Introduction
Várias plataformas para o diagnóstico da doença foram desenvolvidos com base em materiais em nanoescala 1,2 tais como nanofios, 3 nanopartículas, nanotubos de 4, 5 e nanofibras (NFS) 6-8. Estes nanomateriais oferecem excelentes perspectivas na concepção de novas tecnologias para bioensaios altamente sensíveis devido às suas propriedades físico-químicas únicas. Por exemplo, nanofibras de óxido de zinco mesoporosa têm sido utilizados para a detecção sensível de femto-molar de biomarcadores de cancro da mama. 9 Recentemente, os nanomateriais à base de dióxido de titânio (TiO 2) têm sido exploradas para aplicações bioanaliticas 10 considerando-se a sua estabilidade química, 11 desnaturação de proteínas negligenciável , 12 e biocompatibilidade. 13 Além disso, os grupos hidroxilo na superfície de TiO2 facilitar a modificação química e a ligação covalente de biomoléculas. modelado 14,15 TiO 2 thin películas 16 ou 17 TiO 2 nanotubos têm sido utilizados para aumentar a sensibilidade de detecção de uma proteína-alvo, aumentando a área de superfície; No entanto, o processo de fabricação é bastante complexo e requer um equipamento caro. Por outro lado, as FN electrospun estão a receber atenção devido à sua elevada área de superfície, bem como processo de fabrico simples e de baixo custo; 18,19 ainda, a característica frágil ou solto da esteira electrospun TiO 2 NF torna difícil de manusear e integrar com dispositivos microfluídicos. 6,20 Portanto, os TiO 2 esteiras NF raramente foram utilizados em aplicações bioanalíticos, particularmente aquelas que requerem condições de lavagem agressivos.
Neste estudo, para ultrapassar estas limitações, desenvolvemos uma nova tecnologia para a transferência do electrospun NF esteiras sobre a superfície de qualquer substrato alvo, utilizando uma camada de adesivo fina polidimetilsiloxano (PDMS). Furthermore, que demonstraram com sucesso a integração de electrospun TiO 2 NF esteiras para um dispositivo de microfluidos centrífuga de policarbonato (PC). Usando este dispositivo, uma detecção sensível de alta, totalmente automatizada e integrada de proteína C-reactiva (CRP), bem como a troponina I cardíaca (TIc) foi alcançada em 30 min a partir de apenas 10 ul de sangue total. 21 Devido ao combinado vantagens das propriedades da FN e a plataforma de centrífuga, o ensaio apresentava uma vasta gama dinâmica de seis ordens de grandeza a partir de 1 pg / ml (~ 8 fm) a 100 ng / ml (~ 0,8 pM) com um limite de detecção inferior de 0,8 pg / ml (~ 6 fm) para PCR e uma faixa dinâmica de 10 pg / ml (~ 0,4 pM) e 100 ng / ml (~ 4 nM) com um limite de detecção de 37 pg / ml (~ 1,5 pM) para cTnI. Estes limites de detecção são ~ 300 e ~ 20 vezes mais baixa em comparação com os seus correspondentes resultados de ELISA convencionais. Esta técnica pode ser aplicada para a detecção de quaisquer proteínas alvo, com anticorpos apropriados. No geral, este co dispositivould contribuir grandemente para diagnóstico in-vitro e ensaios bioquímicos uma vez que pode detectar quantidades raros de proteínas-alvo com grande sensibilidade mesmo a partir de quantidades muito pequenas de amostras biológicas, por exemplo, 10 ml de sangue total. Embora apenas se demonstrou a detecção de proteína de soro utilizando ELISA no presente estudo, a tecnologia de transferência e integração de electrospun FN com dispositivos de microfluidos pode ser mais amplamente aplicado em outras reacções bioquímicas que requerem uma grande área de superfície para detecção de alta sensibilidade.
