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Bioengineering

पूरी तरह से पूरे रक्त से ultrasensitive प्रोटीन का पता लगाने के लिए स्वचालित केन्द्रापसारक Microfluidic डिवाइस

Published: April 16, 2016 doi: 10.3791/54143
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1,3, 1,4
1Department of Biomedical Engineering, School of Life Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST), UNIST-gil 50, Ulsan, Republic of Korea, 2Agency for Defense Development (ADD), Daejeon, Republic of Korea, 3KOGAS (Korea Gas Corporation) Research Institute, 4Center for Soft and Living Matter, Institute for Basic Science (IBS)

Introduction

रोग निदान के लिए कई प्लेटफार्मों 1,2 ऐसे nanowires, 3 नैनोकणों, 4 नैनोट्यूब, 5 और nanofibers (एनएफएस) 6-8 के रूप में nanoscale सामग्री के आधार पर विकसित किया गया है। इन nanomaterials उनके अद्वितीय भौतिक गुणों के कारण अत्यधिक संवेदनशील bioassays के लिए नई प्रौद्योगिकियों के डिजाइन में उत्कृष्ट संभावनाओं प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, mesoporous जिंक आक्साइड nanofibers स्तन कैंसर बायोमार्कर की Femto-दाढ़ संवेदनशील पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हाल ही में 9, टाइटेनियम डाइऑक्साइड के आधार पर (2 Tio) Bioanalytical आवेदन पत्र 10 के लिए लगाया गया है उनकी रासायनिक स्थिरता पर विचार nanomaterials, 11 नगण्य प्रोटीन विकृतीकरण 12 और biocompatibility। 13 इसके अलावा, 2 Tio की सतह पर हाइड्रॉक्सिल समूहों रासायनिक संशोधन और biomolecules के सहसंयोजक लगाव की सुविधा। 14,15 नमूनों 2 Tio थीn फिल्मों 16 या 2 Tio नैनोट्यूब 17 सतह क्षेत्र को बढ़ाने के द्वारा एक लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए उपयोग किया गया है; हालांकि, निर्माण की प्रक्रिया जटिल है और महंगे उपकरणों की आवश्यकता है। दूसरी ओर, Electrospun एनएफएस सरल और कम लागत के निर्माण की प्रक्रिया के रूप में अपने उच्च सतह क्षेत्र की वजह से ध्यान प्राप्त कर रहे हैं के रूप में अच्छी तरह से, 18,19 अभी तक, Electrospun 2 Tio एनएफ चटाई की कमजोर या ढीला विशेषता इसे संभाल करने के लिए मुश्किल बना देता है और इसलिए microfluidic उपकरणों के साथ एकीकृत। 6,20, 2 Tio एनएफ मैट शायद ही कभी, रसायन अनुप्रयोगों में उपयोग किया गया विशेष रूप से कठोर धोने की स्थिति की आवश्यकता होती है उन।

इस अध्ययन में, इन सीमाओं को पार करने के लिए, हम एक नई तकनीक एक पतली polydimethylsiloxane (PDMS) चिपकने वाली परत का उपयोग करके किसी भी लक्ष्य सब्सट्रेट की सतह पर Electrospun एनएफ मैट स्थानांतरित करने के लिए विकसित किया है। furthermore, हम सफलतापूर्वक पॉली कार्बोनेट (पीसी) से बना एक केन्द्रापसारक microfluidic युक्ति पर Electrospun 2 Tio एनएफ मैट के एकीकरण से पता चला है। इस उपकरण का उपयोग, सी-रिएक्टिव प्रोटीन का एक उच्च संवेदनशील, पूरी तरह से स्वचालित है, और एकीकृत पहचान (सीआरपी) के साथ ही हृदय ट्रोपोनिन मैं (cTnI) संयुक्त के कारण पूरे रक्त का केवल 10 μL से 30 मिनट के भीतर हासिल की थी। 21 एनएफएस और केन्द्रापसारक मंच के गुणों का लाभ, परख परिमाण के छह आदेश की एक व्यापक गतिशील रेंज 1 स्नातकोत्तर / एमएल (~ 8 एफएम) से 100 एनजी / एमएल (~ 0.8 बजे) का पता लगाने की एक निचली सीमा के साथ प्रदर्शन किया 0.8 स्नातकोत्तर / सीआरपी और 37 स्नातकोत्तर / एमएल (~ 1.5 बजे) की एक सीमा का पता लगाने के साथ 100 एनजी / एमएल (~ 4 एनएम) के लिए 10 स्नातकोत्तर / एमएल (~ 0.4 किमी निम्न के बजे) से एक गतिशील रेंज के लिए मिलीलीटर (~ 6 एफएम) के cTnI के लिए। ये पता लगाने सीमा ~ 300 और 20 गुना उनके इसी पारंपरिक एलिसा परिणामों की तुलना में कम है। इस तकनीक को किसी भी लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता उचित एंटीबॉडी के साथ। कुल मिलाकर, इस उपकरण सहULD में इन विट्रो निदान और जैव रासायनिक assays के लिए बहुत योगदान के बाद से यह जैविक नमूने की बहुत छोटी मात्रा से भी महान संवेदनशीलता के साथ लक्ष्य प्रोटीन की मात्रा में दुर्लभ पता लगा सकते हैं, जैसे, पूरे रक्त के 10 μl। हालांकि हम केवल इस अध्ययन में एलिसा का उपयोग कर सीरम प्रोटीन का पता लगाने का प्रदर्शन किया, हस्तांतरण और एकीकरण microfluidic उपकरणों के साथ Electrospun एनएफएस की तकनीक अधिक मोटे तौर पर अन्य जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं जो उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने के लिए एक बड़े क्षेत्र की सतह की आवश्यकता होती है में लागू किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: रक्त स्वस्थ व्यक्तियों से तैयार किया गया था और एक रक्त संग्रह ट्यूब में एकत्र किया गया था। लिखित सूचित सहमति सभी स्वयंसेवकों से प्राप्त हुई थी।

