Introduction
Varias plataformas para el diagnóstico de la enfermedad se han desarrollado sobre la base de materiales a nanoescala 1,2 tales como nanocables, 3 nanopartículas, nanotubos de 4, 5 y nanofibras (NFS) 6-8. Estos nanomateriales ofrecen excelentes perspectivas en el diseño de nuevas tecnologías para bioensayos altamente sensibles debido a sus propiedades físico-químicas únicas. Por ejemplo, las nanofibras de óxido de zinc mesoporoso se han utilizado para la detección sensible femto-molar de biomarcadores de cáncer de mama. 9 Recientemente, los nanomateriales a base de dióxido de titanio (TiO 2) han sido exploradas para aplicaciones bioanalíticos 10 teniendo en cuenta su estabilidad química, 11 desnaturalización de la proteína insignificante , 12 y biocompatibilidad. 13 Además, los grupos hidroxilo en la superficie de TiO 2 facilitar la modificación química y la unión covalente de biomoléculas. 14,15 modelado TiO 2 thin películas 16 o TiO 2 nanotubos 17 se han utilizado para mejorar la sensibilidad de detección de una proteína diana por aumento de la superficie; sin embargo, el proceso de fabricación es bastante complejo y requiere un equipo caro. Por otra parte, las federaciones nacionales electrospun están recibiendo atención debido a su gran área de superficie, así como proceso sencillo y fabricación de bajo costo; 18,19 sin embargo, la característica frágiles o suelto de la electrospun TiO2 NF tapete hace que sea difícil de manejar y integrar con los dispositivos de microfluidos. 6,20 por lo tanto, las esteras de TiO2 NF rara vez se utilizan en aplicaciones de bioanálisis, particularmente aquellos que requieren condiciones de lavado agresivos.
En este estudio, para superar estas limitaciones, hemos desarrollado una nueva tecnología para la transferencia de la electrospun NF esteras sobre la superficie de cualquier sustrato diana mediante la utilización de una capa de adhesivo de polidimetilsiloxano delgada (PDMS). Furthermore, hemos demostrado con éxito la integración de electrospun TiO 2 NF esteras en un dispositivo de microfluidos centrífuga de policarbonato (PC). El uso de este dispositivo, una detección de alta sensibilidad, totalmente automatizado e integrado de la proteína C-reactiva (CRP), así como la troponina I cardíaca (cTnI) se logró en 30 min a partir de solamente 10 l de sangre entera. 21 Debido a la combinación ventajas de las propiedades de los NF y la plataforma centrífuga, el ensayo exhibieron una amplia gama dinámica de seis órdenes de magnitud de 1 pg / ml (~ 8 fM) a 100 ng / ml (~ 0,8 pM) con un límite inferior de detección de 0,8 pg / ml (~ 6 fM) para la PCR y un rango dinámico de 10 pg / ml (~ 0,4 pM) a 100 ng / ml (~ 4 nM) con un límite de detección de 37 pg / ml (~ 1,5 pM) de cTnI. Estos límites de detección son ~ 300 y ~ 20 veces menor en comparación con sus correspondientes resultados de ELISA convencionales. Esta técnica se podría aplicar para la detección de cualquier proteína objetivo, con los anticuerpos apropiados. En general, este dispositivo de coULD contribuyen en gran medida en el diagnóstico in vitro y ensayos bioquímicos ya que puede detectar cantidades raras de proteínas diana con gran sensibilidad incluso de cantidades muy pequeñas de muestras biológicas, por ejemplo, 10 l de sangre entera. A pesar de que sólo demostró la detección de proteínas de suero usando ELISA en este estudio, la tecnología de transferencia e integración de electrospun NFS con dispositivos de microfluidos podría aplicarse más ampliamente en otras reacciones bioquímicas que requieren una gran área superficial para la alta sensibilidad de detección.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Se extrajo sangre de individuos sanos y se recogió en un tubo de recogida de sangre. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los voluntarios.
1. La fabricación de TiO2 NF Mat
- Preparación de solución de precursor 22
- Disolver 1,5 g de tetraisopropóxido de titanio (TTIP) en una mezcla de etanol (99,9%, 3 ml) y ácido acético glacial (3 ml) y se mezcla la solución a temperatura ambiente (25 ° C) durante 30 min en un agitador magnético.
