Introduction
Flere plattformer for sykdom diagnose har blitt utviklet basert på nanoskala materialer 1,2 eksempel nanotråder, 3 nanopartikler, 4 nanorør, 5 og nanofibers (NFS) 6-8. Disse nanomaterialer har gode utsikter i utformingen av nye teknologier for svært sensitive bioassay grunn av deres unike fysiske og kjemiske egenskaper. For eksempel har mesoporous sink oksid nanofibers blitt brukt for femto-molar sensitiv deteksjon av brystkreft biomarkører. 9 Nylig nanomaterialer basert på titandioksid (TiO2) har blitt undersøkt for Bioanalytical applikasjoner 10 vurderer sin kjemiske stabilitet, 11 ubetydelig protein denaturering , 12 og biokompatibilitet. 13 i tillegg er de hydroksylgrupper på overflaten av TiO 2 lette kjemisk modifikasjon og kovalent binding av biomolekyler. 14,15 mønstret TiO 2 thin filmer 16 eller TiO 2 nanorørene 17 er blitt benyttet for å forbedre deteksjonsfølsomheten av et mål-protein ved å øke overflatearealet; imidlertid, er fremstillingsprosessen ganske komplisert og krever kostbart utstyr. På den annen side er elektrospunnede NFS mottar oppmerksomhet på grunn av deres høyt overflateareal, så vel som enkel og billig fremstillingsprosess; 18,19 ennå, den skjøre eller løs karakteristisk for elektrospunnede TiO 2 NF matten gjør det vanskelig å håndtere og integreres med microfluidic enheter. 6,20 ble derfor TiO 2 NF matter sjelden benyttet i Bioanalytical anvendelser, spesielt de som krever sterke vaskebetingelser.
I denne studien, for å overvinne disse begrensninger har vi utviklet en ny teknologi for overføring av elektrospunnede NF matter på overflaten av enhver target-substrat ved å benytte en tynn polydimetylsiloksan (PDMS) klebesjikt. furthermore, har vi lykkes viste integreringen av elektrospunnede TiO to NF-matter på en sentrifugal-mikrofluidanordning fremstilt av polykarbonat (PC). Ved hjelp av denne anordning, ble en høy-følsom, helautomatisk, og integrert påvisning av C-reaktivt protein (CRP), så vel som hjerte troponin I (cTnI) oppnådd i løpet av 30 min fra bare 10 ul av fullblod. 21 På grunn av den kombinerte fordelene med egenskapene til NFS og sentrifugal plattformen, analysen viste et bredt dynamisk område av seks størrelsesordener fra 1 pg / ml (~ 8 FM) til 100 ng / ml (~ 0,8 pM) med en nedre deteksjonsgrense på 0,8 pg / ml (~ 6 FM) for CRP og et dynamisk område fra 10 pg / ml (~ 0,4 pm) til 100 ng / ml (~ 4 nM) med en påvisningsgrense på 37 pg / ml (~ 1,5 pM) for cTnI. Disse deteksjonsgrenser er ~ 300 ~ og 20-ganger lavere enn de tilsvarende konvensjonelle ELISA-resultater. Denne teknikken kan anvendes for påvisning av enhver target-proteiner, med passende antistoffer. Samlet sett denne enheten could bidra sterkt til in vitro-diagnostikk og biokjemiske analyser, siden det kan detektere sjeldne mengder av target-proteiner med stor følsomhet, selv fra meget små mengder av biologiske prøver, for eksempel, 10 pl fullblod. Selv om vi bare vist serumproteindeteksjon ved hjelp av ELISA i denne studien, kan overføring og integrering teknologi av elektrospunnede NFS med microfluidic enhetene være mer bredt anvendt i andre biokjemiske reaksjoner som krever et stort overflateareal for høy deteksjonsfølsomhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Blod ble tatt fra friske individer og ble samlet i en blodprøverøret. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle frivillige.