1. 2 Tio एनएफ चटाई का निर्माण

  1. अग्रदूत समाधान 22 की तैयारी
    1. इथेनॉल (99.9%, 3 एमएल) और हिमनदों एसिटिक एसिड (3 एमएल) का एक मिश्रण में टाइटेनियम tetraisopropoxide (TTIP) के 1.5 ग्राम भंग और एक चुंबकीय दोषी पर 30 मिनट के लिए आरटी पर समाधान (25 डिग्री सेल्सियस) मिश्रण।
    2. इथेनॉल (99.9%) की 3.64 ग्राम में polyvinyl pyrrolidone (पीवीपी) के 11 भार% भंग और एक गर्म थाली चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग करते हुए 1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर समाधान हलचल।
    3. गठबंधन और एक गर्म थाली चुंबकीय दोषी पर 4 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर दो समाधान हलचल।
  2. electrospinning
    1. 200 माइक्रोन भीतरी diame की एक स्टेनलेस स्टील सुई से जुड़ा एक सिरिंज में तैयार समाधान लोडआतंकवाद। सवार को हटाने के बाद सिरिंज में समाधान सीधे डालो।
    2. एक सी वफ़र पर 10 मिनट के लिए 0.3 मिलीग्राम / घंटा की एक प्रवाह की दर (2 सेमी x 2 सेमी) एक उच्च डीसी वोल्टेज (15 केवी) पर आधारित एक सब्सट्रेट पर रखा पर लगातार समाधान का परिचय। electrospinning के दौरान, सुई और 10 सेमी करने के लिए आधारित सब्सट्रेट के बीच की दूरी निर्धारित किया है।
  3. एनएफ चटाई के पकाना
    1. एक भट्ठी में एनएफ चटाई की जगह और तापमान उच्च वैक्यूम हालत (5 एक्स 10 -5 Torr) के तहत 3 डिग्री सेल्सियस / मिनट की एक ramping दर के साथ 500 डिग्री सेल्सियस तक वृद्धि हुई है।
    2. 3 घंटे के लिए 500 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर बनाए रखें। भट्ठी में आर टी (25 डिग्री सेल्सियस) के लिए नमूने के तापमान शांत हो जाओ।