- Disolver 11% en peso de polivinilpirrolidona (PVP) en 3,64 g de etanol (99,9%) y se agita la solución a 65 ° C durante 1 hora usando un agitador magnético de la placa caliente.
- Combinar y agitar las dos soluciones a 65 ° C durante 4 horas en un agitador magnético de la placa caliente.
- electrospinning
- Cargar la solución preparada en una jeringa conectada a una aguja de acero inoxidable de 200 micras Diame interiorter. Verter la solución directamente en la jeringa después de retirar el émbolo.
- Introducir la solución constantemente a una velocidad de flujo de 0,3 ml / h durante 10 min sobre una oblea de Si (2 cm x 2 cm) se coloca sobre un sustrato conectado a tierra a un voltaje DC elevado (15 kV). Durante el electrospinning, ajustar la distancia entre la aguja y el sustrato de tierra a 10 cm.
- La calcinación de la estera de NF
- Coloca la base de NF en un horno y aumentar la temperatura hasta 500 ° C con una tasa de rampa de 3 ° C / min en condiciones de alto vacío (5 x 10 -5 torr).
- Mantener la temperatura a 500 ° C durante 3 hr. Enfriar la temperatura de las muestras a la RT (25 ° C) en el horno.
2. Integración de TiO2 NF Mat en una centrífuga de discos de microfluidos
- La fabricación de un disco
- Utilice el software de diseño 3D (por ejemplo, SolidWorks o similar) para representar cámaras, canales, o válvulas de cada capa de disco. Convertir los archivos de diseño a código informático de control numérico (CNC) utilizando el código de generación de software (por ejemplo, Edgecam o similar). Utilizar los softwares de acuerdo con el manual de instrucciones 23,24 Nota:. Las dimensiones de los canales típicos utilizados en este dispositivo son de 1,0 mm x 0,3 mm (anchura x profundidad).
- Abra el software de funcionamiento de la máquina fresadora CNC (por ejemplo., DeskCNC o similar) y cargar el código CNC para el software operativo y haga clic en el siguiente orden: "AUTO" -> "G CÓDIGO ABIERTO" -> Seleccione el código CNC generado.
- Fije la placa de PC en la máquina fresadora CNC: utilizar placas de 1 mm de PC para la capa superior y placas de PC 5 mm para la capa de disco. Hacer funcionar la máquina fresadora CNC para cortar cada capa del disco haciendo clic en el botón "START".
- Transferencia de TiO 2 NF estera en el disco
- Colocar un sustrato de silicio y una pequeña placa de Petri que contiene 40 l de (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-triclorosilano en una cámara de vacío bajo vacío durante 30 min. El fluorosilano se vaporiza y se reviste sobre el sustrato.
- Mezclar polidimetilsiloxano (PDMS) pre-polímero con un agente de curado en una relación de 10: 1 y desgasificar en una cámara de vacío. Spin-capa de PDMS sobre un sustrato de silicio a 650 rpm durante 60 segundos.
- Curar los PDMS revestidas sobre el sustrato de silicio en un horno a 65 ° C durante 10 min para lograr un estado adherente.
NOTA: Tiempo de curado se puede variar dependiendo de las condiciones ambientales, y la fuerza de adhesión puede ser probada mediante un ensayo de pegajosidad utilizando un reómetro. - La transferencia de la estera de TiO2 NF preparado por electrospinning y calcinación en la silicona PDMS-revestidas utilizando una pinza. A continuación, aplicar manualmente una presión conforme en el TiO2 NF estera transferido con un objeto plano (por ejemplo., Portaobjetos de vidrio) y extraer el objeto. Poneresta muestra en el horno a 65 ° C durante 4 horas o a 80 ° C durante 1 hora para curar la capa de PDMS completamente.
- Escudo cámaras de reacción de unión en el disco con 20 l el / curado mezcla de agente de PDMS (10: 1), que actúa como una capa adhesiva para fijar TiO 2 NF estera en el disco.
