Introduction
Flera plattformar för sjukdomsdiagnos har utvecklats baserat på nanomaterial 1,2 såsom nanotrådar, 3 nanopartiklar, 4 nanorör, 5 och nanofibrer (NFS) 6-8. Dessa nanomaterial har goda förutsättningar i utformningen av ny teknik för mycket känsliga bioanalyser på grund av deras unika fysikalisk-kemiska egenskaper. Till exempel har mesoporösa zinkoxidnanofibrer använts för femto-molar känslig detektion av bröstcancer biomarkörer. 9 Nyligen nanomaterial baserade på titandioxid (TiO 2) har utforskats för bioanalytiska applikationer 10 med tanke på deras kemiska stabilitet, 11 försumbar proteindenaturering , 12 och biokompatibilitet. 13 Dessutom hydroxylgrupperna på ytan av TiO 2 lätta kemisk modifiering och kovalent bindning av biomolekyler. 14,15 Mönstrad TiO 2 thin filmer 16 eller TiO 2 nanorör 17 har använts för att öka känsligheten hos ett målprotein detektering genom att öka ytarean; emellertid är tillverkningsprocessen tämligen komplex och kräver dyr utrustning. Å andra sidan, är elektrospunna NF mottagande uppmärksamhet på grund av deras höga yta samt enkel och billig tillverkningsprocess, 18,19 ännu, gör det svårt att hantera den sköra eller lös egenskap hos electrospun TiO 2 NF matta och integreras med mikroflödessystem enheter. 6,20 Därför ades TiO 2 NF mattor sällan används i bioanalytiska tillämpningar, särskilt sådana som kräver hårda tvättförhållanden.
I denna studie, att övervinna dessa begränsningar, har vi utvecklat en ny teknik för överföring av electrospun NF mattor på ytan av något mål substrat genom att använda en tunn polydimetylsiloxan (PDMS) klisterskiktet. furthermore, vi har framgångsrikt visat att integrera electrospun TiO 2 NF mattor på en centrifugal mikroflödessystem enhet gjord av polykarbonat (PC). Med hjälp av denna enhet, var en hög känslig, helt automatiserad och integrerad detektering av C-reaktivt protein (CRP) samt kardiellt troponin I (cTnI) uppnås inom 30 minuter från endast 10 mikroliter helblod. 21 På grund av den kombinerade fördelarna med egenskaperna hos NFS och centrifugal-plattformen, analysen uppvisade ett brett dynamiskt område av sex storleksordningar från 1 pg / ml (~ 8 fM) till 100 ng / ml (~ 0,8 pM) med en lägre detektionsgräns 0,8 pg / ml (~ 6 fM) för CRP och ett dynamiskt område från 10 pg / ml (~ 0,4 pM) till 100 ng / ml (~ 4 nm) med en detektionsgräns på 37 pg / ml (~ 1,5 pM) för cTnI. Dessa detektionsnivåerna vara ~ 300 och ~ 20-faldigt lägre jämfört med deras motsvarande konventionella ELISA-resultat. Denna teknik kan tillämpas för detektering av eventuella målproteiner, med lämpliga antikroppar. Sammantaget denna enhet could hög grad bidra till in vitro-diagnostik och biokemiska analyser eftersom det kan detektera sällsynta mängder målproteiner med stor noggrannhet, även från mycket små mängder av biologiska prover, t ex 10 pl helblod. Även om vi bara visat serumprotein upptäckt med hjälp av ELISA i denna studie, kan överföring och integration teknik electrospun NF med mikroflödessystem enheter tillämpas mer allmänt i andra biokemiska reaktioner som kräver en stor yta för hög detektionskänslighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Blod togs från friska individer och uppsamlades i en bloduppsamlingsröret. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla frivilliga.