1. Fabrikasjon av TiO 2 NF Mat
- Utarbeidelse av forløper løsning 22
- Oppløs 1,5 g titantetraisopropoksyd (TTIP) i en blanding av etanol (99,9%, 3 ml) og iseddik (3 ml) og blande løsningen ved romtemperatur (25 ° C) i 30 min på en magnetrører.
- Oppløs 11 vekt% polyvinylpyrrolidon (PVP) i 3,64 g etanol (99,9%) og omrør løsningen ved 65 ° C i 1 time ved anvendelse av en varm-plate magnetrører.
- Kombiner og røre de to oppløsninger ved 65 ° C i 4 timer på en varm plate magnetrører.
- electro
- Laste fremstilt oppløsning inn i en sprøyte som er koblet til en nål av rustfritt stål på 200 um indre Diameter. Hell blandingen direkte inn i sprøyten etter fjerning av stempelet.
- Introdusere løsningen konstant ved en strømningshastighet på 0,3 ml / time i 10 minutter på en Si-skive (2 cm x 2 cm) som er plassert på et jordet underlag ved en høy likespenning (15 kV). I løpet av electro, angi avstanden mellom nålen og jordet underlaget til 10 cm.
- Røsting av NF matte
- Plasser NF matten i en ovn og øke temperaturen opp til 500 ° C med en ramping hastighet på 3 ° C / min under høy-vakuum-tilstand (5 x 10 -5 torr).
- Opprettholde temperaturen ved 500 ° C i 3 timer. Kjøl ned temperaturen til prøvene til romtemperatur (25 ° C) i ovnen.
2. Integrering av TiO 2 NF Mat inn en Sentrifugal mikrofluid Disc
- Fabrikasjon av en plate
- Bruk 3D designe programvare (f.eks SolidWorks eller lignende) for å skildre kamre, kanaler og ventiler i hvert lag av platen. Konverter design filer til datamaskinen numerisk kontroll (CNC) koden ved hjelp av kode generere programvare (f.eks Edgecam eller lignende). Bruk programvare i henhold til bruksanvisningen 23,24. Merk: De typiske kanaldimensjoner som brukes i denne enheten er 1,0 mm x 0,3 mm (bredde x dybde).
- Åpne driftsprogramvare for CNC Fres (f.eks., DeskCNC eller lignende) og laste CNC koden til driftsprogramvaren og klikk følgende i rekkefølge: "AUTO" -> "G CODE ÅPEN" -> Velg den genererte CNC-kode.
- Fest PC platen på CNC Fres: Bruk 1 mm PC-plater for det øverste laget og 5 mm PC-plater for platelaget. Kjør CNC Fres å kutte hvert lag av platen ved å klikke på "Start" -knappen.
- Overføring av TiO 2 NF matte på platen
- Plassere et silisiumsubstrat og en liten petriskål inneholdende 40 ul (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-triklorsilan i et vakuumkammer under vakuum i 30 min. Den fluorosilane fordamper og blir belagt på underlaget.
- Bland polydimetylsiloksan (PDMS) pre-polymer med et herdemiddel i en 10: 1-forhold og avgasse i et vakuumkammer. Spin-belegge PDMS mot en silisium substrat ved 650 rpm i 60 sek.
- Kurere de PDMS belagt på silisium substrat i en ovn ved 65 ° C i 10 minutter for å oppnå et klebende tilstand.
MERK: Herdetid kan varieres avhengig av miljøforhold, og vedheft kraft kan bli testet av en tack test med en rheometer. - Overfør TiO 2 NF matte utarbeidet av electro og kalsinering på PDMS-belagt silisium ved hjelp av en pinsett. Deretter manuelt søke konformt press på den overførte TiO 2 NF matte med en flat gjenstand (f.eks., Glass lysbilde) og fjern gjenstanden. Settedenne prøven i ovnen ved 65 ° C i 4 timer eller ved 80 ° C i 1 time for å herde PDMS lag helt.
- Coat bindende reaksjonskammere i platen med 20 pl PDMS / herder-blanding (10: 1), som virker som et klebemiddelsjikt for å feste TiO 2 NF matte på platen.