2. TiO की एकता 2 एनएफ चटाई एक केन्द्रापसारक Microfluidic डिस्क में

  1. एक डिस्क का निर्माण
    1. 3 डी डिजाइन सॉफ्टवेयर (जैसे, सोल का प्रयोग करेंidWorks या समान) कक्षों, चैनल, या डिस्क के प्रत्येक परत के वाल्व को दर्शाती है। कोड पैदा सॉफ्टवेयर (जैसे, Edgecam या इसी तरह) का उपयोग कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण (सीएनसी) कोड के लिए डिजाइन फ़ाइलों को परिवर्तित। निर्देश के अनुसार सॉफ्टवेयर का उपयोग मैनुअल 23,24 नोट:। ठेठ चैनल इस उपकरण में इस्तेमाल आयाम 1.0 मिमी x 0.3 मिमी (चौड़ाई x गहराई) कर रहे हैं।
    2. (सीएनसी मिलिंग मशीन के संचालन सॉफ्टवेयर खोलें जैसे।, DeskCNC या समान) और ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर के लिए सीएनसी कोड लोड और क्रम में निम्न क्लिक करें: "ऑटो" -> "जी कोड खुला" -> उत्पन्न सीएनसी कोड का चयन करें।
    3. सीएनसी मिलिंग मशीन पर पीसी प्लेट संलग्न करें: शीर्ष स्तर और डिस्क परत के लिए 5 मिमी पीसी प्लेटों के लिए 1 मिमी पीसी प्लेटों का उपयोग करें। सीएनसी मिलिंग मशीन को चलाने के "स्टार्ट" बटन पर क्लिक करके डिस्क के प्रत्येक स्तर में कटौती करने के लिए।
  2. डिस्क पर 2 Tio एनएफ चटाई का स्थानांतरण
    1. एक सिलिकॉन सब्सट्रेट और 40 μL (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) 30 मिनट के लिए वैक्यूम के अंतर्गत एक निर्वात चैम्बर में -1-trichlorosilane युक्त एक छोटा सा पेट्री डिश रखें। fluorosilane वाष्पीकृत और सब्सट्रेट पर लेपित हो जाता है।
    2. 1 के अनुपात और एक निर्वात चैम्बर में देगास: एक 10 में एक इलाज एजेंट के साथ मिक्स polydimethylsiloxane (PDMS) पूर्व बहुलक। स्पिन कोट 60 सेकंड के लिए 650 rpm पर एक सिलिकॉन सब्सट्रेट पर PDMS।
    3. 65 डिग्री सेल्सियस पर PDMS एक ओवन में सिलिकॉन सब्सट्रेट पर लेपित इलाज 10 मिनट के एक पक्षपाती राज्य को प्राप्त करने के लिए।
      नोट: इलाज समय पर्यावरण की स्थिति पर निर्भर करता है अलग किया जा सकता है, और आसंजन बल एक rheometer का उपयोग कर एक कील परीक्षण द्वारा परीक्षण किया जा सकता है।
    4. PDMS लेपित सिलिकॉन एक चिमटी से नोचना का उपयोग करने पर electrospinning और पकाना द्वारा तैयार 2 Tio एनएफ चटाई स्थानांतरण। फिर, स्वयं एक फ्लैट वस्तु के साथ स्थानांतरित 2 Tio एनएफ चटाई पर एक conformal दबाव लागू होते हैं (उदाहरण के लिए।, गिलास स्लाइड) और वस्तु को हटा दें। डाल4 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर या 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में इस नमूने PDMS परत पूरी तरह से इलाज करने के लिए।
    5. 20 μl PDMS / इलाज एजेंट मिश्रण के साथ डिस्क में कोट बाध्यकारी प्रतिक्रिया कक्षों (10: 1), डिस्क पर संलग्न करने के लिए 2 Tio एनएफ चटाई जो एक चिपकने वाला परत के रूप में कार्य करता है।
    6. PDMS परत पर 2 Tio एनएफ चटाई पर इथेनॉल (99.9%) के 50 μl बांटना, 6 मिमी व्यास का एक पंच छेद के साथ एनएफ चटाई में कटौती, और 20 μl के साथ लेपित बाध्यकारी प्रतिक्रिया कक्ष में कटौती 2 Tio एनएफ चटाई हस्तांतरण पिछले चरण में PDMS की।
      नोट: इस चरण में, इथेनॉल सी सब्सट्रेट से कटौती 2 Tio एनएफ चटाई अलग करने के लिए उपयोगी हो जाएगा।
    7. 1 घंटा PDMS पूरी तरह से इलाज करने के लिए 4 घंटे के लिए या 80 डिग्री सेल्सियस पर 65 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में 2 Tio एनएफ चटाई एकीकृत डिस्क सेते हैं।
  3. डिस्क पर 2 Tio एनएफ चटाई की सतह संशोधन
    1. पीइथेनॉल में (3-glycidoxypropyl) methyldiethoxy silane (GPDES) की repare 1% v / v समाधान (99.9%)।
    2. 140 W, 180 सेकंड के लिए 50 SCCM ऑक्सीजन का प्रवाह पर ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ 2 Tio एनएफ चटाई एकीकृत डिस्क समझो। प्रत्येक nanofiber चटाई पर GPDES समाधान के 100 μl बांटना और 2 घंटे के लिए आर टी (25 डिग्री सेल्सियस) पर सेते हैं।
    3. इथेनॉल (99.9%) के वितरण के एक धोने बोतल का उपयोग करके substrates संक्षेप में धो लें, तो डिस्क inverting और एक साफ खिलाफ इसे मिटा सोख्ता द्वारा पूरी तरह से इथेनॉल को हटा दें। 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर इलाज। जैसा कि ऊपर कहा एक ही तरीके से इथेनॉल (99.9%) के साथ दो बार धोएं, शारीरिक रूप से adsorbed और अपार GPDES अणुओं को हटाने के लिए।
    4. एक नाइट्रोजन धारा के साथ सूखी झटका, सूखी वैक्यूम के अंतर्गत।
      नोट: डिस्क उपयोग करें जब तक आर टी (25 डिग्री सेल्सियस) पर एक मोहरबंद कंटेनर में संग्रहित किया जा सकता है।
  4. सतह पर एंटीबॉडी की स्थिरीकरण
    1. कब्जा एंटीबॉडी के 200 माइक्रोग्राम / एमएल के एक समाधान (मोनोक्लोनल माउस विरोधी बनाओमानव hsCRP या मोनोक्लोनल माउस विरोधी cTnI) एक फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) बफर (7.4 पीएच) के साथ एंटीबॉडी गिराए। एक डिस्क में प्रत्येक एनएफ चटाई पर समाधान के लिए एक micropipette का उपयोग के 5 μl बांटना। एंटीबॉडी के बारे में अधिक जानकारी के लिए सामग्री सूची देखें।
    2. एक humidified कक्ष में डिस्क रखें और 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 0.1% बीएसए पीबीएस बफर के साथ लिपटे एनएफ चटाई एंटीबॉडी धो लें। एक micropipette का उपयोग धोने बफर के 100 μl के साथ चैम्बर भरें, श्वास या decanting द्वारा बफर हटा दें। अंत में, डिस्क पलटना और यह दाग के खिलाफ एक साफ साफ है, और फिर डिस्क इकट्ठा।
  5. डिस्क विधानसभा
    1. एक सीएडी कार्यक्रम (जैसे, ऑटोकैड या इसी तरह) का उपयोग डबल साइड चिपकने वाला टेप पर डिस्क के डिजाइन ड्रा। आलेखक काटने के लिए सीएडी डिजाइन लोड।
    2. डबल साइड चिपकने वाला काटने आलेखक का उपयोग करते हुए टेप में कटौती। डबल चिपकने वाला टेप के एक सुरक्षा परत छील और मैं संलग्नडिस्क परत के शीर्ष पर टी। अन्य सुरक्षा परत को छीलकर और डिस्क परत पर परत शीर्ष देते हैं।
    3. दबाव मशीन में प्रारंभिक रूप से इकट्ठे डिस्क लोड और ठीक ऊपर / चिपकने वाला / डिस्क परतें हर परत में संरेखित के निशान का उपयोग कर प्रत्येक वाल्व, चैनल, और कक्षों से कनेक्ट करने के लिए पंक्ति में। दबाने मशीन का उपयोग कर conformal दबाव लागू करें।