- Dispensar 50 l de etanol (99,9%) sobre el TiO 2 NF estera en la capa de PDMS, cortar la estera de NF con una perforación de orificios de 6 mm de diámetro, y transferir el corte TiO 2 NF estera a las cámaras de reacción de unión recubiertas con 20 l de los PDMS en el paso anterior.
NOTA: En este paso, el etanol será útil para separar el corte TiO2 NF estera del sustrato de Si. - Incubar el TiO2 NF esterilla integrada en el disco en el horno a 65 ° C durante 4 horas o a 80 ° C durante 1 hora para curar el PDMS por completo.
- Modificación de la superficie del TiO2 NF estera en el disco
- Prepare 1% v / v de (3-glicidoxipropil) silano methyldiethoxy (GPDES) en etanol (99,9%).
- Se trata el disco integrada TiO2 NF estera con plasma de oxígeno a 140 W, el flujo de oxígeno de 50 sccm de 180 seg. Dispensar 100 l de solución de GPDES en cada estera de nanofibras y se incuba a RT (25 ° C) durante 2 hr.
- Lavar el sustrato brevemente por la dispensación de etanol (99,9%) usando una botella de lavado, a continuación, eliminar el etanol completamente invirtiendo el disco y secante contra una toallita limpia. De curado a 80 ° C durante 1 hr. Lavar dos veces con etanol (99,9%) de la misma manera como se indicó anteriormente, para eliminar las moléculas adsorbidas físicamente GPDES y no unidos.
- Secar con una corriente de nitrógeno, seca al vacío.
NOTA: El disco puede ser almacenado en un recipiente sellado a temperatura ambiente (25 ° C) hasta su uso.
- Inmovilización de anticuerpos sobre la superficie
- Hacer una solución de 200 g / ml de anticuerpos de captura (anti ratón monoclonalhsCRP humano o de ratón monoclonal anti-cTnI) diluyendo los anticuerpos con un tampón de fosfato salino tamponado (PBS) (pH 7,4). Dispensar 5 l de la solución sobre cada estera de NF en un disco utilizando una micropipeta. Ver la lista de materiales para obtener más información acerca de los anticuerpos.
- Mantener los discos en una cámara humidificada y se incuba a 37 ° C durante 4 h. Lavar los anticuerpos recubiertos NF estera con tampón PBS-BSA al 0,1%. Llenar la cámara con 100 l de tampón de lavado utilizando una micropipeta, eliminar el tampón por aspiración o decantación. Por último, invertir el disco y borrar contra un trapo limpio, y luego montar el disco.
- conjunto de discos
- Dibujar el diseño del disco en la cinta adhesiva de doble lado con un programa de CAD (por ejemplo, AutoCAD o similar). Cargar el diseño CAD para el plotter de corte.
- Cortar la cinta adhesiva de doble cara utilizando el plotter de corte. Pelar una capa de protección de la cinta adhesiva de doble y adjuntar it en la parte superior de la capa de disco. Despegar la otra capa de protección y unir la capa superior de la capa de disco.
- Cargar el disco montado de forma preliminar en la máquina de prensado y alinear con precisión las capas superior / adhesivo / disco utilizando las marcas de alineación en cada capa para conectar cada una de las válvulas, canales y cámaras. Aplique presión conforme el uso de la máquina de prensado.
3. Inmunoensayo
- Llenar las cámaras con tampón BSA-PBS al 1% utilizando una micropipeta y se incuba el disco a 37 ° C durante 1 hr. Eliminar el tampón por aspiración utilizando una micropipeta. Realice este paso para bloquear los sitios sin reaccionar y para reducir la adsorción no específica de la proteína en un disco.
- Lavar dos veces con 0,1% BSA-PBS por llenado y aspiración de las cámaras utilizando una micropipeta.
NOTA: En esta etapa el disco se puede almacenar a 4 ° C hasta su uso. - Carga de 10 l de sangre entera antígeno-enriquecida o suero libre de PCR para la detección de la PCR en el disco utilizando un micropipettmi. Para hacer los gráficos de calibración, utilizar concentraciones de CRP de 1 pg / ml a 100 ng / ml; y cTnI de 10 pg / ml a 100 ng / ml.