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Protocol
NOTA: O sangue foi coletado de indivíduos saudáveis e foi recolhido em um tubo de coleta de sangue. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os voluntários.
1. Fabricação de TiO 2 NF Mat
- Preparação da solução precursora de 22
- Dissolve-se 1,5 g de tetra-isopropóxido de titânio (TTIP) numa mistura de etanol (99,9%, 3 ml) e ácido acético glacial (3 ml) e misturar a solução à TA (25 ° C) durante 30 minutos num agitador magnético.
- Dissolve-se 11% em peso de polivinil-pirrolidona (PVP) em 3,64 g de etanol (99,9%) e agita-se a solução a 65 ° C durante 1 hora utilizando um agitador magnético da placa quente.
- Combinar e agita-se as duas soluções a 65 ° C durante 4 horas num agitador magnético da placa quente.
- electrospinning
- Carregar a solução preparada para uma seringa ligada a uma agulha de aço inoxidável de 200 um Diame internater. Verter a solução directamente para a seringa após a remoção do êmbolo.
- Introduzir a solução constantemente a uma taxa de fluxo de 0,3 mL / h durante 10 min numa bolacha de Si (2 cm x 2 cm) colocado sobre um substrato ligado à terra a uma tensão CC elevada (15 kV). Durante o electrospinning, defina a distância entre a agulha e o substrato ligado à terra a 10 cm.
- Calcinação do tapete NF
- Coloque a esteira NF num forno e aumentar a temperatura até 500 ° C com uma taxa de rampa de 3 ° C / min sob condições de alto vácuo (5 x 10 -5 torr).
- Manter a temperatura a 500 ° C durante 3 h. Arrefecer a temperatura das amostras para a TA (25 ° C) no forno.
2. Integração de TiO 2 NF Mat em uma centrífuga Microfluidic Disc
- A fabricação de um disco
- Use o software design 3D (por exemplo, SolidWorks ou semelhante) para descrever câmaras, canais, ou válvulas de cada camada de disco. Converter os arquivos de design para código de computador controle numérico (CNC), utilizando software de código geração (por exemplo, Edgecam ou similar). Use os softwares de acordo com o manual de instruções 23,24. Nota: As dimensões do canal típicos usados neste aparelho são 1,0 mm x 0,3 mm (largura x profundidade).
- Abra o software operacional de fresadora CNC (ex., DeskCNC ou similar) e carregar código CNC para o software operacional e clique na seguinte em ordem: "AUTO" -> "G CÓDIGO ABERTO" -> Selecione o código CNC gerado.
- Fixar a placa de PC na máquina de fresagem CNC: use 1 placas mm PC para a camada superior e placas de PC 5 mm para a camada de disco. Execute o fresadora CNC para cortar cada camada do disco clicando no botão "Iniciar".
- Transferência de TiO 2 esteira NF no disco
- Coloque um substrato de silício e uma pequena placa de petri contendo 40 mL de (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-triclorossilano numa câmara de vácuo sob vácuo durante 30 min. O fluorosilane vaporiza e é revestida sobre o substrato.
- Mistura de polidimetilsiloxano (PDMS) pré-polímero com um agente de cura numa proporção de 10: 1 e desgaseificar, em uma câmara de vácuo. Spin-revestimento PDMS num substrato de silício a 650 rpm durante 60 seg.
- Curar o PDMS revestido sobre substratos de silício num forno a 65 ° C durante 10 min para atingir um estado aderente.
NOTA: tempo de cura pode variar dependendo das condições ambientais, e uma força de adesão pode ser testada por um teste de aderência utilizando um reómetro. - Transferir a esteira de TiO 2 NF preparado por electrospinning a calcinação e para o silício PDMS-revestidos usando uma pinça. Em seguida, aplicar manualmente uma pressão conformada na TiO 2 mat NF transferida com um objecto plano (por exemplo., Lâmina de vidro) e remover o objeto. Colocaresta amostra no forno a 65 ° C durante 4 horas ou a 80 ° C durante 1 hora para curar a camada de PDMS completamente.
