Introduction
Несколько платформ для диагностики заболеваний, были разработаны на основе наноразмерных материалов , таких как 1,2 нанопроводов, 3 наночастицы, 4, 5 нанотрубок и нановолокон (NFS) 6-8. Эти наноматериалы предлагают отличные перспективы в разработке новых технологий для высокочувствительных биопробы благодаря своим уникальным физико-химическим свойствам. Например, мезопористый оксид цинка нановолокна были использованы для фемтосоты-молярного чувствительного обнаружения рака молочной железы биомаркеров. 9 В последнее время наноматериалы на основе диоксида титана (TiO 2), были исследованы в течение биоаналитических приложений 10 принимая во внимание их химическую стабильность, 11 пренебрежимо мало денатурации белка , 12 и биосовместимость. 13 Кроме того, гидроксильные группы на поверхности TiO 2 облегчить химическую модификацию и ковалентное присоединение биомолекулы. 14,15 узорчатого TiO 2 THIп пленки 16 или TiO 2 нанотрубки 17 были использованы для повышения чувствительности обнаружения белка - мишени за счет увеличения площади поверхности; Тем не менее, процесс изготовления является достаточно сложным и требует дорогостоящего оборудования. С другой стороны, electrospun НФ , получают внимание из - за их высокой площади поверхности, а также простой и изготовление недорогих процесса; 18,19 все же, хрупкое или ослаблены характеристикой electrospun TiO 2 NF мата делает его трудно обрабатывать и интегрироваться с микрофлюидальных устройствами. 6,20 Таким образом, TiO 2 NF маты редко используются в биоаналитических приложениях, особенно те , которые требуют жестких условий промывки.
В этом исследовании, чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали новую технологию для передачи electrospun NF матов на поверхности любой целевой подложки за счет использования клеевого слоя тонкой полидиметилсилоксана (PDMS). Furthermore, мы успешно продемонстрировали интеграцию electrospun TiO 2 NF Маты на центробежный микрожидком устройства изготовлен из поликарбоната (PC). С помощью этого устройства, высокий чувствительный, полностью автоматизированы и интегрированы обнаружение С-реактивного белка (CRP), а также сердечный тропонин I (cTnI) был достигнут в течение 30 мин только с 10 мкл цельной крови. 21 Из - за комбинированный преимущества свойств NFs и центробежной платформы, анализ представил широкий динамический диапазон на шесть порядков от 1 пг / мл (~ 8 Fm) до 100 нг / мл (~ 0,8 пм) с нижним пределом обнаружения 0,8 пг / мл (~ 6 Fm) для СРБ и динамическом диапазоне от 10 пг / мл (~ 0,4 пМ) до 100 нг / мл (~ 4 нм) с пределом обнаружения 37 пг / мл (~ 1,5 мкм) для cTnI. Эти пределы обнаружения составляют ~ 300 и ~ 20 раз ниже по сравнению с их соответствующими традиционными результатами ELISA. Этот метод может быть применен для обнаружения любых белков-мишеней, с соответствующими антителами. В целом, это устройство совместнопакетирования в значительной степени способствовать лабораторной диагностики и биохимических анализов , так как он может обнаружить редкие количества белков - мишеней с большой чувствительностью даже от очень малых количеств биологических образцов, например, по 10 мкл цельной крови. Хотя мы только показали обнаружение сывороточного белка с использованием ELISA в данном исследовании, передача и интеграция технологии electrospun NFs с микрофлюидальных устройств можно было бы также более широкое применение в других биохимических реакций, которые требуют большую площадь поверхности для достижения высокой чувствительности обнаружения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Кровь отбирали у здоровых пациентов, и собирали в пробирку для сбора крови. Письменное информированное согласие было получено от всех добровольцев.