3. Immunoassay

  1. एक micropipette का उपयोग 1% BSA पीबीएस बफर के साथ कक्षों भरें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर डिस्क सेते हैं। एक micropipette का उपयोग आकांक्षा से बफर निकालें। संयुक्त राष्ट्र के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की साइटों को ब्लॉक करने के लिए और एक डिस्क में प्रोटीन की गैर विशिष्ट सोखना कम करने के लिए यह कदम प्रदर्शन करना।
  2. भरने और एक micropipette का उपयोग कक्षों aspirating द्वारा 0.1% बीएसए पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
    नोट: इस स्तर पर डिस्क उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  3. एक micropipett का उपयोग कर प्रतिजन नुकीला पूरे रक्त या डिस्क पर सीआरपी का पता लगाने के लिए सीआरपी-मुक्त सीरम का लोड 10 μlई। अंशांकन रेखांकन बनाने के लिए, 100 एनजी / एमएल के लिए 1 स्नातकोत्तर / मिलीलीटर से सीआरपी की सांद्रता का उपयोग करें; और 10 स्नातकोत्तर / मिलीलीटर से cTnI 100 एनजी / एमएल।
    नोट: पूरे रक्त, जो माइक्रोन के रेंज में आमतौर पर है में सीआरपी के उच्च स्तर के कारण, सीआरपी-मुक्त सीरम डिवाइस का पता लगाने सीमा कम प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
  4. 60 सेकंड के लिए 3,600 आरपीएम (391 XG) पर डिस्क स्पिन लाल रक्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए।
  5. खुले वाल्व # 1 लेजर विकिरण से, और हस्तांतरण 3 सेकंड के लिए 2400 rpm पर डिस्क कताई द्वारा एचआरपी के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी का पता लगाने के 8 μl युक्त चैम्बर के लिए सतह पर तैरनेवाला प्लाज्मा के 4 μl।
    नोट:। वाल्व प्रवर्तन और डिस्क ऑपरेशन के दृश्य के लिए सामान्य प्रक्रियाओं पिछले एक रिपोर्ट में विस्तार से वर्णन किया गया हैं 21
  6. प्रोटीन और एंटीबॉडी का पता लगाने की बाइंडिंग के लिए 5 सेकंड के लिए एक मिश्रण मोड (15 हर्ट्ज एस -1, 15 डिग्री) को लागू करें।
  7. ओपन # वाल्व 2, और बाध्यकारी प्रतिक्रिया चैम्बर के लिए 6 चरण में तैयार मिश्रण हस्तांतरण (2,400 आरपीएम, 3 सेकंड)। फिर, मिश्रण और पर 2 Tio एनएफएस बाध्यकारी एंटीबॉडी के बीच एक immunoreaction प्राप्त करने के लिए 20 मिनट के लिए एक मिश्रण मोड (60 हर्ट्ज एस -1, 2 °) लागू होते हैं। प्रतिक्रिया, खुले # 3 वाल्व के बाद और अपशिष्ट कक्ष (2,400 आरपीएम, 10 सेकंड) को अवशिष्ट मिश्रण हस्तांतरण।
  8. वाल्व # 4 खोलने और डिस्क (2,400 आरपीएम, 4 सेकंड) कताई द्वारा धोने बफर (600 μl) बाध्यकारी प्रतिक्रिया कक्ष पर स्थानांतरण। तब कक्ष में 2 Tio एनएफएस धोने के लिए 120 सेकंड के लिए एक मिश्रण मोड (30 हर्ट्ज एस -1, 30 डिग्री) लागू होते हैं।
  9. 3.8 चरण की एक ही शर्त का पालन करते हुए दो बार अधिक से धो लें 2 Tio एनएफएस, और 20 सेकंड के लिए 2400 rpm पर डिस्क कताई द्वारा पूरी तरह से अवशिष्ट धोने बफर हटा दें। फिर, वाल्व # 5 को बंद करें।
  10. Chemiluminescent प्रतिक्रिया के लिए, वाल्व # 6 और कताई खोलने से बाध्यकारी प्रतिक्रिया चैम्बर के लिए chemiluminescent सब्सट्रेट समाधान स्थानांतरित होने के बाद 1 मिनट के लिए एक मिश्रण मोड (30 हर्ट्ज एस -1, 2 °) लागू10 सेकंड के बाद के लिए 2400 rpm पर डिस्क।
  11. वाल्व # 7 खोलने और 10 सेकंड के लिए 2400 rpm पर डिस्क कताई द्वारा पता लगाने के कक्षों के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त सब्सट्रेट समाधान स्थानांतरण।
  12. उपाय प्रतिक्रिया व्यक्त की सब्सट्रेट समाधान के लिए एक photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) मॉड्यूल सुसज्जित पहचान प्रणाली का उपयोग करने से chemiluminescence का संकेत है।
    नोट: चरण मोटर, optomechanical घटकों, अनुवाद चरणों, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीएमटी: का पता लगाने प्रणाली निम्नलिखित भागों का उपयोग कर एक कस्टम निर्मित मशीन है। optomechanical भागों और कदम मोटर डिवाइस धारण करने के लिए इकट्ठा कर रहे हैं, और मोटर डिस्क घुमा सकते हैं। पता लगाने optomechanical भागों पर तय पीएमटी द्वारा किया जाता है, और यह डिवाइस का पता लगाने के कक्षों के ऊपर स्थित है। कदम मोटर से छेड़छाड़, पता लगाने कक्षों सही पीएमटी का पता लगाने के क्षेत्र के नीचे से जुड़ रहे हैं।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल, पूरे रक्त के साथ उच्च संवेदनशीलता से तैयार किया गया था प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित केन्द्रापसारक microfluidic युक्ति का उपयोग करना। 2 Tio एनएफ मैट electrospinning और पकाना की प्रक्रियाओं द्वारा तैयार किए गए थे। क्रम में वांछित व्यास, आकृति विज्ञान, और मोटाई की एनएफएस निर्माण करने के लिए, इस तरह के प्रवाह की दर, वोल्टेज, और कताई समय के रूप में की स्थिति electrospinning में अनुकूलित किया गया। जब स्थिति अनुकूल नहीं थे, एनएफएस का गठन की गुणवत्ता खराब हो गया था। विशेष रूप से, एनएफएस कम वोल्टेज (5 केवी) में बहुलक समाधान से बाहर काता नहीं थे, और जब वोल्टेज उच्च था टूट गए थे (> 20 केवी)। इसी तरह, कताई समय उचित घनत्व, बहुत विरल नहीं (1 मिनट) या बहुत घने (30 मिनट) के साथ एनएफएस के निर्माण के लिए महत्वपूर्ण था। इसके अलावा, उच्च प्रवाह दरों की वजह से मनका गठन से बचने के लिए, प्रवाह की दर में हेरफेर किया गया था। तो, 15 केवी के एक आवेदन वोल्टेज, 10 मिनट electrospinning समय और 0.3 मिलीलीटर मानव संसाधन के प्रवाह की दर (चित्रा 1) के आधार पर एनएफ निर्माण के लिए इष्टतम स्थितियों के रूप में इस्तेमाल किया गया।