Nota: debido a los mayores niveles de CRP en la sangre total, que es generalmente en el rango de M, se utilizó suero libre de CRP para demostrar el bajo límite de detección del dispositivo. - Girar el disco a 3600 rpm (391 xg) durante 60 segundos para separar las células de sangre rojas.
- Abrir la válvula # 1 por la irradiación con láser, y la transferencia de 4 l de plasma sobrenadante a la cámara que contiene 8 l de la detección de anticuerpos conjugados con HRP haciendo girar el disco a 2400 rpm durante 3 seg.
NOTA:. Los procesos generales de actuación de la válvula y la visualización de la operación de disco se describen en detalle en un informe anterior 21 - Aplicar un modo de mezcla (15 Hz s -1, 15 °) durante 5 segundos para la unión de los anticuerpos de proteínas y detección.
- Abrir la válvula # 2, y transferir la mezcla preparada en la etapa 6 a la cámara de reacción de unión (2400 rpm, 3 seg). A continuación, aplicar un modo de mezcla (60 Hz s -1, 2 °) durante 20 minutos para lograr una inmunoreacción entre la mezcla y los anticuerpos de unión en los TiO 2 NFS. Después de la reacción, la válvula abierta # 3 y transferir la mezcla residual a la cámara de residuos (2.400 rpm, 10 sec).
- Transferir el tampón de lavado (600 l) a la cámara de reacción de unión mediante la apertura de la válvula # 4 y hace girar el disco (2400 rpm, 4 segundos). A continuación, aplicar un modo de mezcla (30 Hz s-1, 30 °) durante 120 segundos para lavar las federaciones nacionales de TiO2 en la cámara.
- Se lavan las federaciones nacionales de TiO2 dos veces más siguiendo misma condición del paso 3.8, y eliminar el tampón de lavado residual por completo haciendo girar el disco a 2.400 rpm durante 20 segundos. A continuación, cierre la válvula # 5.
- Para la reacción quimioluminiscente, aplicar un modo de mezcla (30 Hz s -1, 2 °) durante 1 min después de la transferencia de la solución de sustrato quimioluminiscente a la cámara de reacción de unión mediante la apertura de la válvula # 6 e hilaturael disco a 2400 rpm durante 10 seg posteriormente.
- Transferir la solución de sustrato reaccionado a las cámaras de detección mediante la apertura de la válvula # 7 y girando el disco a 2400 rpm durante 10 s.
- Medir las señales de quimioluminiscencia de la solución de sustrato reaccionado usando un tubo fotomultiplicador (PMT) módulo equipado sistema de detección.
NOTA: El sistema de detección es una máquina hecha a la medida usando las siguientes partes: motor paso a paso, los componentes óptico-mecanicos, platinas de traslación, y PMT disponible en el mercado. Las partes y óptico-motor paso a paso se ensamblan para mantener el dispositivo, y el motor puede girar el disco. La detección se realiza por PMT fija en las partes óptico-mecanicos, y se encuentra por encima de las cámaras de detección del dispositivo. Mediante la manipulación del motor paso a paso, las cámaras de detección están alineados justo debajo de la zona de detección de PMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El uso de este protocolo, un dispositivo de microfluidos centrífuga totalmente automatizado para la detección de proteínas de la sangre total se preparó con una alta sensibilidad. Las esteras de TiO2 NF fueron preparados por los procesos de electrospinning y calcinación. Con el fin de fabricar el FNs de diámetro deseado, la morfología y espesor, electrospinning condiciones tales como velocidad de flujo, tensión, y el tiempo de hilado fueron optimizados. Cuando las condiciones no se optimizaron, la calidad de los FNs formados era pobre. En particular, NFS no se hilaron a partir de la solución de polímero a bajo voltaje (5 kV), y se rompieron cuando la tensión fue alta (> 20 kV). Del mismo modo, el tiempo de hilado era crítica para la fabricación de NFS con la densidad adecuada, no demasiado escasa (1 min) o demasiado denso (30 min). Además, para evitar la formación de esferas causada por altas velocidades de flujo, se manipuló la tasa de flujo. Por lo tanto, un voltaje aplicado de 15 kV, tiempo de electrospinning 10 min y una velocidad de flujo de 0,3 ml hr