1. Изготовление TiO 2 NF Мат
- Приготовление раствора 22 предшественника
- Растворить 1,5 г тетраизопропилата титана (TTIP) в смеси этанола (99,9%, 3 мл) и ледяной уксусной кислоты (3 мл) и перемешивают раствор при комнатной температуре (25 ° С) в течение 30 мин на магнитной мешалке.
- Растворить 11 мас% поливинилпирролидона (PVP) в 3,64 г этанола (99,9%) и перемешивают раствор при температуре 65 ° С в течение 1 часа с использованием горячей пластины магнитной мешалки.
- Объединение и перемешивать оба раствора при 65 ° С в течение 4 ч на горячей пластине магнитной мешалкой.
- электроформования
- Загрузить приготовленный раствор в шприц, соединенный с иглой из нержавеющей стали 200 мкм внутренней Diameтер. Налейте раствор непосредственно в шприце после удаления плунжера.
- Вводят раствор непрерывно со скоростью потока 0,3 мл / ч в течение 10 мин на кремниевую пластину с (2 см х 2 см), помещенной на заземленную подложку при высоком напряжении постоянного тока (15 кВ). Во время электроформования, установите расстояние между иглой и заземленным субстрата до 10 см.
- Обжиг мата NF
- Поместите мат NF в печи и повышают температуру до 500 ° С со скоростью линейного изменения от 3 ° С / мин в атмосфере с высоким вакуумом (5 х 10 -5 торр).
- Поддерживают температуру при 500 ° С в течение 3 часов. Охладить температуру образцов до комнатной температуры (25 ° C) в печи.
2. Интеграция TiO 2 NF Мат в центробежную микрожидком диск
- Изготовление диска
- С помощью программного обеспечения проектирования 3D (например, СолidWorks или аналогичный), чтобы изобразить камеры, каналы или клапаны каждого слоя диска. Преобразование графических файлов в компьютерный код с числовым программным управлением (ЧПУ) с использованием кода генерации программного обеспечения (например, Edgecam или аналогичный). С помощью программного обеспечения в соответствии с инструкцией по эксплуатации 23,24 . Примечание: Типичные размеры канала , используемые в данном устройстве составляют 1,0 мм х 0,3 мм (ширина х глубина).
- Открыть рабочее программное обеспечение ЧПУ фрезерного станка (например., DeskCNC или аналогичный) и загрузки кода с ЧПУ для работы программного обеспечения и нажмите следующее по порядку: "AUTO" -> "G КОД OPEN" -> Выберите сгенерированный код ЧПУ.
- Прикрепите PC пластину на фрезерном станке с ЧПУ: использовать 1 мм PC пластины для верхнего слоя и 5 мм пластин для ПК слоя диска. Запуск фрезерный станок с ЧПУ, чтобы сократить каждый слой диска, нажав на кнопку "Старт".
- Передача TiO 2 NF мата на диск
- Поместите кремниевую подложку и небольшую чашку Петри, содержащую 40 мкл (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-трихлорсилана в вакуумной камере под вакуумом в течение 30 мин. Фторсилановое испаряет и получает покрытием на подложке.
- Смешайте полидиметилсилоксан (PDMS) форполимера с отвердителем в соотношении 10: 1 и дегазацию в вакуумной камере. Спин-Покрывают ПДМС на кремниевую подложку со скоростью 650 оборотов в минуту в течение 60 с.
- Вылечить PDMS покрытием на кремниевой подложке в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение 10 мин для достижения клейкого состояния.
Примечание: Время обжига может изменяться в зависимости от условий окружающей среды, и сила адгезии может быть проверена с помощью теста галс с использованием реометра. - Перенести мат TiO 2 NF , подготовленный электроформования и кальцинации на кремнии PDMS-покрытием , используя пинцет. Затем вручную применить конформное давление на передаваемый TiO 2 NF коврик с плоским предметом (например., Предметное стекло) и удалить объект. ПоложилВ этом примере в печи при температуре 65 ° С в течение 4 ч или при 80 ° С в течение 1 часа, чтобы полностью вылечить PDMS слой.
