte in einer Scheibe mit einer Mikropipette. Siehe Liste Materialien für weitere Informationen über die Antikörper.
- Halten Sie die Scheiben in einer befeuchteten Kammer und Inkubation bei 37 ° C für 4 Stunden. Waschen Sie die NF-Matte mit 0,1% BSA-PBS Puffer beschichtet Antikörper. Füllen Sie die Kammer mit 100 ul Waschpuffer mit einer Mikropipette, entfernen Sie den Puffer durch Absaugen oder dekantieren. Schließlich kehren die Scheibe und tupfen sie gegen eine saubere wischen und dann die Scheibe montieren.
- Disc Montage
- Zeichnen Sie das Design der Scheibe auf doppelseitigen Klebeband mit einem CAD - Programm (zB AutoCAD oder ähnliches). Laden Sie die CAD-Konstruktion auf den Schneideplotter.
- Schneiden Sie das doppelseitige Klebeband die Schneideplotter verwenden. Ziehen Sie eine Schutzschicht aus Doppel-Klebeband ab und befestigen it auf der Oberseite der Plattenschicht. Ziehen Sie die andere Schutzschicht und befestigen Sie die obere Schicht auf der Disc Schicht ab.
- Legen Sie das vorläufig montierte Scheibe in der Pressmaschine und genau oben / Klebstoff / Scheibe Schichten unter Verwendung von Align Markierungen in jeder Schicht ausrichten, um jedes Ventil, Kanal verbinden und Kammern. Wenden Sie konformen Druck der Pressmaschine.
3. Immunoassay
- Füllen Sie die Kammern mit 1% BSA-PBS-Puffer mit einer Mikro und brüten die Scheibe bei 37 ° C für 1 Stunde unter Verwendung. Entfernen Sie den Puffer durch Absaugen mit einer Mikropipette. Führen Sie diesen Schritt, um die nicht umgesetzten Stellen zu blockieren und nicht-spezifische Adsorption von Protein zu reduzieren in einer Scheibe.
- Zweimal waschen mit 0,1% BSA-PBS durch Füllen und Absaugen der Kammern mit einer Mikropipette.
HINWEIS: In diesem Stadium kann die Scheibe bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. - Last 10 ul Antigen-dotierten Vollblut oder CRP-freies Serum für die CRP-Erkennung auf der Disc ein micropipett mite. Für die Herstellung der Eichkurven verwenden Konzentrationen von CRP von 1 pg / ml bis 100 ng / ml; und cTnI von 10 pg / ml bis 100 ng / ml.
HINWEIS: Aufgrund der höheren CRP in Vollblut, die in der Regel im Bereich um ist, CRP-freies Serum verwendet wurde, die geringe Nachweisgrenze der Vorrichtung zu demonstrieren. - Drehen Sie die Scheibe bei 3600 Umdrehungen pro Minute (391 × g) für 60 Sekunden um die roten Blutkörperchen zu trennen.
- Offenes Ventil # 1 durch Laserbestrahlung, und Transfer 4 ul des Überstandes Plasma in die Kammer, die 8 & mgr; l Antikörper, konjugiert mit HRP Detektion durch die Scheibe bei 2.400 Upm für 3 sec dreht.
. HINWEIS: Die allgemeinen Verfahren zur Ventilbetätigung und Visualisierung von Disks sind im Detail in einem früheren Bericht beschrieben 21 - Anwenden eines Mischmodus (15 Hz s -1, 15 °) für 5 sec auf Antikörper des Proteins und Nachweis zu binden.
- Öffnen Sie das Ventil # 2, und die Mischung übertragen, hergestellt in Schritt 6 an die Bindungsreaktionskammer (2400 Umdrehungen pro Minute, 3 sec). Wenden Sie dann einen Mischbetrieb (60 Hz s -1, 2 °) für 20 min eine Immunreaktion zwischen dem Gemisch und den bindenden Antikörpern auf den TiO 2 FNs zu erreichen. Nach der Reaktion wird das offene Ventil # 3 und übertragen die Restmischung in die Abfallkammer (2.400 Upm, 10 s).