- Tilsett 50 mL etanol (99,9%) på TiO 2 NF matte på PDMS lag, kutt NF matte med en punch hull på 6 mm diameter, og overføre kutt TiO 2 NF matte til bindende reaksjonskamrene belagt med 20 pl av PDMS i det foregående trinnet.
MERK: I dette trinnet, vil etanol være nyttig å koble kutt TiO 2 NF matten fra Si underlaget. - Inkuber TiO 2 NF matte integrert plate i ovn ved 65 ° C i 4 timer eller ved 80 ° C i 1 time for å herde PDMS helt.
- Overflatemodifisering av TiO 2 NF matte på platen
- PRepare 1% volum / volum oppløsning av (3-glycidoksypropyl) methyldiethoxy silan (GPDES) i etanol (99,9%).
- Unn den integrerte platen TiO 2 NF matte med oksygen plasma på 140 W, 50 SCCM oksygen for 180 sek. Dispensere 100 ul GPDES løsning på hver nanofiber matte og inkuber ved romtemperatur (25 ° C) i 2 timer.
- Vask underlag kort ved utlevering etanol (99,9%) ved hjelp av en vaskeflaske, og deretter fjerne etanol helt ved å snu platen og blotting det mot en ren tørk. Herding ved 80 ° C i 1 time. Vask to ganger med etanol (99,9%) på samme måte som angitt ovenfor, for å fjerne fysisk adsorbert og ubundet GPDES molekyler.
- Føn med en nitrogenstrøm, tørke under vakuum.
MERK: Platen kan lagres i en forseglet beholder ved romtemperatur (25 ° C) inntil bruk.
- Immobilisering av antistoffer på overflaten
- Lag en løsning av 200 mikrogram / ml capture antistoffer (monoklonalt mus antihumant hsCRP eller monoklonalt mus anti-cTnI) ved fortynning av antistoffer med en fosfat-bufret saltvann (PBS) buffer (pH 7,4). Tilsett 5 mL av løsningen på hver NF matte i en plate ved hjelp av en mikropipette. Se materialer liste for mer informasjon om antistoffer.
- Holde skivene i et fuktet kammer og inkuber ved 37 ° C i 4 timer. Vask antistoffene belagt NF matte med 0,1% BSA-PBS-buffer. Fylle kammeret med 100 ul vaskebuffer ved hjelp av en mikropipette, fjern buffer ved aspirering eller dekantering. Til slutt, snu platen og tørk den mot en ren tørke, og deretter montere platen.
- Disc montering
- Tegn utformingen av platen på dobbel-side tape ved hjelp av et CAD-program (for eksempel AutoCAD eller lignende). Laste CAD design til skjæring plotter.
- Kutt tosidig tape med klippe plotter. Skrelle av en beskyttende lag av dobbeltsidig tape og fest it på toppen av platesjikt. Skrelle av andre beskyttelseslag og fest det øverste laget på platen laget.
- Legg den foreløpig montert plate i Hot Press og presist justere topp / lim / skive lag bruker for justering merker i hvert lag for å koble hver ventil, kanal og kamre. Påfør konforme trykket ved hjelp av Hot Press.
3. Immunoassay
- Fylle kamrene med 1% BSA-PBS-buffer ved anvendelse av en mikropipette og Inkuber platen ved 37 ° C i 1 time. Fjern buffer ved aspirasjon ved hjelp av en mikropipette. Utføre dette trinnet for å blokkere de un-reagerte områder, og for å redusere ikke-spesifikk adsorpsjon av protein i en plate.
- Vask to ganger med 0,1% BSA-PBS ved fylling og aspirering kamrene ved hjelp av en mikropipette.
MERK: På dette stadiet platen kan lagres ved 4 ° C inntil bruk. - Load 10 mL av antigen-spiked fullblod eller CRP fritt serum for CRP deteksjon på platen, med en micropipette. For å lage kalibrerings grafer, bruker konsentrasjoner av CRP fra 1 pg / ml til 100 ng / ml; og cTnI fra 10 pg / ml til 100 ng / ml.