1. Tillverkning av TiO 2 NF Mat
- Framställning av prekursorlösning 22
- Lös upp 1,5 g av titantetraisopropoxid (TTIP) i en blandning av etanol (99,9%, 3 ml) och isättika (3 ml) och blanda lösningen vid RT (25 ° C) under 30 min på en magnetomrörare.
- Lös upp 11 vikt-% av polyvinylpyrrolidon (PVP) i 3,64 g etanol (99,9%) och rör om lösningen vid 65 ° C under 1 timme med användning av en värmeplatta magnetomrörare.
- Kombinera och omrör de två lösningarna vid 65 ° C under 4 h på en värmeplatta magnetomrörare.
- electro
- Ladda beredd lösning i en spruta som är ansluten till en nål av rostfritt stål på 200 um inre Diameter. Häll lösningen direkt in i sprutan efter avlägsnande av kolven.
- Införa lösningen konstant vid en flödeshastighet av 0,3 ml / h under 10 min på en Si-skiva (2 cm x 2 cm) placeras på en jordad substrat vid en hög likspänning (15 kV). Under elektrospinning, ställa in avståndet mellan nålen och den jordade substratet till 10 cm.
- Bränning av NF mattan
- Placera NF mattan i en ugn och höja temperaturen upp till 500 ° C med en ramphastighet av 3 ° C / min i högvakuum villkoret (5 x 10 -5 torr).
- Hålla temperaturen vid 500 ° C under 3 h. Sänka den inre temperaturen av proverna till RT (25 ° C) i ugnen.
2. Integration av TiO 2 NF Mat i en centrifugal mikroflödes skiva
- Tillverkning av en skiva
- Använd 3D-design mjukvara (t.ex. SolidWorks eller liknande) för att skildra kamrar, kanaler eller ventiler av varje skikt av skivan. Konvertera designfiler till datorn numerisk styrning (CNC) kod med kod genererar programvara (t.ex. EdgeCAM eller liknande). Använd mjukvaror enligt bruksanvisningen 23,24 Anm. De typiska kanal dimensioner som används i den här enheten är 1,0 mm x 0,3 mm (bredd x djup).
- Öppna operativsystem för CNC-fräsmaskin (eg., DeskCNC eller liknande) och ladda CNC kod till operativprogrammet och klicka på följande för "AUTO" -> "G koden öppen" -> Välj den genererade CNC-koden.
- Fäst PC plattan på CNC-fräsmaskin: använd 1 mm PC plattor för toppskiktet och 5 mm PC-plattor för skivskiktet. Kör CNC-fräsmaskin för att skära varje skikt av skivan genom att klicka på "START" -knappen.
- Överföring av TiO 2 NF matta på skivan
- Placera ett kiselsubstrat och en liten petriskål innehållande 40 mikroliter av (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-triklorsilan i en vakuumkammare under vakuum under 30 min. Den fluorsilan förångas och blir belagd på substratet.
- Blanda polydimetylsiloxan (PDMS) pre-polymer med en härdare i en 10: 1-förhållande och avgasa i en vakuumkammare. Spin-coat PDMS på en kiselsubstrat vid 650 varv per minut under 60 sek.
- Bota PDMS belagda på kiselsubstratet i en ugn vid 65 ° C under 10 min för att uppnå en vidhäftande tillstånd.
OBS: Härdningstiden kan varieras beroende på miljöförhållanden, och adhesionskraft kan testas genom ett slag test med en reometer. - Överför TiO 2 NF matta framställd genom elektrospinning och kalcinering på PDMS-belagda kisel med hjälp av en pincett. Sedan gäller manuellt ett konformt tryck på den överförda TiO 2 NF matta med ett platt föremål (eg., Glasskiva) och ta bort föremålet. SättaDetta prov i ugnen vid 65 ° C under 4 timmar eller vid 80 ° C under en timme för att härda PDMS lagret helt.
- Coat bindningsreaktionskammare i skivan med 20 pl PDMS / härdare blandning (10: 1), som verkar som ett adhesivt skikt för att fästa TiO 2 NF matta på skivan.