- Übertragen Sie den Waschpuffer (600 ul) zu der Bindungsreaktionskammer durch das Ventil # 4 Öffnen und Drehen der Scheibe (2400 rpm, 4 sec). Dann bewerben Sie sich ein Mischbetrieb (30 Hz s -1, 30 °) für 120 Sekunden die TiO 2 FNs in der Kammer zu waschen.
- Waschen Sie die TiO 2 FNs mehr zweimal durch folgende gleiche Bedingung von Schritt 3.8, und entfernen Sie die restliche Waschpuffer vollständig durch die Scheibe bei 2400 Umdrehungen pro Minute für 20 Sekunden drehen. Dann schließen Sie das Ventil # 5.
- Für die Chemilumineszenzreaktion gelten einen Mischmodus (30 Hz s -1, 2 °) für 1 min nach der chemilumineszierenden Substratlösung zu der Bindungsreaktionskammer übertragen durch das Ventil # 6 Öffnen und SpinnAnschließend wird die Platte für 10 Sekunden bei 2.400 Umdrehungen pro Minute.
- Übertragen Sie die reagierte Substratlösung zu den Nachweiskammern durch Öffnen des Ventils # 7 und Drehen der Scheibe bei 2400 Umdrehungen pro Minute für 10 Sekunden.
- Messung der Chemilumineszenz-Signale aus der umgesetzten Substratlösung eine Photovervielfacherröhre (PMT) Modul ausgestattet Detektionssystem verwendet wird.
HINWEIS: Das Detektionssystem ist eine maßgeschneiderte Maschine folgende Teile mit: Schrittmotor, mechanische Komponenten, Übersetzungsstufen und im Handel erhältliche PMT. Die optisch-mechanische Teile und Schrittmotor zusammengebaut werden, die Vorrichtung zu halten, und der Motor die Scheibe drehen kann. Die Detektion wird durch PMT fixiert auf den optomechanischen Teilen durchgeführt, und es wird über den Detektionskammern der Vorrichtung angeordnet. Durch den Schrittmotor zu manipulieren, werden die Detektionskammern direkt unter der Nachweiszone von PMT ausgerichtet sind.
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Representative Results
Unter Verwendung dieses Protokolls, ein vollautomatisiertes zentrifugalen Mikrofluidik-Vorrichtung zum Proteinnachweis aus Vollblut mit hoher Empfindlichkeit hergestellt. Die TiO 2 NF Matten wurden durch Prozesse der Elektrospinnen und Calcinieren hergestellt. Um die FNs der gewünschten Durchmesser, Morphologie und Dicke, Elektroverspinnen Bedingungen wie Strömungsgeschwindigkeit, Spannung und Spinn Zeit wurden optimiert herzustellen. Wenn die Bedingungen nicht optimiert wurden, bildeten die Qualität der FNs war schlecht. Insbesondere FNs wurden nicht aus der Polymerlösung bei niedriger Spannung (5 kV) ausgesponnen und gebrochen wurden, wenn die Spannung hoch war (> 20 kV). In ähnlicher Weise wurde Spinnzeitkritisch für die Herstellung von NFs mit entsprechenden Dichte, nicht zu sparse (1 min) oder zu dicht (30 min). Auch Wulstbildung zu vermeiden durch hohe Strömungsraten verursacht, wurde die Strömungsrate manipuliert. So, einer angelegten Spannung von 15 kV, 10 min Elektroverspinnen Zeit und einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml hr
Die TiO 2 NF Matte wurde auf das Zielsubstrat unter Verwendung eines Klebstoffs PDMS - Schicht erfolgreich übertragen, die durch Schleuderbeschichtung auf einem PDMS silanisierten Siliziumsubstrat und Vorhärten es in einem Ofen bei 65 ° C hergestellt. Die Zeit für die PDMS - Schicht Vorhärten durch Überprüfen des Haftkraft unter Verwendung eines Klebetest (2A) optimiert. 2B zeigt die Auswirkung der Zeit auf Nanofaser Befestigungs aushärtet. Wenn das PDMS für 3 min erhitzt wurde, gibt es keine Haftkraft wie die PDMS noch nicht ausgehärtete und bleibt als eine Flüssigkeit und die NFs wurde in die PDMS-Schicht eingebettet. Wenn es für 30 Minuten erhitzt wird, ist die Haftkraft sehr schwach, da die PDMS steif wird und verliert seine klebrige Eigenschaft und die FNs wurden es nicht angebracht ist. Wann wurde das PDMS erhitzt for 10 min zeigten die PDMS starke Haftkraft und die FNs waren stark befestigt. Aus den Ergebnissen wird geschlossen, daß die optimale Zeit für PDMS für starke Bindung Vorhärten 10 min ist.