- O revestimento câmaras de reacção de ligação do disco com 20 ul do PDMS / mistura de agente de cura (10: 1), que actua como uma camada adesiva para prender o TiO 2 esteira NF no disco.
- Pipetar 50 ul de etanol (99,9%) sobre a esteira de TiO 2 NF sobre a camada de PDMS, cortar o tapete NF com um furador de diâmetro de 6 mm, e transferir o corte de TiO 2 NF esteira para as câmaras de reacção de ligação revestidas com 20 ul de o PDMS no passo anterior.
NOTA: Nesta etapa, o etanol será útil para separar o tapete de corte TiO 2 NF a partir do substrato de Si. - Incubar o TiO 2 esteira NF disco integrada no forno a 65 ° C durante 4 horas ou a 80 ° C durante 1 hora para curar completamente o PDMS.
- A modificação da superfície do tapete de TiO 2 NF no disco
- Prepare 1% v / v de solução de (3-glicidoxipropil) silano methyldiethoxy (GPDES) em etanol (99,9%).
- Trate o disco integrada TiO 2 mat NF com plasma de oxigênio a 140 W, fluxo de oxigênio de 50 sccm para 180 seg. Pipetar 100 l de solução GPDES em cada esteira de nanofibras e incubar à TA (25 ° C) durante 2 horas.
- Lave a substratos brevemente dispensando etanol (99,9%), utilizando um frasco de lavagem, em seguida, remover o etanol completamente invertendo o disco e apagando-o contra uma limpeza wipe. Cura a 80 ° C durante 1 h. Lavar duas vezes com etanol (99,9%) do mesmo modo como indicado acima, para remover as moléculas GPDES fisicamente adsorvida e não ligados.
- Secagem com uma corrente de azoto, seco sob vácuo.
NOTA: O disco pode ser armazenado num contentor selado à TA (25 ° C) até à utilização.
- A imobilização de anticorpos sobre a superfície
- Adicione uma solução de 200 ug / ml de anticorpos de captura (anticorpo monoclonal de ratinho antiO hsCRP humano ou monoclonal de ratinho anti-TIc) diluindo os anticorpos com um tampão de fosfato salino tamponado (PBS) (pH 7,4). Pipetar 5 ul da solução em cada esteira NF num disco utilizando uma micropipeta. Veja a lista de materiais para mais informações sobre os anticorpos.
- Manter os discos numa câmara humidif içada e incubar a 37 ° C durante 4 h. Lavar os anticorpos revestidos NF esteira com 0,1% de tampão de BSA-PBS. Encher a câmara com 100 ul de tampão de lavagem, utilizando uma micropipeta, remover o tampão por aspiração ou decantação. Finalmente, inverter o disco e apagá-lo contra um limpa limpe, e em seguida, montar o disco.
- conjunto de disco
- Desenhar a concepção do disco na fita adesiva de lado duplo utilizando um programa de CAD (por exemplo, AutoCAD ou semelhante). Coloque o desenho CAD para o plotter de corte.
- Cortar a fita adesiva dupla-face usando o plotter de corte. Descolar uma camada de proteção de fita adesiva dupla e anexar iT na parte superior da camada do disco. Retire a outra camada de proteção e anexar a camada superior na camada de disco.
- Coloque o disco preliminarmente montado na máquina de prensagem e alinhar precisamente camadas superior / adesivo / disco utilizando marcas de alinhamento em cada camada para conectar cada válvula, canal e câmaras. Aplique pressão conformada de usar a máquina de prensagem.
3. Imunoensaio
- Encha as câmaras com 1% BSA-PBS utilizando uma micropipeta e a incubação do disco de a 37 ° C durante 1 h. Remover o tampão por aspiração usando uma micropipeta. Executar esta etapa para bloquear os locais de reaco na ONU e para reduzir a adsorção não específica da proteína em um disco.