MERK: På grunn av de høyere nivåer av CRP i fullblod, som vanligvis er i uM område ble CRP-fritt serum anvendt for å demonstrere den lave påvisningsgrensen for anordningen. - Spinn platen ved 3600 rpm (391 x g) i 60 sek for å separere de røde blodcellene.
- Åpne ventil # 1 ved hjelp av laserbestråling, og overføring 4 pl av supernatanten plasma til kammeret inneholdende 8 ul av detektere antistoffer konjugert med HRP ved spinning av platen ved 2400 rpm i 3 sek.
MERK:. De generelle fremgangsmåter for betjening av ventiler og visualisering av skiven operasjon er beskrevet i detalj i en tidligere rapport 21 - Anvende en blandemodus (15 Hz s -1, 15 °) i 5 sekunder for binding av protein- og deteksjons antistoffer.
- Åpne ventil # 2, og overføre blandingen fremstilt i trinn 6 til bindingsreaksjonskammeret (2400 rpm, 3 sek). Deretter påføres et blandemodus (60 Hz s -1, 2 °) i 20 min for å oppnå en immunoreaksjon mellom blandingen og de bindende antistoffene på TiO 2 NFS. Etter reaksjonen åpne ventil # 3 og overføre restblandingen til avfallskammeret (2400 rpm, 10 sekunder).
- Overfør vaskebuffer (600 ul) til bindingen reaksjonskammeret ved å åpne ventil # 4 og spinne platen (2400 rpm, 4 sek). Deretter gjelder en blanding modus (30 Hz s -1, 30 °) for 120 sek å vaske TiO 2 NFS i kammeret.
- Vask TiO 2 NFS to ganger mer ved å følge samme tilstand trinn 3.8, og fjerne den gjenværende vaskebuffer helt ved å spinne på platen med 2400 rpm i 20 sekunder. Deretter lukker ventilen # 5.
- For den kjemiluminescerende reaksjon, bruke en blandemodus (30 Hz s -1, 2 °) i 1 min etter overføring av kjemiluminescerende substratløsning til bindingsreaksjonskammeret ved å åpne ventil # 6 og spinningplaten ved 2400 rpm i 10 sekunder senere.
- Overfør den omsatte substratoppløsning til deteksjons kamrene ved å åpne ventil # 7 og spinne platen ved 2400 opm i 10 sek.
- Mål kjemiluminescens signaler fra den omsatte substratoppløsning ved hjelp av et fotomultiplikatorrør (PMT) modul utstyrt deteksjonssystem.
MERK: detection system er en spesialbygd maskin ved hjelp av følgende deler: trinn motor,-mekaniske komponenter, oversettings etapper, og kommersielt tilgjengelig PMT. De mikroskoper deler og trinn motor er montert for å holde enheten, og motoren kan rotere platen. Påvisningen utføres av PMT festet på mikroskoper deler, og det ligger over deteksjonskamre enheten. Ved å manipulere trinnet motor, er deteksjonskamre justert rett under deteksjonssonen av PMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen, en helautomatisk sentrifugal mikrofluidanordning for protein deteksjon fra fullblod med høy følsomhet ble utarbeidet. De TiO 2 NF matter ble utarbeidet av prosesser av electro og kalsinering. For å fremstille NFS av ønsket diameter, morfologi og tykkelse, electro tilstander så som strømningsmengde, spenning, og spinning tid ble optimalisert. Når forholdene ikke var optimalisert, kvaliteten på NFS dannet var dårlig. Spesielt ble NFS ikke spunnet ut fra polymerløsningen ved lav spenning (5 kV), og ble brutt når spenningen var høy (> 20 kV). Tilsvarende spinnetiden var kritisk for fabrikasjon av NFS med passende tetthet, ikke altfor tynt (1 min) eller så tette (30 min). Også for å unngå perledannelse forårsaket av høye strømningshastigheter, ble strømningshastigheten manipulert. Så, en anvendt spenning på 15 kV, 10 min electro tid og en strømningshastighet på 0,3 ml hr