- Coat связывающие реакционные камеры в диске с 20 мкл ПДМС / отвердитель смеси (10: 1), который выступает в качестве адгезивного слоя для прикрепления TiO 2 NF мата на диск.
- Разлить по 50 мкл этанола (99,9%) на TiO 2 NF мата на слой PDMS, разрезать мат NF с пуансоном отверстие диаметром 6 мм, и передать разрез TiO 2 NF мата к связыванию реакционных камер , покрытых 20 мкл из PDMS в предыдущем шаге.
Примечание: На этом этапе этанол будет полезно отделить разрезанную TiO 2 NF мата из кремниевой подложки. - Выдержите TiO 2 Н.Ф. мат интегрированный диск в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение 4 часов или при температуре 80 ° С в течение 1 ч до полного отверждения PDMS.
- Поверхностная модификация TiO 2 NF мата на диске
- п1% его восстановить объем / объем раствора (3-глицидоксипропил) methyldiethoxy силана (GPDES) в этаноле (99,9%).
- Лечить TiO 2 NF мат интегрированный диск с кислородной плазмой при 140 Вт, 50 SCCM потока кислорода в течение 180 сек. Распределить 100 мкл раствора GPDES на каждой нановолокна мата и инкубировать при комнатной температуре (25 ° C) в течение 2 часов.
- Промыть кратко подложках дозирования этанола (99,9%) с использованием промывочной бутылки, затем удалите этанол полностью переворачивая диск и промокательной его против чистой салфеткой. Отверждение при 80 ° C в течение 1 часа. Промыть дважды с этанолом (99,9%), таким же образом, как указано выше, для удаления физически адсорбированной, так и несвязанные молекулы GPDES.
- Продуйте струей азота, сушат под вакуумом.
Примечание: Диск можно хранить в герметичном контейнере при комнатной температуре (25 ° С) до момента использования.
- Иммобилизация антител на поверхности
- Сделайте раствор 200 мкг / мл антител захвата (моноклональное анти-мышьчеловеческий вчСРБ или мышиное моноклональное анти-cTnI) путем разбавления антител с фосфатным буферным солевым раствором (PBS) буфере (рН 7,4). Разлить по 5 мкл раствора на каждый мат NF в диск с помощью микропипетки. Просмотреть список материалов для получения дополнительной информации о антител.
- Хранить диски в увлажненной камере и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 4 часов. Промыть антитела, покрытые NF мат с 0,1% -ным буфером BSA-PBS. Заполнить камеру 100 мкл буфера для промывки с помощью микропипетки, удалите буфер аспирацией или декантацией. И, наконец, перевернуть диск и промокните его против чистой стереть, а затем собрать диск.
- сборка дисков
- Нарисовать дизайн диска на двухсторонней клейкой ленты с помощью программы CAD (например, AutoCAD или аналогичный). Загрузите дизайн CAD плоттера.
- Обрежьте двусторонней клейкой ленты с помощью режущего плоттера. Лупиться один защитный слой двойного скотча и прикрепить Iт в верхней части слоя диска. Лупиться другой защитный слой и прикрепить верхний слой на слое диска.
- Загрузите предварительно собранный диск в прессом и точно выровнять верх / клей / дисковые слои с использованием Совместите метки в каждом слое для подключения каждого клапана, канал и камеры. Применить конформное давление с помощью прессования машины.
3. иммуноферментный
- Заполните камеры с 1% -ным буфером БСА-PBS с помощью микропипетки и инкубировать диск при 37 ° С в течение 1 часа. Удалить буфер путем аспирации с помощью микропипетки. Выполните этот шаг, чтобы блокировать непрореагировавшего сайты и уменьшить неспецифической адсорбции белка на диске.
- Промыть два раза с 0,1% BSA-PBS путем заполнения и аспирационного камер с помощью микропипетки.