- Lavar duas vezes com 0,1% de BSA-PBS através de enchimento e as câmaras de aspiração utilizando uma micropipeta.
NOTA: Nesta fase, o disco pode ser armazenado a 4 ° C até à sua utilização. - Carga de 10 mL de sangue total cravado-antigénio ou soro livre de PCR para a detecção de CRP no disco usando um micropipette. Para fazer as curvas de calibração, usar concentrações de PCR a partir de 1 pg / ml a 100 ng / ml; e TIc a partir de 10 pg / ml a 100 ng / ml.
NOTA: Devido aos níveis mais elevados de PCR no sangue total, que é geralmente na gama uM, soro livre de PCR foi utilizado para demonstrar o limite inferior de detecção do dispositivo. - Girar o disco a 3.600 rpm (391 xg) durante 60 segundos para separar as células vermelhas do sangue.
- Abrir a válvula de # 1 a irradiação por laser, e a transferência de 4 ul do sobrenadante de plasma para a câmara que contém 8 ul de detecção de anticorpos conjugados com HRP pelo girar o disco a 2.400 rpm durante 3 seg.
NOTA:. Os processos gerais para a actuação da válvula e visualização de utilização de discos estão descritos em detalhe em um relatório anterior 21 - Aplicar um modo de mistura (15 Hz s -1, 15 ° C) durante 5 seg para a ligação dos anticorpos de proteína e detecção.
- Abrir a válvula # 2, e transferir a mistura preparada no passo 6 para a câmara de reacção de ligação (2400 rpm, Três segundos). Em seguida, aplicar um modo de mistura (60 Hz s -1, 2 ° C) durante 20 min para conseguir uma imunorreacção entre a mistura e a anticorpos que se ligam sobre os TiO 2 FN. Após a reacção, a válvula aberta # 3 e transferir a mistura residual para a câmara de resíduo (2.400 rpm, 10 segundos).
- Transferir o tampão de lavagem (600 ul) para a câmara de reacção de ligação através da abertura de válvula de saída 4 e girando o disco (2400 rpm, 4 segundos). Em seguida, aplicar um modo de mistura (30 Hz s -1, 30 °), durante 120 segundos para lavar os TiO2 NFs na câmara.
- Lave as TiO 2 FN mais duas vezes, seguindo mesma condição do passo 3.8, e remova o tampão de lavagem residual completamente girando o disco a 2.400 rpm por 20 s. Em seguida, fechar a válvula # 5.
- Para a reacção quimioluminescente, aplicar um modo de mistura (30 Hz s -1, 2 ° C) durante 1 minuto após a transferência da solução de substrato quimioluminescente para a câmara de reacção de ligação através da abertura de válvula # 6 e fiaçãoo disco a 2.400 rpm durante 10 segundos, subsequentemente.
- Transferir a solução de substrato reagido para as câmaras de detecção através da abertura da válvula 7 e girar o disco a 2.400 rpm durante 10 seg.
- Medir os sinais de quimioluminescência da solução de substrato reagido utilizando um tubo fotomultiplicador (PMT) módulo de sistema de detecção equipada.
NOTA: O sistema de detecção é uma máquina de costume construído utilizando os seguintes componentes: motor de etapa, componentes optomechanical, estágios de tradução e PMT disponível no mercado. As partes e optomechanical motor passo a passo são montados para conter o dispositivo, e o motor pode girar o disco. A detecção é realizada por PMT fixos nas partes optomechanical, e que está localizada acima das câmaras de detecção do dispositivo. Ao manipular o motor de passo, as câmaras de detecção estão alinhadas logo abaixo da zona de detecção de PMT.