Nach Scheibenanordnung wurde der Immunoassay auf der TiO 2 NF Matte integrierten Scheibe durchgeführt , indem eine Reihe von scheibenOperationsProzesse folgenden , wie in Tabelle 1 aufgeführt. Zur Bestimmung von CRP und cTnI - Konzentrationen in unbekannten Proben, Eichkurven für jeden gemacht wurden durch Plotten die relativen Lichteinheiten (RLU) gegen die CRP oder cTnI - Konzentration (Abbildung 3). In 3A und 3B wurden die on-disc Assay - Ergebnisse im Vergleich zu herkömmlichen ELISA auf einer 96-Well - Platte für CRP und cTnI sind. Die Tests zeigten einen breiten linearen dynamischen Bereich mit einer Nachweisgrenze von 0,8 pg / ml (~ 6 fM) für CRP und 37 pg / ml (13.05) für cTnI auf einer Scheibe, dieist etwa 300-mal höher für CRP und 20-mal höher für cTnI im Vergleich zu ihren jeweiligen konventionellen ELISA-Ergebnisse (286 pg / ml, 2.03 für CRP; 824 pg / ml, 32 pM für cTnI).
Abbildung 1. Optimierung von Elektrospinnbedingungen. REM - Aufnahmen bei jedem Zustand zeigen die Morphologie der FNs gebildet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Tack Test Klebstoff PDMS - Schicht und REM - Aufnahmen von dem übertragenen TiO 2 NF - Matte. (A) Haftkraft des KlebstoffsPDMS - Schicht, mehrere Zeitlängen vorgehärteten, (B) SEM - Bilder von Nanofasern auf PDMS angebracht für verschiedene Zeitlängen gehärtet. Diese Zahl wurde von Ref geändert. 21. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Kalibrierungskurven für den Nachweis von CRP und cTnI mit Lab-on-a-Disk und 96-Well - Platte. Der Nachweis von CRP gespickt in CRP-freies Serum (A) und cTnI versetzt in Vollblut (B) durchgeführt wurden. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Messungen. Die Nachweisgrenze (LOD) wurde durch 3-fache der Standardabweichung der Negativkontrolldaten gemessen mit CRP-freies Serum oder Vollblut berechnet ohne cTnI Spiking fürCRP und cTnI sind. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Spin No. | Speed (rpm) | Ventil No. | Zeit (s) | Betrieb | |||
| 1 | 3.600 | 60 | Bluttrennung | ||||
| 2 | 2400 | 1 | 3 | geöffnetes Ventil, das Plasma in die Kammer mit 8 ul Antikörper, konjugiert mit HRP zu übertragen Erkennung | |||
| 3 | 15 Hz, 15 ° | 5 | mischen Plasma und Nachweis von Antikörpern | ||||
| 4 </ Td> | 2400 | 2 | 3 | offenes Ventil die Mischung in Bindungsreaktionskammer zu übertragen | |||
| 5 | 60 Hz, 2 ° | 1200 | mischen Fänger - Antikörper auf TiO 2 NF - Matte und Plasma-Nachweis von Antikörpern Mischung | ||||
| 6 | 2400 | 3 | 10 | offene Ventil der Mischung zu entfernen | |||
| 7 | 2400 | 4 | 4 | offene Ventil Waschpuffer zu übertragen | |||
| 8 | 30 Hz, 30 ° | 120 | mischen Puffer waschen und waschen TiO 2 NF - Matte | ||||
| 9 | 2400 | 4 | Transfer Waschpuffer | ||||
| 10 | 30 Hz, 30 ° | 120 | 2 NF - Matte | ||||
| 11 | 2400 | 4 | Transfer Waschpuffer | ||||
| 12 | 30 Hz, 30 ° | 120 | mischen Puffer waschen und waschen TiO 2 NF - Matte | ||||