El TiO 2 NF estera se ha transferido correctamente sobre el sustrato de destino mediante una capa de PDMS adhesivo, que fue preparado por PDMS-recubrimiento por rotación sobre un sustrato de silicio silanizada y pre-curado en un horno a 65 ° C. El tiempo para pre-curar la capa de PDMS se optimizó mediante la comprobación de la fuerza de adhesión, utilizando un ensayo de pegajosidad (Figura 2A). La Figura 2B muestra el efecto de tiempo de curado en el apego de nanofibras. Si el PDMS se calentó durante 3 min, no hay ninguna fuerza de adhesión como el PDMS estaba todavía sin curar y permanece como un líquido y los NF quedó incrustada en la capa de PDMS. Cuando se calienta durante 30 min, la fuerza de adherencia es muy débil como el PDMS se endurece y pierde su propiedad pegajosa y las federaciones nacionales no están adjuntas en él. Cuando los PDMS se calentó for 10 min, el PDMS mostró una fuerte fuerza de adhesión y los NF se une fuertemente. De los resultados, se concluye que el momento óptimo para PDMS pre-curado para accesorio fuerte es 10 min.
Después del montaje del disco, el inmunoensayo se llevó a cabo en el TiO 2 NF estera de disco integrado siguiendo una serie de procesos de operación de disco que se enumeran en la Tabla 1. Para la determinación de las concentraciones de PCR y de cTnI en las muestras desconocidas, gráficos de calibración para cada uno se hicieron mediante el trazado las unidades relativas de luz (RLU) frente a la PCR o la concentración de cTnI (Figura 3). En la Figura 3A y 3B, los resultados del ensayo de discos se compararon con ELISA convencional en una placa de 96 pocillos para PCR y cTnI respectivamente. Los ensayos mostraron un amplio rango dinámico lineal con un límite de detección de 0,8 pg / ml (~ 6 FM) para CRP y 37 pg / ml (1,5 pM) para cTnI en un disco, el cuales aproximadamente 300 veces mayor para CRP y 20 veces mayor para cTnI en comparación con sus respectivos resultados convencionales de ELISA (286 pg / ml, 2,3 pM para CRP; 824 pg / ml, 32 pM para cTnI).
Figura 1. Optimización de las condiciones de electrospinning. Imágenes de SEM en cada condición muestran la morfología de las federaciones nacionales formados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. prueba Tack de la capa de adhesivo y PDMS imágenes de SEM de la TiO 2 NF estera transferido. (A) Fuerza de adhesión del adhesivoCapa de PDMS, pre-curado durante varios períodos de tiempo, (B) imágenes de SEM de nanofibras adjuntos en PDMS curadas durante períodos de tiempo distintos. Esta cifra se ha modificado de la Ref. 21. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Los gráficos de calibración para la detección de la PCR y cTnI usando lab-on-a-disco y placa de 96 pocillos. La detección de la PCR se dispararon en el suero libre de CRP (A) y cTnI se dispararon en la sangre entera (B) se llevaron a cabo. Las barras de error indican la desviación estándar de al menos tres mediciones independientes. El límite de detección (LOD) se calculó por 3 veces de la desviación estándar de los datos de control negativo medido con suero libre de CRP o sangre entera sin cTnI de adición para laPCR y cTnI, respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nº de centrifugado | Velocidad (rpm) | Válvula Nº | Tiempo (seg) | Operación | |||
| 1 | 3.600 | 60 | separación de la sangre | ||||
| 2 | 2,400 | 1 | 3 | válvula abierta para transferir el plasma en la cámara que contiene 8 l de la detección de anticuerpos conjugados con HRP | |||