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Representative Results
Usando este protocolo, um dispositivo de microfluidos centrífuga totalmente automatizado para a detecção de proteína a partir de sangue inteiro com elevada sensibilidade foi preparado. As esteiras de TiO 2 NF foram preparados por processos de electrospinning e calcinação. A fim de fabricar o diâmetro desejado de FN, morfologia, e sua espessura, electrospinning condições tais como a taxa de fluxo, tensão, e o tempo de fiação foram optimizados. Quando as condições não foram optimizadas, a qualidade dos FN formado foi pobre. Em particular, as FN não foram centrifugadas para fora a partir da solução de polímero em baixa tensão (5 kV), e foram quebradas quando a tensão era elevada (> 20 kV). Da mesma forma, o tempo de fiação era crítica para a fabricação de FN com densidade adequada, não muito escasso (1 min) ou muito denso (30 min). Além disso, para evitar a formação do grânulo causada por taxas de fluxo elevadas, a taxa de fluxo foi manipulada. Assim, uma voltagem aplicada de 15 kV, 10 min de tempo de electrospinning e uma taxa de fluxo de 0,3 ml h
O NF esteira de TiO 2 foi transferido com sucesso para o substrato alvo, utilizando uma camada de PDMS de adesivo, o qual foi preparado por PDMS spin-revestimento sobre um substrato de silício silanizada e pré-cura num forno a 65 ° C. O tempo para a pré-cura da camada de PDMS foi optimizada através da verificação da força de aderência, usando um ensaio de aderência (Figura 2A). A Figura 2B mostra o efeito do tempo de cura em anexo nanofibras. Se o PDMS foi aquecida durante 3 min, não existe força de adesão como o PDMS foi ainda não curada e permanece como um líquido e a FN foi incorporado na camada de PDMS. Quando é aquecido durante 30 min, a força de adesão é muito fraco, como o PDMS torna-se duro e perde a sua propriedade aderente e as FN não estivesse ligada nele. Quando o PDMS foi aquecida foR 10 min, o PDMS mostrou forte força de adesão e a FN foram ligados fortemente. A partir dos resultados, conclui-se que o tempo óptimo para a pré-cura PDMS para fixação forte é de 10 min.
Após a montagem do disco, o imunoensaio foi realizado sobre o TiO 2 NF esteira disco integrada, seguindo uma série de processos de utilização de discos, como apresentado na Tabela 1. Para a determinação de concentrações de PCR e TIc em amostras desconhecidas, gráficos de calibração para cada um foram feitas através da representação gráfica as unidades relativas de luz (RLU) versus a concentração de CRP ou TIc (Figura 3). Na Figura 3A e 3B, os resultados do ensaio em disco, foram comparados com os de ELISA convencional em uma placa de 96 poços para PCR e TIc respectivamente. Os ensaios apresentaram uma ampla gama dinâmica linear com um limite de detecção de 0,8 pg / ml (~ 6 fm) para PCR e 37 pg / ml (1,5 pM) para TIc em um disco, queé cerca de 300 vezes mais elevada para a PCR e 20 vezes maior para TIc em comparação com os respectivos resultados de ELISA convencionais (286 pg / mL, 2,3 pM para PCR; 824 pg / mL, 32 pM para TIc).