Примечание: На этом этапе диск не может храниться при температуре 4 ° С до использования. - Нагрузка 10 мкл антигена подскочили цельной крови или CRP свободной сыворотки для обнаружения CRP на диске с помощью micropipettе. Для изготовления калибровочных графиков, используют концентрации CRP от 1 пг / мл до 100 нг / мл; и cTnI от 10 пг / мл до 100 нг / мл.
Примечание: В связи с более высоким уровнем СРБ в цельной крови, которая, как правило, в диапазоне мкМ, CRP-сыворотку использовали для демонстрации нижнего предела обнаружения устройства. - Вращение диска при 3600 оборотах в минуту (391 XG) в течение 60 секунд, чтобы отделить красные кровяные клетки.
- Открытый клапан # 1 лазерным излучением, и перенос 4 мкл супернатанта плазмы в камере, содержащей 8 мкл обнаружения антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, вращая диск при 2,400 оборотах в минуту в течение 3 сек.
Примечание:. Общие способы приведения в действие клапана и визуализации работы диска подробно описаны в предыдущем докладе 21 - Нанести режиме смешивания (15 Гц с -1, 15 °) в течение 5 секунд для связывания белка и детекции антител.
- Открыть вентиль # 2, и перенесите смесь, полученную на стадии 6 к связующей реакционной камере (2400 оборотов в минуту, 3 сек). Затем применяется режим микширования (60 Гц с -1, 2 °) в течение 20 мин для достижения иммунореакции между смесью и связывания антител на TiO 2 НФ. После завершения реакции, открытый клапан # 3 и перевести остаточную смесь в камере отходов (2400 оборотов в минуту, 10 секунд).
- Перенести промывочным буфером (600 мкл) в реакции связывания камеры путем открытия клапана # 4 и вращающийся диск (2400 оборотов в минуту, 4 сек). Затем примените режим смешивания (30 Гц с -1, 30 °) в течение 120 секунд , чтобы вымыть TiO 2 НФ в камере.
- Вымойте TiO 2 НФ в два раза больше, следуя тому же условию стадии 3.8, и полностью удалить остаточный промывочный буфер, вращая диск при 2400 оборотах в минуту в течение 20 сек. Затем закройте клапан # 5.
- Для хемилюминесцентной реакции, применяют режим микширования (30 Гц с -1, 2 °) в течение 1 мин после передачи хемилюминесцентного раствора субстрата к переплету реакционной камере путем открытия клапана # 6 и прядениедиск при 2400 оборотах в минуту в течение 10 секунд впоследствии.
- Перенести Реакционный раствор субстрата с камерами обнаружения путем открытия клапана # 7 и вращающийся диск при 2400 оборотах в минуту в течение 10 сек.
- Мера хемилюминесценции сигналы от прореагировавшего раствора субстрата с использованием фотоумножителя (ФЭУ) модуль есть системы обнаружения.