| 13 | 2400 | 4 | Transfer Waschpuffer | ||||
| 14 | 30 Hz, 30 ° | 120 | mischen Puffer waschen und waschen TiO 2 NF - Matte | ||||
| 15 | 2400 | 20 | Entfernen Sie den restlichen Waschpuffer | ||||
| 16 | 5 | Ventil schließen | |||||
| 17 | 2400 | 6 | 10 | offen vAlve und übertragen Sie die Chemilumineszenzsubstrats | |||
| 18 | 30 Hz, 2 & deg; | 60 | mischen Substrat und die Immunreagenzien auf TiO 2 NF - Matte | ||||
| 19 | 2400 | 7 | 10 | Öffnen des Ventils und übertragen das reagierte Substrat auf die Detektionskammer | |||
| Gesamtzeit | ~ 30 min | ||||||
Tabelle 1. Betriebsprogramm für den Immunoassay in einer Disc. Diese Tabelle wurde von Ref geändert. 21.
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Discussion
Der Assay auf TiO 2 NF integrierten Platte eine schnelle, kostengünstige und praktische Technik für die ultrasensitiver Detektion niedriger reichlich vorhandene Proteine in sehr geringen Blutvolumen. Diese Technik hat den Vorteil der Verwendung von kleinen Probenvolumina (10 ul) und ist für die Analyse von mehreren Proben gleichzeitig zugänglich. Dies stellt ein großes Potential als Multiplexing-Immunoassay-Gerät. Die Vorrichtung hat den zusätzlichen Vorteil, dass es nicht Probevorbehandlungsschritte wie Plasmatrennung erforderlich ist, die in herkömmlichen ELISAs erforderlich sind. Darüber hinaus kann das Gerät ganze Immunoassay Verfahren durchführen (zB Mischen, Waschen, Bindung etc.) automatisch aufgrund fertig gestaltete Kammern, Kanäle und Ventile. Zusätzlich verwendet kommerzialisiert Plattenherstellungsverfahren (beispielsweise Spritzgießen, UV / Ultraschall- / Wärmebindung) anstelle von Fräs- und manuelle Montagekleber verwendet wird , kann das gesamte Verfahren von der Vorrichtungsherstellung zu sein Analyseautomatisiert.
Außerdem präsentiert das Transferdruckverfahren hier zeigt eine einfache und einfache Übertragung von elektro NF vom Donorsubstrat zu zielen, indem eine dünne Klebe PDMS-Schicht verwendet wird. Im allgemeinen sind die TiO 2 NFs nach dem Kalzinierungsverfahren erhalten spröde und leicht von dem geerdeten Substrat aufgrund der schwachen Adhäsion abzuschälen. 25 aufgrund seiner charakteristischen Sprödigkeit, die TiO 2 NF Matten mit anderen Vorrichtungen zu integrieren , ist schwierig. Um das zu lösen, wurden viele Verfahren beschrieben worden. Beispielsweise Heißpresse 26 und Lösungsmitteldampf 27 Techniken zeigte die Verbesserung der Haftung zwischen TiO 2 NFs Matte und Targetoberfläche vor dem Kalzinierungsverfahren. Obwohl diese Verfahren die Haftung erhöht wird , waren die TiO 2 NF Matten nicht intakt aufgrund der hohen mechanischen Druck oder das Lösungsmittel in den entsprechenden Techniken aufgebracht. Da ferner der Kalzinierungsschritt Integration des TiO 2 </ Sub> NF Matten mit Hilfe dieser Methoden können nur für eine begrenzte Zieloberflächen angewendet werden.