- Fördela 50 pl etanol (99,9%) på TiO 2 NF matta på PDMS lagret, skära NF mattan med ett slag hål 6 mm diameter och överföra snittet TiO 2 NF mattan bindningsreaktionskammare belagda med 20 pl av PDMS i det föregående steget.
OBS: I detta steg kommer etanol att vara till hjälp för att lösgöra snittet TiO 2 NF matta från Si-substratet. - Inkubera TiO 2 NF matta integrerad skiva i ugnen vid 65 ° C under 4 timmar eller vid 80 ° C under en timme för att bota PDMS fullständigt.
- Ytmodifiering av TiO 2 NF matta på skivan
- Prepare 1% vol / vol lösning av (3-glycidoxipropyl) methyldiethoxy silan (GPDES) i etanol (99,9%).
- Behandla TiO 2 NF matta integrerad skiva med syrgasplasma vid 140 W, 50 sccm syreflöde för 180 sek. Dispensera 100 pl GPDES lösningen på varje nanofiber matta och inkubera vid RT (25 ° C) under 2 timmar.
- Tvätta substrat kort genom att man avskaffar etanol (99,9%) med hjälp av en tvättflaska, sedan avlägsna etanolen fullständigt genom att vända skivan och blotting det mot en ren torka. Härda vid 80 ° C under 1 timme. Tvätta två gånger med etanol (99,9%) på samma sätt som nämnts ovan, för att avlägsna de fysikaliskt adsorberade och obundna GPDES molekyler.
- Föna med en kväveström, torka under vakuum.
OBS: Skivan kan lagras i en sluten behållare vid RT (25 ° C) fram till användning.
- Immobilisering av antikroppar på ytan
- Gör en lösning av 200 ng / ml av infångningsantikroppar (monoklonal mus-antihumant hsCRP eller monoklonal mus-anti-cTnI) genom utspädning av antikropparna med en fosfatbuffrad saltlösning (PBS) -buffert (pH 7,4). Fördela 5 ul av lösningen på varje NF matta i en skiva med en mikropipett. Se material lista för mer information om antikropparna.
- Hålla skivorna i en fuktig kammare och inkubera vid 37 ° C under 4 h. Tvätta antikropparna belagda NF matta med 0,1% BSA-PBS-buffert. Fyll kammaren med 100 pl tvättbuffert med hjälp av en mikropipett, ta bort bufferten genom att aspirera eller dekantering. Slutligen, vänd skivan och torka den mot en ren torka, och sedan montera skivan.
- lamellaggregatet
- Rita utformningen av skivan på dubbelsidigt vidhäftande tejp med användning av ett CAD-program (t.ex. AutoCAD eller liknande). Ladda CAD-konstruktion till skär plotter.
- Skär den dubbelsidigt vidhäftande tejp med klipp plotter. Lossna ett skyddsskikt av dubbelhäftande tejp och fäst it ovanpå skivskiktet. Dra av andra skyddsskikt och fäst toppskiktet på skivskiktet.
- Ladda preliminärt monterade skivan i pressmaskinen och exakt rikta topp / lim / skivskikt använder align märken i varje skikt för att ansluta varje ventil, kanal, och kammare. Applicera konform tryck med hjälp av pressmaskinen.
3. Immunoanalys
- Fylla kamrarna med 1% BSA-PBS-buffert med användning av en mikropipett och inkubera skivan vid 37 ° C under 1 timme. Avlägsna bufferten genom aspiration med användning av en mikropipett. Utföra detta steg att blockera un-reagerade platser och för att reducera icke-specifik adsorption av protein i en skiva.
- Tvätta två gånger med 0,1% BSA-PBS genom att fylla och aspire kamrarna med användning av en mikropipett.