Den TiO 2 NF matte ble vellykket overført til mål-substratet ved hjelp av et klebesjikt PDMS, som ble fremstilt ved spin-coating PDMS på en silanert silisiumsubstrat og pre-herding i en ovn ved 65 ° C. Tiden for salg herding av PDMS lag ble optimalisert ved å kontrollere adhesjonskraften, ved hjelp av en tack test (figur 2A). Figur 2B viser virkningen av herdetiden på nanofiber vedlegg. Dersom PDMS ble oppvarmet i 3 minutter, er det ingen adhesjonskraften som PDMS var fremdeles uherdet og forblir som en væske, og NFS fikk innebygd i PDMS lag. Når det oppvarmes i 30 minutter, er adhesjonskraften meget svak som PDMS blir stivt og mister sin klebrige egenskapen og NFS ble ikke er festet på den. Når PDMS ble varmet for 10 min, de PDMS viste sterk vedheft kraft og NFS var festet på det sterkeste. Fra resultatene, konkluderes det med at det optimale tidspunktet for salg herding PDMS for sterk festing er 10 min.
Etter skiveelement, ble den immunologiske måling gjennomført på TiO 2 NF matte integrert plate ved å følge en serie av skiven driftsprosesser som er oppført i tabell 1. For bestemmelse av CRP og cTnI konsentrasjoner i ukjente prøver ble det kalibrerings grafer for hver laget ved å plotte de relative lysenheter (RLU) versus CRP eller cTnI konsentrasjonen (figur 3). I figur 3A og 3B, ble det på-platen analyseresultatene sammenlignet med konvensjonelle ELISA på en 96-brønns plate for henholdsvis CRP og cTnI. Analysene viste en bred lineær dynamisk område med en deteksjonsgrense på 0,8 pg / ml (~ 6 FM) for CRP og 37 pg / ml (1,5 pm) for cTnI på en plate, somer ca 300 ganger høyere for CRP og 20 ganger høyere for cTnI sammenlignet med resultatene sine respektive konvensjonelle ELISA (286 pg / ml, 2,3 pm for CRP, 824 pg / ml, 32 PM for cTnI).
Figur 1. Optimalisering av elektrospinningsforholdene. SEM bilder på hver tilstand viser morfologi av NFS dannet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Tack prøve av klebemiddel PDMS lag og SEM bilder av den overførte TiO 2 NF matte. (A) adhesjonskraften av klebePDMS lag, pre-kurert for flere eller lengre tid, (B) SEM bilder av nanofibers festet på PDMS kurert for ulike lengder tid. Dette tallet har blitt forandret fra Ref. 21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Kalibrerings grafer for påvisning av CRP og cTnI ved hjelp av lab-på-en-plate og 96-brønns plate. Påvisning av CRP tilsatt i CRP-fritt serum (A) og cTnI tilsatt i fullblod (B) ble utført. Feilstolpene indikerer standardavviket av minst tre uavhengige målinger. Deteksjonsgrensen (LOD) ble beregnet etter 3 ganger med standardavviket av de negative kontrolldata målt med CRP-fritt serum eller fullblod uten cTnI skyter forCRP og cTnI hhv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Spin No. | Hastighet (rpm) | Valve No. | Tid (sek) | Operasjon | |||
| 1 | 3600 | 60 | blodseparasjon | ||||
| 2 | 2400 | 1 | 3 | åpen ventil for å overføre plasmaet inn i kammeret inneholdende 8 ul av detektere antistoffer konjugert med HRP | |||
| 3 | 15 Hz, 15 ° | 5 | blande plasma og oppdage antistoffer | ||||