Nach bestem Wissen ist dies die erste Technik, um die Transferdruck von NF-Matten auf einem Gerät aus thermoplastischen Kunststoffen zu zeigen, die die neuen Eigenschaften der FNs auch nach der Übertragung erhalten bleibt. Für eine bessere Leistung der Vorrichtung, der Herstellung von qualitativ hochwertigen NFS- und Optimierung der Vorhärtung Bedingungen erwünscht. Wie im Protokoll erwähnt, von den Umgebungsbedingungen die erforderliche Zeit zum Vorhärten variieren kann; Deshalb werden vorge Härtungsbedingungen durch die Messung der Haftkraft unter Verwendung eines klebe Test optimiert werden.
Weiterhin stellt das Protokoll hier vorgestellten geschickte Führungen für den vollautomatischen ELISA-Prozess auf einer Scheibe. Das Protokoll stellt nicht nur die Herstellung der Scheibe, sondern auch die Automatisierung aller Prozesse, die für ELISA, einschließlich der Trennung von Vollblut, Dosieren, Mischen, Waschen und Detektion.Jeder Schritt wird mit Umdrehungsgeschwindigkeit, Mischfrequenz optimiert und Betriebszeit. Basierend auf dieser Betriebsanleitung, die auf einer Disk geladen Reagenzien können einen einzigen Motor unter Verwendung übertragen werden. Da das Gerät hervorragende Nachweisempfindlichkeit bei sehr geringen Blutvolumen durchgeführt wird, stellt es ein großes Potenzial für diagnostische Anwendungen von Biomarkern in einem frühen Stadium der Krankheit Screening. Das Gerät würde aktiviert jede Biomarker zu detektieren, abhängig von der Verfügbarkeit der spezifischen Antikörper.
Obwohl die Vorrichtung mit TiO 2 NF Matten hoch Empfindlichkeit aufgrund der großen Oberfläche der Matten verstärkt erreicht einer der verbleibenden Herausforderung dieser Technik , die in der Massenproduktion von einheitlichen NF Matten sein könnte. Weil die Empfindlichkeit des ELISA stark vom Oberflächenbereich der Nanofaser-Matte betroffen ist, ist es wichtig, nicht nur eine große Oberfläche zu erzielen, sondern auch eine reproduzierbare und gleichmäßige Oberfläche in unterschiedlichen Chargen der Massenproduktion. Zusammenfassend haben wir ein einfaches Verfahren gezeigt, um eine spröde NF Matte in eine Funktionsvorrichtung für Ultrasensitive Proteindetektion zu integrieren. Die Vorteile dieses Verfahrens sind wie folgt: 1) , die zuvor elektrogesponnen TiO 2 NFs nur auf leitende und thermisch stabile Oberflächen hergestellt werden können; Hier haben wir gezeigt, dass sie auf jedes Substrat, das nichtleitend und Kunststoffmaterialien übertragen werden können; 2) die TiO 2 NF Matten können Druck standhalten und bleibt stabil während der Waschschritte wegen der hohen Haftkraft von PDMS - Schicht; 3) es stellt eine relativ größere Oberfläche für Biotests; und 4) die Antikörper kovalent an die TiO 2 NFs aufgrund der intakten Oberflächeneigenschaften auf NFs befestigt werden. Diese Technik hat ein großes Potenzial werden für die Integration von Nanofasermaterialien in Geräte für die unterschiedlichsten Anwendungen eingesetzt.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Research Foundation of Korea (NRF) Zuschüsse unterstützt (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), einen Zuschuss von der koreanischen Health Technology R & D-Projekt, das Ministerium für Gesundheit und Soziales (A121994) und IBS-R020-D1 von der koreanischen Regierung finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III - ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
References
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- Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
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- Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , Pan Stanford Publishing. 265-282 (2011).
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