2 Tio एनएफ चटाई सफलतापूर्वक एक चिपकने वाला PDMS परत है, जो एक silanized सिलिकॉन सब्सट्रेट और 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में यह पूर्व के इलाज पर स्पिन कोटिंग PDMS द्वारा तैयार किया गया था का उपयोग कर लक्ष्य सब्सट्रेट पर स्थानांतरित किया गया था। PDMS परत पूर्व के इलाज के लिए समय आसंजन बल की जाँच, एक कील परीक्षण (2A चित्रा) का उपयोग करके अनुकूलित किया गया था। चित्रा 2 बी nanofiber लगाव पर इलाज समय के प्रभाव को दर्शाता है। अगर PDMS 3 मिनट के लिए गर्म था, वहाँ कोई आसंजन ताकत के रूप में अभी भी PDMS uncured था और एक तरल के रूप में बनी हुई है और एनएफएस PDMS परत में एम्बेडेड हो गया है। जब यह 30 मिनट के लिए गरम किया जाता है, आसंजन बल बहुत कमजोर के रूप में PDMS कड़ा हो जाता है और उसके चिपचिपा संपत्ति खो देता है और एनएफएस उस पर संलग्न नहीं किया गया है। PDMS के लिए गर्म था जबआर 10 मिनट, PDMS मजबूत आसंजन बल दिखाया और एनएफएस दृढ़ता से जुड़े थे। परिणामों से यह निष्कर्ष निकाला गया है कि मजबूत लगाव के लिए पूर्व के इलाज PDMS के लिए इष्टतम समय 10 मिनट है।