OBS: I detta skede skivan kan lagras vid 4 ° C fram till användning. - Belastning 10 pl av antigen-spetsade helblod eller CRP fria serum för CRP detektering på skivan med hjälp av en micropipette. För att göra de kalibreringsdiagram, använda koncentrationer av CRP från ett pg / ml till 100 ng / ml; och cTnI från 10 pg / ml till 100 ng / ml.
OBS: På grund av de högre nivåerna av CRP i helblod, som vanligtvis är i ^ M intervall, var CRP fritt serum som används för att demonstrera den låga detektionsgränsen för anordningen. - Snurra skivan vid 3600 rpm (391 xg) i 60 sek för att separera de röda blodkropparna.
- Öppna ventil # 1 av laserbestrålning, och överföra 4 pl av supernatant plasma till kammaren innehållande 8 pl upptäcka antikroppar konjugerade med HRP genom att snurra skivan vid 2400 rpm under 3 sek.
OBS!. De allmänna förfarandena för ventilmanövrering och visualisering av skiv operation beskrivs i detalj i en tidigare rapport 21 - Tillämpa ett blandningsläge (15 Hz s -1, 15 °) under 5 sek för bindning av proteinet och detektionsantikroppar.
- Öppna ventil # 2, och överför den blandning som framställts i steg 6 till bindningsreaktionskammare (2400 rpm, 3 sek). Sedan gäller ett blandningsläge (60 Hz s -1, 2 °) under 20 min för att uppnå en immunoreaktion mellan blandningen och de bindande antikropparna på TiOj 2 NFS. Efter reaktionen, öppna ventilen # 3 och överföra den återstående blandningen till avfallskammaren (2400 rpm, 10 sek).
- Överför tvättbuffert (600 | il) till bindningsreaktionskammaren genom att öppna ventilen # 4 och snurra skivan (2400 rpm, 4 sek). Applicera sedan en blandningsläge (30 Hz s -1, 30 °) för 120 sek för att tvätta Tio 2 NF i kammaren.
- Tvätta TiO 2 NF två gånger genom att följa samma villkor för steg 3,8, och ta bort kvarvarande tvättbuffert fullständigt genom att snurra skivan vid 2400 rpm under 20 sekunder. Sedan stänga ventilen # 5.
- För den kemiluminiscenta reaktionen, tillämpa ett blandningsläge (30 Hz s -1, 2 °) under 1 min efter överföring av kemiluminiscenta substratlösningen till bindningsreaktionskammaren genom att öppna ventilen # 6 och spinningskivan vid 2400 rpm under 10 sekunder senare.
- Överföra den reagerade substratlösning i kamrama för påvisande genom att öppna ventilen # 7 och snurra skivan vid 2400 rpm under 10 sek.
- Mät kemiluminescens signaler från den reagerade substratlösningen genom att använda ett fotomultiplikatorrör (PMT) modul utrustad detekteringssystem.