Figura 1. Otimização das condições de electrospinning. MEV em cada condição de mostrar a morfologia das NFs formados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. teste de aderência da camada de PDMS adesivo e imagens SEM do TiO 2 mat NF transferido. (A) força de aderência do adesivoCamada de PDMS, pré-curado durante vários períodos de tempo (B), as imagens de SEM de nanofibras ligados em PDMS curados durante diferentes períodos de tempo. Este valor foi modificado a partir Ref. 21. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Os gráficos de calibração para a detecção de PCR e utilizando TIc Lab-on-a-disco e placa de 96 poços. Detecção de PCR cravado no soro livre de PCR (A) e TIc cravado no sangue total (B) foram realizados. As barras de erro indicam o desvio padrão de pelo menos três medições independentes. O limite de detecção (LOD) foi calculada por 3 vezes o desvio padrão dos dados de controlo negativo medido com soro livre de PCR ou de sangue total sem TIc para spikingCRP e cTnI, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Spin No. | Speed (rpm) | Válvula No. | Tempo (seg) | Operação | |||
| 1 | 3.600 | 60 | separação de sangue | ||||
| 2 | 2.400 | 1 | 3 | válvula aberta para transferir o plasma para dentro da câmara contendo 8 ul de detecção de anticorpos conjugados com HRP | |||
| 3 | 15 Hz, 15 ° | 5 | misturar o plasma e detecção de anticorpos | ||||
| 4 </ Td> | 2.400 | 2 | 3 | válvula aberta para transferir a mistura para a câmara de reacção de ligação | |||
| 5 | 60 Hz, 2 ° | 1.200 | misture anticorpos de captura na esteira de TiO 2 NF e anticorpos de detecção de plasma mistura | ||||
| 6 | 2.400 | 3 | 10 | válvula aberta para remover a mistura | |||
| 7 | 2.400 | 4 | 4 | válvula aberta para transferir tampão de lavagem | |||
| 8 | 30 Hz, 30 ° | 120 | misture tampão de lavagem e lava-mat TiO 2 NF | ||||
| 9 | 2.400 | 4 | tampão de lavagem de transferência | ||||
| 10 | 30 Hz, 30 ° | 120 | 2 mat NF | ||||
| 11 | 2.400 | 4 | tampão de lavagem de transferência | ||||
| 12 | 30 Hz, 30 ° | 120 | misture tampão de lavagem e lava-mat TiO 2 NF | ||||
| 13 | 2.400 | 4 | tampão de lavagem de transferência | ||||
| 14 | 30 Hz, 30 ° | 120 | misture tampão de lavagem e lava-mat TiO 2 NF | ||||
| 15 | 2.400 | 20 | remover o tampão de lavagem restante | ||||
| 16 | 5 | válvula próxima | |||||
| 17 | 2.400 | 6 | 10 | aberta valve e transferir o substrato quimioluminescente | |||
| 18 | 30 Hz, 2 ° | 60 | misture substrato e os imunorreagentes na esteira de TiO 2 NF | ||||
| 19 | 2.400 | 7 | 10 | abrir a válvula e transferir o substrato reagido para a câmara de detecção | |||
| Tempo total | ~ 30 min | ||||||
Tabela 1. Programa de Operação para o imunoensaio em um disco. Este quadro foi modificado a partir Ref. 21.
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Discussion
O ensaio em TiO 2 NF disco integrada é uma técnica rápida, barata e conveniente para a detecção ultra-sensível de baixas proteínas abundantes presentes em muito baixo volume de sangue. Esta técnica tem a vantagem da utilização de pequenos volumes de amostra (10 ul) e é receptivo para a análise de múltiplas amostras em simultâneo. Isto proporciona um grande potencial como um dispositivo de multiplexação de imunoensaio. O dispositivo tem a vantagem adicional de que ele não requer passos de pré-tratamento da amostra, como a separação do plasma, que são necessários em testes ELISA convencionais. Além disso, o aparelho pode realizar procedimentos de imunoensaio inteiros (por exemplo, misturando, lavagem, ligação etc.) automaticamente devido a câmaras pré-concebidos, canais e válvulas. Além disso, utilizando os métodos de fabricação de discos comercializados (por exemplo, moldagem por injecção, UV / ultra-sons / ligação térmica) em vez de moagem e montagem manual utilizando adesivos, todo o processo de fabricação do dispositivo de análise pode serautomatizado.