डिस्क विधानसभा के बाद, प्रतिरक्षा डिस्क ऑपरेशन प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला के बाद 1 टेबल में सूचीबद्ध रूप से 2 Tio एनएफ चटाई एकीकृत डिस्क पर आयोजित किया गया। अज्ञात नमूनों में सीआरपी और cTnI सांद्रता के निर्धारण के लिए, प्रत्येक के लिए अंशांकन रेखांकन साजिश रचने के द्वारा किए गए थे रिश्तेदार प्रकाश इकाइयों (RLU) सीआरपी या cTnI एकाग्रता बनाम (चित्रा 3)। चित्रा 3 ए और 3 बी में, पर डिस्क परख परिणाम सीआरपी और cTnI क्रमशः के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली पर पारंपरिक एलिसा के साथ तुलना की गई। assays एक डिस्क पर 0.8 स्नातकोत्तर / cTnI के लिए सीआरपी के लिए मिलीलीटर (~ 6 एफएम) और 37 स्नातकोत्तर / एमएल (1.5 बजे) की एक सीमा का पता लगाने, के साथ एक व्यापक रेखीय गतिशील रेंज का प्रदर्शन किया जोसीआरपी के लिए लगभग 300 गुना ज्यादा है और उनके संबंधित पारंपरिक एलिसा परिणाम (; 824 स्नातकोत्तर / एमएल, cTnI के लिए 32 बजे 286 स्नातकोत्तर / एमएल, सीआरपी के लिए 2.3 बजे) की तुलना में cTnI के लिए 20 गुना अधिक है।

आकृति 1

चित्रा 1. electrospinning शर्तों का अनुकूलन। हर हालत में SEM छवियों का गठन एनएफएस की आकृति विज्ञान दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा चिपकने वाला PDMS परत और स्थानांतरित 2 Tio एनएफ चटाई के SEM छवियों की 2. हमले परीक्षण। (ए) चिपकने के आसंजन बलPDMS परत, समय के कई लंबाई, (बी) के समय के विभिन्न लंबाई के लिए ठीक PDMS पर संलग्न nanofibers के SEM छवियों के लिए पूर्व ठीक हो। यह आंकड़ा रेफरी से संशोधित किया गया है। 21. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. सीआरपी और cTnI का पता लगाने के लिए प्रयोगशाला पर एक-डिस्क और 96 अच्छी तरह से थाली प्रयोग करने के लिए कैलिब्रेशन रेखांकन। सीआरपी की जांच सीआरपी-मुक्त सीरम (ए) में नुकीला और cTnI पूरे रक्त (बी) में नुकीला आयोजित की गई। त्रुटि सलाखों में कम से कम तीन स्वतंत्र माप के मानक विचलन का संकेत मिलता है। (लोद) पता लगाने की सीमा नकारात्मक नियंत्रण डेटा के मानक विचलन cTnI के लिए spiking बिना सीआरपी-मुक्त सीरम या पूरे रक्त के साथ मापा का 3 गुना द्वारा गणना की गईसीआरपी और cTnI, क्रमशः। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

स्पिन नहीं। गति (आरपीएम) वाल्व नहीं। समय (सेकंड) ऑपरेशन
1 3600 60 रक्त जुदाई
2 2400 1 3 खुले वाल्व एचआरपी के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी का पता लगाने के 8 μl युक्त कक्ष में प्लाज्मा हस्तांतरण करने के लिए
3 15 हर्ट्ज, 15 ° 5 मिश्रण प्लाज्मा और पता लगाने के एंटीबॉडी
4 </ Td> 2400 2 3 खुले वाल्व बाध्यकारी प्रतिक्रिया कक्ष में मिश्रण हस्तांतरण करने के लिए
5 60 हर्ट्ज, 2 ° 1,200 2 Tio एनएफ चटाई और प्लाज्मा का पता लगाने के एंटीबॉडी मिश्रण पर कब्जा एंटीबॉडी मिश्रण
6 2400 3 10 खुले वाल्व मिश्रण को हटाने के लिए
7 2400 4 4 खुले वाल्व धोने बफर हस्तांतरण करने के लिए
8 30 हर्ट्ज, 30 डिग्री 120 कपड़े धोने बफर मिश्रण और धोने के 2 Tio एनएफ चटाई
9 2400 4 हस्तांतरण धोने बफर
10 30 हर्ट्ज, 30 डिग्री 120 2 Tio एनएफ चटाई
1 1 2400 4 हस्तांतरण धोने बफर
12 30 हर्ट्ज, 30 डिग्री 120 कपड़े धोने बफर मिश्रण और धोने के 2 Tio एनएफ चटाई
13 2400 4 हस्तांतरण धोने बफर
14 30 हर्ट्ज, 30 डिग्री 120 कपड़े धोने बफर मिश्रण और धोने के 2 Tio एनएफ चटाई
15 2400 20 शेष धोने बफर हटा दें
16 5 बंद वाल्व
17 2400 6 10 खुली वीalve और chemiluminescent सब्सट्रेट हस्तांतरण
18 30 हर्ट्ज, 2 ° 60 मिश्रण सब्सट्रेट और 2 Tio एनएफ चटाई पर immunoreagents
19 2400 7 10 वाल्व खोलने और पता लगाने के चैम्बर के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की सब्सट्रेट हस्तांतरण
कुल समय ~ 30 मिनट

तालिका 1. एक डिस्क में प्रतिरक्षा के लिए ऑपरेशन कार्यक्रम। इस तालिका रेफरी से संशोधित किया गया है। 21।