OBS: Detektionssystemet är en specialbyggd maskin med hjälp av följande delar: steg motor, optomechanical komponenter, scener översättnings och kommersiellt tillgängliga PMT. De optomechanical delar och stegmotor är monterade för att hålla enheten, och motorn kan rotera skivan. Detekteringen utförs genom PMT fixerade på de optomekaniska delarna, och den är belägen ovanför kamrama för påvisande i anordningen. Genom att manipulera stegmotorn, är kamrama för påvisande i linje precis under detektionszonen av PMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll, en helt automatiserad centrifugmikroflödessystem enhet för proteindetektion från helblod med hög känslighet bereddes. Tio 2 NF mattor framställdes genom processer av elektrospinning och kalcinering. I syfte att fabricera NFS av önskad diameter, morfologi och tjocklek, elektrospinning tillstånd såsom flödeshastighet, spänning, och spinning tid optimerades. När villkoren inte har optimerats, kvaliteten på NFS bildade var dålig. Framför allt var NF inte spunna ur polymerlösningen vid låg spänning (5 kV), och bröts när spänningen var hög (> 20 kV). På samma sätt, spinning tid var avgörande för tillverkning av NF med lämplig densitet, inte alltför gles (1 min) eller alltför täta (30 min). Dessutom, för att undvika pärlbildning som orsakas av höga strömningshastigheter, var flödeshastigheten manipuleras. Så är fallet, en pålagd spänning på 15 kV, 10 min elektrospinning tid och en flödeshastighet av 0,3 ml hr
TiO 2 NF matta lyckades överfördes på målsubstratet användning av ett bindemedel PDMS skikt, som framställdes genom spinnbeläggning PDMS på en silaniserad kiselsubstrat och pre-härdning i en ugn vid 65 ° C. Tiden för pre-härdning av PDMS skiktet optimeras genom att kontrollera adhesionskraften, under användning av en klibb-test (figur 2A). Figur 2B visar effekten av härdningstiden på nanofiber fastsättning. Om PDMS upphettades under 3 min, finns det ingen adhesionskraft som PDMS fortfarande var ohärdad och kvarstår som en vätska och NFS fick inbäddad i PDMS-skiktet. När den värms under 30 min, är adhesionskraften mycket svag som den PDMS blir stel och förlorar sin klibbiga egenskapen och NFS var inte fäst på den. När PDMS upphettades for 10 min, PDMS visade stark vidhäftningskraft och NFS fästes kraftigt. Av resultaten kan man dra slutsatsen att den optimala tiden för pre-härdande PDMS för starka engagemang är 10 min.
Efter skivenhet, var immunfördes på TiO 2 NF matta integrerad skiva genom att följa en serie av skivdriftprocesser som anges i tabell 1. För bestämning av CRP och cTnI koncentrationer i okända prover, var kalibreringsdiagram för varje tillverkad genom att avsätta de relativa ljusenheter (RLU) mot CRP eller cTnI koncentration (Figur 3). I fig 3A och 3B, var de på-skiva analysresultat jämfört med konventionell ELISA på en 96-brunnsplatta för CRP och cTnI respektive. Analyserna uppvisade ett brett linjärt dynamiskt område med en detektionsgräns av 0,8 pg / ml (~ 6 FM) för CRP och 37 pg / ml (1,5 PM) för cTnI på en skiva, somär ca 300 gånger högre för CRP och 20 gånger högre för cTnI jämfört med sina respektive konventionella ELISA-resultat (286 pg / ml, 2,3 pm för CRP, 824 pg / ml, 32 pm för cTnI).
Figur 1. Optimering av elektrospinning förhållanden. SEM-bilder vid varje tillstånd visar morfologin av NF bildas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Tack test av klister PDMS lager och SEM-bilder av den överförda TiO 2 NF matta. (A) adhesionskraft av limmetPDMS skikt, förhärdade flera tidsperioder, (B) SEM-bilder av nanofibrer fästa på PDMS härdade under olika lång tid. Denna siffra har modifierats Ref. 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Kalibrerings diagram för detektion av CRP och cTnI använder lab-on-a-skiva och 96-brunnar. Upptäckt av CRP spetsade i CRP fritt serum (A) och cTnI spetsade i helblod (B) utfördes. Felstaplarna indikerar standardavvikelsen för minst tre oberoende mätningar. Detektionsgränsen (LOD) beräknades med 3 gånger av standardavvikelsen för de negativa kontrolldata mäts med CRP-fri serum eller helblod utan cTnI spiking förCRP och cTnI, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Spin No. | Hastighet (rpm) | Ventil No. | Tid (sek) | Drift | |||