Примечание: Система обнаружения является несерийный машина с использованием следующих частей: шаг двигателя, оптико-механические компоненты, этапы перевода, и коммерчески доступные PMT. В оптико-механические части и шаговый двигатель собираются держать устройство, и двигатель может вращаться диск. Детектирование осуществляется ФЭУ закрепляются на оптико-механической части, и она расположена над камерами обнаружения устройства. Управляя шаговым двигателем, камеры обнаружения выровнены прямо ниже зоны обнаружения ФЭУ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот протокол, полностью автоматизированный центробежный микрожидкостных устройство для обнаружения белка из цельной крови с высокой чувствительностью был подготовлен. В TiO 2 NF маты были подготовлены процессы электроформования и кальцинации. Для того, чтобы изготовить ООПП нужного диаметра, морфологии и толщины, электроформования условий, таких как скорость потока, напряжения и прядильной времени были оптимизированы. Если условия не были оптимизированы, качество NFs образованных был беден. В частности, НФ не были выделены из раствора полимера при низком напряжении (5 кВ), и были разбиты, когда напряжение было высоким (> 20 кВ). Точно так же, прядение время было критическим для изготовления NFs с соответствующей плотности, не слишком разреженным (1 мин) или слишком плотная (30 мин). Кроме того, чтобы избежать образования шарика, вызванное высокой скоростью потока, скорость потока манипулировали. Таким образом, приложенное напряжение 15 кВ, 10 мин Время электроформования и скорости потока 0,3 мл ч
TiO 2 Н.Ф. мат был успешно передан на целевой подложке с помощью адгезивного PDMS слой, который был подготовлен с помощью ПДМС спин-покрытие на силанизированном кремниевой подложке и предварительно отверждение в печи при температуре 65 ° C. Время для предварительного отверждения слоя PDMS была оптимизирована путем проверки силу сцепления, с помощью теста на липкости (рисунок 2А). Фигура 2В показывает действие на время отверждения прикрепления нановолокон. Если ПДМС нагревали в течение 3 мин, не сила адгезии как ПДМС все еще не затвердевшего и остается в виде жидкости и ООПП был встроен в слой PDMS. При его нагревании в течение 30 мин, сила адгезии очень слаба, поскольку ПДМС становится жесткой и теряет свою липкую собственность и ООПП не были прикреплены на нем. Когда PDMS нагревали FOг 10 мин, PDMS показал сильную силу адгезии и ООПП были сильно привязаны. Из результатов, можно сделать вывод, что оптимальное время для предварительного отверждения PDMS для сильного прикрепленного 10 мин.
После сборки диска, иммунологический анализ был проведен на TiO 2 NF мат интегрированный диск, выполнив серию операций диска процессов, которые перечислены в таблице 1. Для определения концентрации СРБ и cTnI в неизвестных образцах, калибровочные графики для каждого были сделаны путем построения графика относительные световые единицы (RLU) по сравнению с ГОС или концентрации cTnI (рисунок 3). На фигуре 3А и 3В, результаты анализа на-диске, сравнивали с обычным ELISA на 96-луночный планшет для СРБ и cTnI соответственно. Анализы демонстрировали широкий линейный динамический диапазон с пределом обнаружения 0,8 пг / мл (~ 6 Fm) для СРБ и 37 пг / мл (1,5 Pm) для cTnI на диске, которыйпримерно в 300 раз выше, для реактивного белка и в 20 раз выше по сравнению с cTnI их соответствующими обычными результатами ELISA (286 пг / мл, 2,3 пм для CRP; 824 пг / мл, 32 пм для cTnI).
Рисунок 1. Оптимизация условий электроформования. СЭМ изображения при каждом условии показывают морфологии NFs образованных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Тест липкость клея PDMS слоя и СЭМ изображения передаваемого TiO 2 NF мата. (А) Адгезия сила клеяPDMS слой, предварительно отверждают в течение нескольких периодов времени, (В) СЭМ изображения нановолокон , прикрепленных на PDMS излеченных для различных промежутков времени. Эта цифра была изменена из работы. 21. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Калибровка графики для обнаружения СРБ и cTnI с использованием лабораторного на-диска и 96-луночного планшета. Обнаружение CRP в CRP шипами , свободной от сыворотки (A) и cTnI подскочили в цельной крови (В) были проведены. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение по меньшей мере трех независимых измерений. Предел обнаружения (LOD) была рассчитана в 3 раза стандартного отклонения данных отрицательного контроля, измеренного с CRP свободной сыворотки или цельной крови без cTnI для пикиСРБ и cTnI, соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Спин No. | Скорость (оборотов в минуту) | Клапан No. | Время (сек) | операция | |||