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Discussion

2 Tio एनएफ एकीकृत डिस्क पर परख कम प्रचुर मात्रा में रक्त की बहुत कम मात्रा में मौजूद प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक ultrasensitive, तेजी से सस्ती और सुविधाजनक तकनीक है। इस तकनीक छोटा सा नमूना मात्रा (10 μl) का उपयोग करने का लाभ दिया है और एक साथ कई नमूनों के विश्लेषण के लिए उत्तरदायी है। यह एक बहुसंकेतन प्रतिरक्षा डिवाइस के रूप में एक महान क्षमता प्रदान करता है। डिवाइस अतिरिक्त लाभ यह है कि यह प्लाज्मा जुदाई, जो पारंपरिक ELISAs में आवश्यक हैं जैसे नमूना pretreatment कदम की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, इस उपकरण पूरे प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं (जैसे, मिश्रण, कपड़े धोने, बंधन आदि) स्वचालित रूप से पूर्व डिजाइन कक्षों, चैनल, और वाल्व के कारण प्रदर्शन कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, commercialized डिस्क निर्माण विधियों का उपयोग कर चिपकने का उपयोग कर (जैसे, इंजेक्शन मोल्डिंग, यूवी / अल्ट्रासोनिक / थर्मल संबंध) मिलिंग और मैनुअल विधानसभा के बजाय, विश्लेषण करने के लिए उपकरण निर्माण से पूरी प्रक्रिया हो सकती हैस्वचालित।

इसके अलावा, स्थानांतरण-मुद्रण विधि यहाँ प्रस्तुत एक सरल और आसान एक पतली चिपकने वाला PDMS परत का उपयोग करके सब्सट्रेट को लक्षित करने के दाता से Electrospun एनएफ के हस्तांतरण से पता चलता है। सामान्य में, 2 Tio एनएफएस पकाना प्रक्रिया के बाद प्राप्त भंगुर होते हैं और आसानी से अपनी विशेषता भंगुरता के कारण कमजोर आसंजन के कारण जमीन सब्सट्रेट से दूर छील। 25, अन्य उपकरणों के साथ 2 Tio एनएफ मैट को एकीकृत मुश्किल है। इस को हल करने के लिए, कई तरीकों की जानकारी मिली है। उदाहरण के लिए, गर्म प्रेस से 26 और विलायक वाष्प 27 तकनीक पकाना प्रक्रिया से पहले 2 Tio एनएफएस चटाई और लक्ष्य की सतह के बीच आसंजन की वृद्धि देखी गई। हालांकि इन तरीकों आसंजन वृद्धि हुई है, 2 Tio एनएफ मैट उच्च यांत्रिक दबाव की वजह से बरकरार नहीं थे या विलायक संबंधित तकनीकों के दौरान लागू किया। इसके अलावा, पकाना कदम की वजह से, 2 Tio के एकीकरण </ उप> इन तरीकों का उपयोग एनएफ मैट केवल सीमित लक्ष्य सतहों के लिए लागू किया जा सकता है।

हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, यह एक डिवाइस thermoplastics से बना है पर एनएफ मैट के हस्तांतरण मुद्रण दिखाने के लिए स्थानांतरण के बाद भी एनएफएस के उपन्यास गुण को बनाए रखना पहली तकनीक है। डिवाइस के बेहतर प्रदर्शन के लिए, उच्च गुणवत्ता वाले एनएफएस के निर्माण और पूर्व इलाज की स्थिति के अनुकूलन वांछित हैं। जैसा कि प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, समय पूर्व इलाज पर्यावरण की स्थिति के आधार पर भिन्न हो सकती है के लिए आवश्यक; इसलिए, पूर्व इलाज की स्थिति आसंजन बल को मापने के एक कील-परीक्षण का उपयोग करके अनुकूलित किया जाना है।

इसके अलावा, प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत किया, एक डिस्क पर पूरी तरह से स्वचालित एलिसा प्रक्रिया के लिए कुशल गाइड प्रदान करता है। प्रोटोकॉल डिस्क का केवल निर्माण, लेकिन यह भी पूरे रक्त की जुदाई, पैमाइश, मिश्रण, कपड़े धोने और पता लगाने सहित एलिसा के लिए आवश्यक सभी प्रक्रियाओं के स्वचालन नहीं परिचय।हर कदम स्पिन गति, मिश्रण आवृत्ति, और ऑपरेशन के समय के साथ अनुकूलित है। इस ऑपरेशन गाइड के आधार पर, अभिकर्मकों एक डिस्क पर लोड एक भी मोटर के उपयोग के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है। डिवाइस खून की बहुत कम मात्रा के साथ उत्कृष्ट प्रदर्शन किया संवेदनशीलता का पता लगाने के बाद से, यह रोग का एक प्रारंभिक चरण में बायोमार्कर स्क्रीनिंग द्वारा नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए एक महान क्षमता प्रदान करता है। डिवाइस अपने विशिष्ट एंटीबॉडी की उपलब्धता के आधार पर किसी भी बायोमार्कर का पता लगाने में सक्षम हो जाएगा।