| 1 | 3600 | 60 | blodseparation | ||||
| 2 | 2400 | 1 | 3 | öppen ventil för att överföra plasma in i kammaren innehållande 8 | il av detektion av antikroppar konjugerade med HRP | |||
| 3 | 15 Hz, 15 ° | 5 | blanda plasma och detektion av antikroppar | ||||
| 4 </ Td> | 2400 | 2 | 3 | öppna ventilen för att överföra blandningen till bindningsreaktionskammare | |||
| 5 | 60 Hz, 2 ° | 1200 | Blanda infångande antikroppar på TiO 2 NF matta och plasma detektion av antikroppar blandning | ||||
| 6 | 2400 | 3 | 10 | öppen ventil för att avlägsna blandningen | |||
| 7 | 2400 | 4 | 4 | öppen ventil för att överföra tvättbuffert | |||
| 8 | 30 Hz, 30 ° | 120 | Blanda tvättbuffert och tvätta TiO 2 NF matta | ||||
| 9 | 2400 | 4 | överföring tvättbuffert | ||||
| 10 | 30 Hz, 30 ° | 120 | 2 NF matta | ||||
| 11 | 2400 | 4 | överföring tvättbuffert | ||||
| 12 | 30 Hz, 30 ° | 120 | Blanda tvättbuffert och tvätta TiO 2 NF matta | ||||
| 13 | 2400 | 4 | överföring tvättbuffert | ||||
| 14 | 30 Hz, 30 ° | 120 | Blanda tvättbuffert och tvätta TiO 2 NF matta | ||||
| 15 | 2400 | 20 | avlägsna kvarvarande tvättbuffert | ||||
| 16 | 5 | stäng ventil | |||||
| 17 | 2400 | 6 | 10 | öppen vAlve och överföra kemiluminiscent substrat | |||
| 18 | 30 Hz, 2 ° | 60 | blanda substratet och immunreagensen på TiO 2 NF matta | ||||
| 19 | 2400 | 7 | 10 | öppna ventilen och överföra den reagerade substratet till detektionskammaren | |||
| Total tid | ~ 30 min | ||||||
Tabell 1. Användning program för immun på en skiva. Denna tabell har ändrats från Ref. 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analysen på TiO 2 NF integrerad skiva är en snabb, billig och bekväm teknik för ultra detektering av mycket små mängder proteiner som förekommer i mycket låga volymen av blod. Denna teknik har fördelen av användning av små provvolymer (10 | il) och är mottaglig för analys av flera prover samtidigt. Detta ger en stor potential som en multiplexering immun enhet. Anordningen har den ytterligare fördelen att den inte kräver provförbehandlingssteg såsom plasmaseparation, som erfordras i konventionella ELISA. Dessutom kan enheten utföra hela immunanalysförfaranden (t.ex. blandning, tvätt, bindning etc.) automatiskt på grund av pre-designade kammare, kanaler och ventiler. Dessutom, med hjälp kommersialiseras skiv tillverkningsmetoder (t.ex. formsprutning, UV / ultraljuds / termisk bindning) i stället för fräsning och manuell montering med hjälp av lim, kan hela förloppet från enheten tillverkning analys varaautomatiserad.
Också, varvid förfarandet transfertryck presenteras här visar en enkel och enkel överföring av electrospun NF från givare för att rikta substratet genom att använda ett tunt vidhäftande PDMS skiktet. I allmänhet TiO 2 NF erhållits efter kalcinering processen är sköra och lätt lossnar från det jordade substratet på grund av svag vidhäftning. 25 På grund av sin karakteristiska sprödhet, integrera TiO 2 NF mattor med andra enheter är svårt. För att lösa detta, har många metoder rapporterats. Till exempel, varm press 26 och lösningsmedelsånga 27 tekniker visade en förbättring av vidhäftningen mellan TiO 2 NF matta och målytan före kalcinering processen. Även om dessa metoder ökar vidhäftningen, TiOj 2 NF mats var inte är intakt på grund av den höga mekaniska tryck eller lösningsmedlet som appliceras under de respektive tekniker. Vidare, på grund av kalcineringssteget, integrering av TiO 2 </ Sub> NF mattor med hjälp av dessa metoder kan tillämpas endast för begränsade målytor.