| 3 | 15 Hz, 15 ° | 5 | plasma y la detección de anticuerpos de la mezcla | ||||
| 4 </ Td> | 2,400 | 2 | 3 | válvula abierta para transferir la mezcla en la cámara de reacción de unión | |||
| 5 | 60 Hz, 2 ° | 1,200 | mezclar anticuerpos de captura en la estera de TiO2 NF y los anticuerpos plasmáticos de detección de mezcla | ||||
| 6 | 2,400 | 3 | 10 | válvula abierta para remover la mezcla | |||
| 7 | 2,400 | 4 | 4 | válvula abierta para transferir tampón de lavado | |||
| 8 | 30 Hz, 30 ° | 120 | mezclar tampón de lavado y lavar TiO2 NF estera | ||||
| 9 | 2,400 | 4 | tampón de lavado transferencia | ||||
| 10 | 30 Hz, 30 ° | 120 | TiO2 estera NF | ||||
| 11 | 2,400 | 4 | tampón de lavado transferencia | ||||
| 12 | 30 Hz, 30 ° | 120 | mezclar tampón de lavado y lavar TiO2 NF estera | ||||
| 13 | 2,400 | 4 | tampón de lavado transferencia | ||||
| 14 | 30 Hz, 30 ° | 120 | mezclar tampón de lavado y lavar TiO2 NF estera | ||||
| 15 | 2,400 | 20 | eliminar el tampón de lavado restante | ||||
| dieciséis | 5 | cierre la válvula | |||||
| 17 | 2,400 | 6 | 10 | v abiertoalve y transferir el sustrato quimioluminiscente | |||
| 18 | 30 Hz, 2 ° | 60 | sustrato y los reactivos inmunitarios en TiO2 NF estera de mezclar | ||||
| 19 | 2,400 | 7 | 10 | abrir la válvula y transferir el sustrato reaccionado a la cámara de detección | |||
| Tiempo Total | ~ 30 min | ||||||
Tabla 1. Programa de Operación para el inmunoensayo en un disco. Esta tabla se ha modificado de la Ref. 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El ensayo en TiO 2 NF disco integrado es una técnica rápida, de bajo costo y conveniente para la detección ultrasensible de proteínas de baja abundancia presentes en muy bajo volumen de sangre. Esta técnica tiene la ventaja de usar pequeños volúmenes de muestra (10 l) y es susceptible para el análisis de múltiples muestras simultáneamente. Esto proporciona un gran potencial como un dispositivo de multiplexación inmunoensayo. El dispositivo tiene la ventaja de que no requiere etapas de pretratamiento de la muestra, como la separación de plasma, que son necesarios en los ELISA convencionales. Además, el dispositivo puede llevar a cabo procedimientos de inmunoensayo enteros (por ejemplo, mezcla, lavado, unión etc.) de forma automática debido a cámaras de pre-diseñadas, canales y válvulas. Además, el uso de métodos de fabricación de discos comercializados (por ejemplo, moldeo por inyección, UV / ultrasonidos / unión térmica) en lugar de la molienda y montaje manual utilizando adhesivos, todo el procedimiento de fabricación del dispositivo de análisis puede serautomatizado.
Además, el método de transferencia de impresión que aquí se presenta muestra una transferencia simple y fácil de electrospun NF del donante al sustrato diana mediante la utilización de una capa de PDMS adhesiva delgada. En general, los TiO 2 FNs obtenidos después del proceso de calcinación son frágiles y fácilmente se despegan del sustrato conectado a tierra debido a la adhesión débil. 25 Debido a su fragilidad característica, la integración de los TiO 2 esteras de NF con otros dispositivos es difícil. Para solucionar esto, se ha informado de muchos métodos. Por ejemplo, prensado en caliente 26 y solvente de vapor de 27 técnicas mostraron la mejora de la adherencia entre las federaciones nacionales de TiO2 estera y la superficie de destino antes de proceso de calcinación. Aunque estos métodos aumentan la adherencia, los TiO 2 esteras NF no estaban intactos debido a la alta presión mecánica o el disolvente aplican durante las técnicas respectivas. Además, debido a la etapa de calcinación, la integración de la TiO 2 </ Sub> esteras NF utilizando estos métodos pueden ser aplicados sólo para superficies de destino limitados.