Além disso, o método de transferência de impressão aqui apresentada mostra uma transferência simples e fácil de electrospun NF do dador ao substrato alvo, utilizando uma camada de adesivo fina PDMS. Em geral, os TiO 2 FN obtidas após o processo de calcinação são frágeis e facilmente destacada do substrato ligado à terra, devido à fraca adesão. 25 Devido à sua fragilidade característica, integrando as TiO 2 esteiras NF com outros dispositivos é difícil. Para resolver isto, muitos métodos têm sido relatados. Por exemplo, hot-prima 26 e solvente de vapor de 27 técnicas mostrou o reforço da adesão entre TiO 2 mat NFs e superfície do alvo antes do processo de calcinação. Embora estes métodos aumentou a aderência, as esteiras de TiO 2 NF não estavam intactos, devido à elevada pressão mecânica ou o solvente aplicado durante as respectivas técnicas. Além disso, por causa do passo de calcinação, a integração do TiO 2 </ Sub> esteiras NF usando esses métodos podem ser aplicados apenas para superfícies alvo limitados.
Para o melhor de nosso conhecimento, esta é a primeira técnica para mostrar a transferir-impressão de esteiras NF para um dispositivo feito de termoplásticos, retendo as novas propriedades de NFs mesmo após a transferência. Para um melhor desempenho do dispositivo, fabricação de alta qualidade NFs e otimização das condições de pré-cura são desejados. Como mencionado no protocolo, o tempo necessário para a pré-cura pode variar dependendo das condições ambientais; portanto, as condições de pré-cura são para ser optimizado por medição da força de adesão utilizando uma tacha-teste.
Além disso, o protocolo aqui apresentado, proporciona guias hábeis para o processo totalmente automatizado de ELISA de um disco. O protocolo apresenta não só a fabricação do disco, mas também a automação de todos os processos necessários para a ELISA, incluindo a separação de sangue total, a medição, a mistura, lavagem e detecção.Cada etapa é otimizado com velocidade de centrifugação, a frequência de mistura, e tempo de operação. Com base nesta guia de operação, os reagentes carregados num disco podem ser transferidos utilizando um único motor. Desde o dispositivo realizada excelente sensibilidade de detecção com muito baixo volume de sangue, ele fornece um grande potencial para aplicações de diagnóstico por triagem biomarcadores numa fase precoce da doença. O dispositivo poderia ser activado para detectar qualquer biomarcador dependendo da disponibilidade dos seus anticorpos específicos.
Embora o dispositivo com esteiras de TiO 2 NF alcançado altamente sensibilidade melhorada devido à grande área de superfície das esteiras, um dos desafios restante desta técnica pode ser na produção em massa de esteiras uniformes NF. Uma vez que a sensibilidade do teste ELISA é fortemente afectada pela área da superfície da esteira de nanofibras, é fundamental para conseguir não só uma área superficial elevada, mas também uma área de superfície reprodutível e uniforme em diferentes lotes de produção em massa. Em conclusão, mostrámos um método simples para integrar uma esteira NF quebradiço para um dispositivo funcional para a detecção ultra-sensível de proteínas. As vantagens deste método são as seguintes: 1) anteriormente electrospun TiO 2 FN pode ser preparada apenas em superfícies condutoras e termicamente estáveis; aqui, mostrámos que eles podem ser transferidos para qualquer substrato incluindo materiais não condutores e materiais plásticos; 2) os tapetes de TiO 2 NF pode suportar a pressão e permanecer estável durante os passos de lavagem, devido à elevada força de aderência da camada de PDMS; 3) que proporciona uma área de superfície relativamente mais elevados para bioensaios; e 4) os anticorpos podem ser ligados covalentemente a TiO 2 FN devido às propriedades de superfície intacta no NFS. Esta técnica tem um grande potencial para ser usado para a integração de materiais nanofibrous em dispositivos para diversas aplicações.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) subvenções (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), uma bolsa da Korean Saúde Tecnologia R & D Project, Ministério da Saúde e Bem-Estar (A121994) e IBS-R020-D1 financiado pelo Governo coreano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III - ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
References
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