| 1 | 3600 | 60 | разделение крови | ||||
| 2 | 2.400 | 1 | 3 | открытый клапан для переноса плазмы в камеру, содержащую 8 мкл обнаружения антител, конъюгированных с HRP | |||
| 3 | 15 Гц, 15 ° | 5 | смешивать плазму и выявления антител | ||||
| 4 </ TD> | 2.400 | 2 | 3 | открытый клапан для переноса смеси в реакции связывания камеры | |||
| 5 | 60 Гц, 2 ° | 1200 | перемешайте захвата антител на TiO 2 NF мат и плазменные обнаружения антител смеси | ||||
| 6 | 2.400 | 3 | 10 | открытый клапан для удаления смеси | |||
| 7 | 2.400 | 4 | 4 | открытый клапан для передачи промывочный буфер | |||
| 8 | 30 Гц, 30 ° | 120 | смешать промывочный буфер и промыть TiO 2 NF коврик | ||||
| 9 | 2.400 | 4 | передача промывочный буфер | ||||
| 10 | 30 Гц, 30 ° | 120 | 2 NF коврик | ||||
| 11 | 2.400 | 4 | передача промывочный буфер | ||||
| 12 | 30 Гц, 30 ° | 120 | смешать промывочный буфер и промыть TiO 2 NF коврик | ||||
| 13 | 2.400 | 4 | передача промывочный буфер | ||||
| 14 | 30 Гц, 30 ° | 120 | смешать промывочный буфер и промыть TiO 2 NF коврик | ||||
| 15 | 2.400 | 20 | удаления оставшегося моющего буфера | ||||
| 16 | 5 | закрываемый клапан | |||||
| 17 | 2.400 | 6 | 10 | открытая vAlve и передачи хемилюминесцентного субстрата | |||
| 18 | 30 Гц, 2 ° | 60 | смешать субстрат и иммунореагенты на TiO 2 NF мата | ||||
| 19 | 2.400 | 7 | 10 | открытый клапан и передать прореагировавшего субстрата в камеру детектирования | |||
| Общее время | ~ 30 мин | ||||||
Таблица 1. Программа работы для иммуноферментного анализа в круге. Эта таблица была изменена из работы. 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ на TiO 2 NF интегрированный диск представляет собой быстрый, недорогой и удобной техникой для сверхчувствительного обнаружения низких обильных белков , присутствующих в очень небольшом объеме крови. Этот метод имеет то преимущество, что с помощью небольших объемов образцов (10 мкл) и поддается для анализа множества проб одновременно. Это обеспечивает большой потенциал как мультиплексирование иммуноанализа устройства. Устройство имеет дополнительное преимущество в том, что он не требует пробоподготовки шагов, таких как разделение плазмы, которые необходимы в обычных ELISAs. Кроме того, устройство может выполнять целые процедуры иммуноферментного анализа (например, смешивание, мойка, связывание и т.д.) автоматически из - за заранее разработанных камер, каналов и клапанов. Кроме того, с использованием методов изготовления коммерциализировать дисков (например, литье под давлением, УФ / ультразвуковой / термоскрепления) вместо фрезерования и ручной сборки с помощью клея, вся процедура от изготовления устройства для анализа может бытьавтоматизирован.
Кроме того, способ передачи печать, представленная здесь показан простой и легкий перенос electrospun NF от донора к целевому подложки за счет использования тонкого слоя клея PDMS. В общем случае , TiO 2 НФ , полученные после процесса прокаливания являются хрупкими и легко отслаиваться от заземленной подложки из - за слабой адгезии. 25 Благодаря характерной ломкостью, интегрировании TiO 2 NF матов с другими устройствами трудно. Чтобы решить эту проблему, было зарегистрировано много методов. Например, горячий пресс 26 и растворителя паров 27 методик показал повышение адгезии между TiO 2 Nfs мата и поверхности мишени до процесса прокаливания. Даже если эти методы позволили повысить адгезию, что TiO 2 NF маты не были неповрежденными из - за высокого механического давления или растворитель , применяемые в ходе соответствующих методов. Кроме того, из - за стадии прокаливания, интеграция TiO 2 </ Суб> NF коврики с использованием этих методов может быть применен только для ограниченных целевых поверхностей.