| 4 </ Td> | 2400 | 2 | 3 | åpen ventil for å overføre blandingen til bindingsreaksjonskammer | |||
| 5 | 60 Hz, 2 ° | 1200 | blande fange antistoffer på TiO 2 NF matte og plasma-påvise antistoffer blanding | ||||
| 6 | 2400 | 3 | 10 | åpen ventil for å fjerne blanding | |||
| 7 | 2400 | 4 | 4 | åpen ventil for å overføre vaskebuffer | |||
| 8 | 30 Hz og 30 ° | 120 | Bland vaskebuffer og vask TiO 2 NF matte | ||||
| 9 | 2400 | 4 | overføring vaskebuffer | ||||
| 10 | 30 Hz og 30 ° | 120 | 2 NF matte | ||||
| 11 | 2400 | 4 | overføring vaskebuffer | ||||
| 12 | 30 Hz og 30 ° | 120 | Bland vaskebuffer og vask TiO 2 NF matte | ||||
| 1. 3 | 2400 | 4 | overføring vaskebuffer | ||||
| 14 | 30 Hz og 30 ° | 120 | Bland vaskebuffer og vask TiO 2 NF matte | ||||
| 15 | 2400 | 20 | fjerne gjenværende vaskebuffer | ||||
| 16 | 5 | tett ventil | |||||
| 17 | 2400 | 6 | 10 | åpen vAlve og overføre kjemiluminescenssubstrat | |||
| 18 | 30 Hz, 2 ° | 60 | blande underlaget og immunologiske reagenser på TiO 2 NF matte | ||||
| 19 | 2400 | 7 | 10 | åpne ventil og overføre den reagerte substratet til deteksjons kammeret | |||
| Total tid | ~ 30 min | ||||||
Tabell 1. Operasjon program for immunanalyse i en plate. Denne tabellen har blitt forandret fra Ref. 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analysen på TiO 2 NF integrert plate er en hurtig, billig og praktisk teknikk for ultra påvisning av lave rikelig proteiner tilstede i meget lave volumet av blod. Denne teknikken har den fordelen av å bruke små prøvevolumer (10 ul), og er mottagelig for analyse av flere prøver samtidig. Dette gir et stort potensial som en multiplexing immunoassay enhet. Enheten har den ekstra fordelen at den ikke krever prøve forbehandlingstrinn som plasma separasjon, som er nødvendig i konvensjonelle ELISA. Dessuten kan enheten utføre hele immunologiske prosedyrer (f.eks, miksing, vasking, innbinding etc.) automatisk på grunn av pre-designet kamre, kanaler og ventiler. I tillegg bruker kommersialiserte plate fabrikasjon metoder (for eksempel sprøytestøping, UV / ultralyd / termisk binding) i stedet for fresing og manuell montering ved hjelp av lim, kan hele prosedyren fra enheten fabrikasjon til analyse væreautomatisert.
Også overførings-trykkemetode som presenteres her viser en enkel og lett overføring av elektrospunnede NF fra donor til målet substrat ved anvendelse av et tynt klebemiddelsjikt PDMS. Generelt er de TiO 2 NFS oppnådd etter kalsineringsprosessen er sprø og lett løsner fra den jordede substratet på grunn av svak adhesjon. 25 På grunn av sin karakteristiske skjørhet, integrere de TiO 2 NF matter med andre enheter er vanskelig. For å løse dette, har mange metoder blitt rapportert. For eksempel, varmpresse 26 og løsemiddeldamp 27 teknikker viste forbedring av adhesjonen mellom TiO 2 NFS matte og skiveoverflaten før kalsineringsprosessen. Selv om disse fremgangsmåter øket adhesjonen, er TiO 2 NF matter ikke var intakt på grunn av den høye mekaniske trykk eller løsningsmidlet anvendt i løpet av de respektive teknikker. Videre, på grunn av kalsineringstrinnet, integrering av TiO 2 </ Sub> NF matter ved hjelp av disse metodene kan bare brukes for begrensede målet flater.