A lo mejor de nuestro conocimiento, esta es la primera técnica para demostrar la transferencia de impresión de alfombras de NF a un dispositivo hecho de termoplásticos, conservando las propiedades novedosas de las federaciones nacionales, incluso después de la transferencia. Para un mejor rendimiento del dispositivo, se desean fabricación de alta calidad de las federaciones nacionales y la optimización de las condiciones de pre-curado. Como se ha mencionado en el protocolo, el tiempo requerido para la pre-curado pueden variar en función de las condiciones ambientales; por lo tanto, las condiciones de pre-curado son para ser optimizado mediante la medición de la fuerza de adhesión usando un ensayo de pegajosidad.
Por otra parte, el protocolo presentado aquí, proporciona guías hábiles para el proceso de ELISA completamente automatizado en un disco. El protocolo no sólo introduce la fabricación del disco, sino también la automatización de todos los procesos necesarios para ELISA, incluyendo la separación de sangre entera, medición, mezcla, lavado y detección.Cada paso está optimizado con velocidad de centrifugado, la frecuencia de mezcla, y el tiempo de operación. Con base en esta guía de funcionamiento, los reactivos cargados en un disco pueden ser transferidos utilizando un solo motor. Puesto que el dispositivo lleva a cabo una excelente sensibilidad de detección con muy bajo volumen de sangre, que proporciona un gran potencial para aplicaciones de diagnóstico por detección de biomarcadores en una etapa temprana de la enfermedad. El dispositivo podría estar habilitado para detectar cualquier biomarcador en función de la disponibilidad de sus anticuerpos específicos.
Aunque el dispositivo con esteras de TiO 2 NF Conseguido altamente mejorada sensibilidad debido a la gran superficie de las esteras, uno de los reto restante de esta técnica podría ser en la producción en masa de esteras uniformes NF. Debido a la sensibilidad de la prueba ELISA es fuertemente afectada por el área superficial de la estera de nanofibras, es fundamental para lograr no sólo un área de alta superficie, sino también una superficie reproducible y uniforme en diferentes lotes de producción en masa. En conclusión, hemos demostrado un método simple para integrar una estera de NF frágil en un dispositivo funcional para la detección de proteínas ultrasensible. Las ventajas de este método son los siguientes: 1) previamente electrospun TiO 2 FNs podrían preparar sólo en superficies conductoras y térmicamente estables; Aquí, hemos demostrado que pueden ser transferidas a cualquier sustrato incluyendo materiales no conductores y plástico; 2) las esteras de TiO 2 NF pueden resistir la presión y permanecer estable durante las etapas de lavado debido a la alta fuerza de adhesión de la capa de PDMS; 3) que proporciona un área superficial relativamente mayor para bioensayos; y 4) los anticuerpos se pueden unir covalentemente a los TiO 2 FNs debido a las propiedades de la superficie intactas en NFS. Esta técnica tiene un gran potencial para ser utilizado para la integración de los materiales de nanofibras en dispositivos para diversas aplicaciones.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) subvenciones (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), una subvención de la tecnología de la salud R coreana + D Proyecto, Ministerio de Salud y Bienestar Social (A121994) y el SII-R020-D1 financiado por el Gobierno de Corea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III - ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
References
- Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
- Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
- Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. Biosensors and Cancer. , Science Publishers. 164-183 (2012).
- Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , Pan Stanford Publishing. 265-282 (2011).
- Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).
- Yang, D., et al. Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV. Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).
- Chantasirichot, S., Ishihara, K. Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system. Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).
- Zhang, N., et al. Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).
- Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics. Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).
- Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).
- Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles. Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).
- Liu, S., Chen, A. Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing. Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).
- Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts. J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).
- Dettin, M., et al. Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).
- Kim, W. -J., et al. Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group. Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).
- Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -G. Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).
- Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays. Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors. Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).
- Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays. ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).
- Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -R., Park, Y. -S., Cho, Y. -K. Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood. Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).
- Li, D., Xia, Y. Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning. Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).
- Lombard, M. SolidWorks 2013 BIBLE. , John Wiley & Sons Inc. Indianapolis, IN. (2013).
- Tickoo, S. EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , CADCIM Technologies. Schererville, IN. (2007).
- Zhu, R., et al. Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices. Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).
- Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -P. TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells. Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).
- Katsuhiro, O., et al. Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications. Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).