Насколько нам известно, это первый метод, чтобы показать трансфертного печать NF матов на устройстве из термопластов, сохраняя при этом новые свойства NFs даже после передачи. Для повышения производительности устройства, изготовление высококачественных NFs и оптимизация условий предварительного отверждения желательно. Как было упомянуто в протоколе, время, необходимое для предварительного отверждения может варьироваться в зависимости от условий окружающей среды; Поэтому условия предварительного отверждения должны быть оптимизированы путем измерения силы адгезии с использованием липкость теста.
Кроме того, протокол, представленный здесь, обеспечивает умелые направляющие для полностью автоматизированного процесса ELISA на диске. Протокол вводит не только изготовление диска, но и автоматизацию всех процессов, необходимых для ELISA, в том числе разделения цельной крови, измерение, смешивания, промывки и обнаружения.Каждый шаг оптимизирован со скоростью вращения, смесительной частоты и времени работы. На основе этой операции руководства, реагенты, загруженные на диске могут быть переданы с использованием одного двигателя. Поскольку устройство выполнено отличную чувствительность обнаружения с очень низким объемом крови, он обеспечивает большой потенциал для диагностических применений путем скрининга биомаркеров на ранней стадии болезни. Устройство будет иметь возможность обнаружения любого биомаркера в зависимости от наличия своих специфических антител.
Хотя устройство с TiO 2 NF матов достигается весьма повышенной чувствительностью из - за большой площади поверхности матов, один из оставшихся вызов этого метода может быть в массовом производстве однородных NF матов. Поскольку чувствительность ELISA сильно зависит от площади поверхности мата нановолокна, очень важно, чтобы достичь не только высокую площадь поверхности, но и воспроизводимый и равномерный площадь поверхности в разных партиях массового производства. В заключение, мы показали простой способ интегрировать хрупкий NF мат в функциональное устройство для сверхчувствительного обнаружения белка. Преимущества этого метода заключаются в следующем: 1) ранее electrospun TiO 2 НФ может быть получен только на электропроводящие и термостойких поверхностей; здесь, мы показали, что они могут быть перенесены на любую подложку, содержащую непроводящих и пластиковых материалов; 2) TiO 2 NF маты могут выдержать давление и остаются стабильными в течение стадии промывки из - за высокой силы адгезии слоя PDMS; 3) он обеспечивает относительно большую площадь поверхности для биопроб; и 4) антитела могут быть ковалентно присоединены к TiO 2 NFs благодаря интактных свойств поверхности на NFs. Этот метод имеет большой потенциал для использования для интеграции нановолоконные материалов в устройствах для различных областей применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным исследовательским фондом Кореи (NRF) грантов (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), грант от Корейского медицинских технологий R & D проекта, Министерство здравоохранения и социального обеспечения (A121994) и IBS-R020-D1, финансируемой правительством Кореи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III - ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
References
- Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
- Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
- Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. Biosensors and Cancer. , Science Publishers. 164-183 (2012).
- Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , Pan Stanford Publishing. 265-282 (2011).
- Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).
- Yang, D., et al. Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV. Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).
- Chantasirichot, S., Ishihara, K. Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system. Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).
- Zhang, N., et al. Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).
- Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics. Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).
- Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).
- Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles. Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).
- Liu, S., Chen, A. Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing. Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).
- Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts. J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).
- Dettin, M., et al. Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).
- Kim, W. -J., et al. Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group. Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).
- Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -G. Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).
- Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays. Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors. Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).
- Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays. ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).
- Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -R., Park, Y. -S., Cho, Y. -K. Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood. Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).
- Li, D., Xia, Y. Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning. Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).
- Lombard, M. SolidWorks 2013 BIBLE. , John Wiley & Sons Inc. Indianapolis, IN. (2013).
- Tickoo, S. EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , CADCIM Technologies. Schererville, IN. (2007).
- Zhu, R., et al. Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices. Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).
- Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -P. TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells. Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).
- Katsuhiro, O., et al. Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications. Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).