Så langt vi kjenner til, er dette den første teknikken til å vise overføring utskrift av NF matter på en enhet som er laget av termoplast, beholde de nye egenskapene til NFS selv etter overføringen. For bedre ytelse av enheten, er fabrikasjon av høy kvalitet NFS og optimalisering av pre-herdebetingelser ønsket. Som nevnt i protokollen, kreves det tid for pre-herding kan variere avhengig av de miljømessige forholdene; Derfor, pre-herdebetingelser som skal optimaliseres ved å måle adhesjonskraften ved hjelp av et klebetest.
Videre protokollen presenteres her, gir dyktige guider for helautomatisk ELISA prosessen på en plate. Protokollen introduserer ikke bare fremstillingen av platen, men også automatisering av alle prosessene som er nødvendig for ELISA, inkludert separasjon av fullblod, måling, blanding, vasking og deteksjon.Hvert trinn er optimalisert med sentrifugehastighet, blande frekvens, og operasjonstid. Basert på denne veiledningen, kan reagensene lastet på en plate overføres ved hjelp av en enkelt motor. Siden enheten utførte utmerket følsomhet med svært lavt volum av blod, gir det et stort potensial for diagnostiske applikasjoner ved screening biomarkører på et tidlig stadium av sykdommen. Enheten vil være i stand til å oppdage eventuelle biomarkør avhengig av tilgjengeligheten av sine spesifikke antistoffer.
Selv om anordningen med TiO 2-NF matter oppnådde sterkt forbedret følsomhet på grunn av det store overflatearealet av mattene, kan en av de resterende utfordringen med denne teknikken være i masseproduksjon av ensartede NF matter. På grunn av at følsomheten av ELISA-er sterkt påvirket av overflatearealet av nanofiber matten, er det avgjørende for å oppnå ikke bare et høyt overflateareal, men også en reproduserbar og ensartet overflateareal i forskjellige satser av masseproduksjon. Som konklusjon, har vi vist en enkel metode for å integrere et sprøtt NF matte til en funksjonell enhet for ultraproteindeteksjon. Fordelene med denne fremgangsmåte er som følger: 1) tidligere elektrospunnede TiO 2 NFS kunne fremstilles bare på ledende og termisk stabile overflater; her, har vi vist at de kan overføres til hvilket som helst substrat, inkludert ikke-ledende og plastmaterialer; 2) TiO 2 NF matter tåler trykket og holde seg stabil i løpet av vasketrinnene på grunn av høy vedheft kraft PDMS lag; 3) den tilveiebringer en relativt større overflateareal for bioassay; og 4) de antistoffene kan bli kovalent bundet til de TiO 2 NFS på grunn av de intakte overflateegenskaper på NFS. Denne teknikken har et stort potensiale for å bli brukt for integrering av nanofibrous materialer i enheter for ulike applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation of Korea (NRF) tilskudd (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), et stipend fra den koreanske Health Technology R & D Project, Ministry of Health & Welfare (A121994) og IBS-R020-D1 finansiert av den koreanske regjeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III - ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
References
- Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
- Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
- Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. Biosensors and Cancer. , Science Publishers. 164-183 (2012).
- Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , Pan Stanford Publishing. 265-282 (2011).
- Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).
- Yang, D., et al. Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV. Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).
- Chantasirichot, S., Ishihara, K. Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system. Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).
- Zhang, N., et al. Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).
- Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics. Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).
- Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).
- Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles. Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).
- Liu, S., Chen, A. Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing. Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).
- Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts. J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).
- Dettin, M., et al. Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).
- Kim, W. -J., et al. Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group. Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).
- Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -G. Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).
- Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays. Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors. Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).
- Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays. ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).
- Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -R., Park, Y. -S., Cho, Y. -K. Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood. Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).
- Li, D., Xia, Y. Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning. Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).
- Lombard, M. SolidWorks 2013 BIBLE. , John Wiley & Sons Inc. Indianapolis, IN. (2013).
- Tickoo, S. EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , CADCIM Technologies. Schererville, IN. (2007).
- Zhu, R., et al. Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices. Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).
- Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -P. TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells. Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).
- Katsuhiro, O., et al. Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications. Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).