2 Tio एनएफ मैट के साथ डिवाइस अत्यधिक मैट के बड़े क्षेत्र की सतह के कारण संवेदनशीलता बढ़ाया हासिल हालांकि, इस तकनीक के शेष चुनौती से एक वर्दी एनएफ मैट के बड़े पैमाने पर उत्पादन में हो सकता है। क्योंकि एलिसा की संवेदनशीलता को दृढ़ता से nanofiber चटाई की सतह क्षेत्र से प्रभावित होता है, यह न केवल एक उच्च सतह क्षेत्र, लेकिन यह भी बड़े पैमाने पर उत्पादन के विभिन्न बैचों में एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और वर्दी सतह क्षेत्र को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। अंत में, हम ultrasensitive प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक कार्यात्मक डिवाइस में एक भंगुर एनएफ चटाई एकीकृत करने के लिए एक सरल विधि से पता चला है। इस पद्धति का लाभ इस प्रकार हैं: 1) पहले से Electrospun 2 Tio एनएफएस केवल प्रवाहकीय और thermally स्थिर सतहों पर तैयार किया जा सकता है; यहाँ, हम पता चला है कि वे गैर प्रवाहकीय और प्लास्टिक की सामग्री सहित किसी भी सब्सट्रेट पर स्थानांतरित किया जा सकता है; 2) 2 Tio एनएफ मैट दबाव को झेलने और PDMS परत के उच्च आसंजन बल के कारण कदम धोने के दौरान स्थिर रह सकता है; 3) यह bioassays के लिए एक अपेक्षाकृत उच्च सतह क्षेत्र प्रदान करता है; और 4) एंटीबॉडी covalently एनएफएस पर बरकरार सतह के गुणों के कारण 2 Tio एनएफएस के साथ संलग्न किया जा सकता है। इस तकनीक को महान क्षमता विविध अनुप्रयोगों के लिए उपकरणों में nanofibrous सामग्री के एकीकरण के लिए इस्तेमाल किया जाना है।

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Acknowledgments

इस काम कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) अनुदान (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), कोरियाई स्वास्थ्य प्रौद्योगिकी अनुसंधान एवं विकास परियोजना, स्वास्थ्य और कल्याण (A121994) और IBS-R020-डी 1 मंत्रालय से अनुदान कोरियाई सरकार द्वारा वित्त पोषित द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Si wafer LG SILTRON Polished Wafer, test grade Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700
Polycarbonate (PC)  Daedong Plastic PCS#6900 Thickness (mm) = 1 and 5 
Titanium tetraisopropoxide, 98%, Sigma-Aldrich 205273
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 Sigma-Aldrich 437190
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099
Anhydrous ethanol Sigma-Aldrich 459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane Sigma-Aldrich 448931
PDMS and curing agent Dow Corning SYLGARD 184
GPDES Gelest Inc SIG5832.0 
Ethanol J T Baker
FE-SEM FEI Nova NanoSEM
X-ray photoelectron spectroscopy ThermoFisher K-alpha
3D modeling machine M&I CNC Lab, Korea CNC milling machine
Wax-dispensing machine Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea Customized
Double-sided adhesive tape FLEXcon, USA DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
Cutting plotter Graphtec Corporation, Japan Graphtec CE3000-60 MK2
Spin coater MIDAS SPIN-3000D
Furnace (calcination) R. D. WEBB COMPANY WEBB 99
Rheometer (Tack test) Thermo Scientific Haake MARS III - ORM Package
Oxygen plasma system FEMTO CUTE
Monoclonal mouse antihuman hsCRP Hytest Ltd., Finland 4C28 (clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnI Hytest Ltd., Finland 4T21 (clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP Abcam plc., MA ab19175
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI Abcam plc., MA ab24460 (clone # 16A11)
hsCRP Abcam plc., MA ab111647
cTnI Fitzgerald, MA 30-AT43
Bovine Albumin Sigma-Aldrich A7906
PBS Amresco Inc E404
Blood collection tubes BD vacutainer 367844 K2 EDTA 7.2 mg plus blood
collection tubes
SuperSignal ELISA femto Invitrogen 37074
Modular multilabel plate reader Perkin Elmer Envision 2104
Disc operating machine Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea Customized
Photomultiplier tube (PMT) Hamamatsu Photonics H1189-210
AutoCAD AutoDesk Version 2012 Design software
SolidWorks 3D CAD software  SOLIDWORKS Corp. Version 2013 3D Design software,
Edgecam Vero software version 2009.01.06928 Code generating software
DeskCNC Carken Co. version 2.0.2.18 CNC milling machine software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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जैव अभियांत्रिकी अंक 110 लैब-ऑन-ए-डिस्क electrospinning TiO प्रतिरक्षा पूर्ण स्वचालन स्थानांतरण मुद्रण पर-डिस्क का पता लगाने कम मात्रा परख पूरे रक्त ultrasensitive
पूरी तरह से पूरे रक्त से ultrasensitive प्रोटीन का पता लगाने के लिए स्वचालित केन्द्रापसारक Microfluidic डिवाइस
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Park, Y. S., Sunkara, V., Kim, Y., Lee, W. S., Han, J. R., Cho, Y. K. Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood. J. Vis. Exp. (110), e54143, doi:10.3791/54143 (2016).

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