Så vitt vi vet är detta den första tekniken för att visa transfertryck av NF mattor på en anordning som består av termoplaster, behålla de nya egenskaperna hos NF även efter överlåtelsen. För bättre prestanda av enheten är tillverkning av högkvalitativa NFS och optimering av pre-härdningsbetingelser önskas. Som nämnts i protokollet, den tid som krävs för pre-härdning kan variera beroende på miljöförhållanden; därför, för-härdningsförhållandena är att optimeras genom att mäta vidhäftningskraft med hjälp av en klibb-test.
Dessutom presenterade protokollet här, ger skickliga guider för helautomatisk ELISA process på en skiva. Protokollet introducerar inte bara tillverkning av skivan utan också automatisering av alla de processer som krävs för ELISA, inklusive separation av helblod, mätning, blandning, tvättning och detektion.Varje steg är optimerad med centrifugeringshastigheten, blandning frekvens, och operationstiden. Baserat på denna bruksanvisningen, kan reagens lastas på en skiva ska överföras med användning av en enda motor. Eftersom enheten utförde utmärkt detekteringskänslighet med mycket låg volym av blod, ger det en stor potential för diagnostiska applikationer genom screening biomarkörer i ett tidigt stadium av sjukdomen. Enheten skulle få möjlighet att upptäcka biomarkörer beroende på tillgången av dess specifika antikroppar.
Fastän anordningen med TiO 2 NF mats uppnått mycket ökad känslighet på grund av den stora ytarean av mattorna, kunde en av de återstående utmaning av denna teknik vara i massproduktion av enhetliga NF mattor. Eftersom känsligheten hos ELISA påverkas starkt av den yta av nanofiber mattan, är det viktigt att uppnå inte bara en hög yta utan också en reproducerbar och jämn yta i olika partier av massproduktion. Sammanfattningsvis har vi visat en enkel metod för att integrera ett sprött NF matta till en funktionell anordning för ultrakänslig proteindetektion. Fördelarna med denna metod är följande: 1) tidigare elektrospunna TiO 2 NF kunde framställas endast på ledande och termiskt stabila ytor; Här har vi visat att de kan överföras på vilket substrat som helst, inklusive icke-ledande och plastmaterial; 2) TiO 2 NF mattor kan motstå trycket och förbli stabil under tvättsteg på grund av den höga vidhäftningskraft PDMS skikt; 3) det ger en relativt högre yta för bioanalyser; och 4) kan antikropparna vara kovalent bunden till TiO 2 NF grund av de intakta ytegenskaper på NFS. Denna teknik har stor potential att användas för integrering av nanofibrous material i anordningar för olika tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Research Foundation of Korea (NRF) bidrag (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), ett bidrag från den koreanska Health Technology R & D Project, Ministry of Health & Welfare (A121994) och IBS-R020-D1 finansieras av den sydkoreanska regeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III - ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
References
- Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
- Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
- Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. Biosensors and Cancer. , Science Publishers. 164-183 (2012).
- Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , Pan Stanford Publishing. 265-282 (2011).
- Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).
- Yang, D., et al. Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV. Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).
- Chantasirichot, S., Ishihara, K. Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system. Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).
- Zhang, N., et al. Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).
- Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics. Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).
- Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).
- Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles. Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).
- Liu, S., Chen, A. Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing. Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).
- Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts. J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).
- Dettin, M., et al. Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).
- Kim, W. -J., et al. Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group. Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).
- Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -G. Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).
- Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays. Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors. Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).
- Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays. ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).
- Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -R., Park, Y. -S., Cho, Y. -K. Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood. Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).
- Li, D., Xia, Y. Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning. Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).
- Lombard, M. SolidWorks 2013 BIBLE. , John Wiley & Sons Inc. Indianapolis, IN. (2013).
- Tickoo, S. EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , CADCIM Technologies. Schererville, IN. (2007).
- Zhu, R., et al. Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices. Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).
- Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -P. TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells. Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).
- Katsuhiro, O., et al. Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications. Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).
