Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Tüm Blood adlı ultrasensitive Protein Algılama için Tam Otomatik Santrifüj mikroakışkan Cihazı

Published: April 16, 2016 doi: 10.3791/54143

Introduction

Hastalık tanısı için çeşitli platformlar 1,2 gibi nanotellerin, 3 nanopartiküller, 4 nanotüpler, 5 ve nano (NF'ler) 6-8 olarak nano ölçekli malzemelere dayanan geliştirilmiştir. Bu nano kendi benzersiz fizikokimyasal özellikleri nedeniyle son derece hassas biyoanalizlere için yeni teknolojilerin tasarımı mükemmel umutları sunuyoruz. Örneğin, gözenekli bir çinko oksit nanolifler meme kanseri biyobelirteçlerinin femto-mol hassas bir şekilde tespit kullanılmaktadır. 9. Son zamanlarda, kimyasal stabilitesini göz önüne biyoanalitik edecektir 10 araştırılmıştır (TiO2) titanyum dioksit esaslı sol-jel, 11 ihmal edilebilir protein denatürasyonu 12 ve ek olarak biyouyumluluk. 13, TiO2 yüzeyi üzerindeki hidroksil grupları kimyasal modifikasyon biyomoleküllerin kovalent bağlanmasını kolaylaştırır. 14,15 Desenli TiO2 thin, filmler 16 veya TiO2 17 yüzey alanını arttırarak, bir hedef proteinin algılama hassasiyetini artırmak için kullanılmıştır nanotüpler, Ancak, üretim süreci oldukça karmaşık ve pahalı ekipman gerektirir. Öte yandan, electrospun NF'ler basit ve düşük maliyetli üretim süreci yanı sıra nedeniyle yüksek yüzey alanı dikkatini alıyorsanız, 18,19 henüz electrospun TiO2 NF mat kırılgan ya da gevşek özelliği işlemek için zorlaştırır ve mikroakışkan cihazlar ile entegre. 6,20 nedenle, TiO2 NF paspaslar nadiren biyoanalitik uygulamalarda sert yıkama koşulları gerektiren özellikle kullanılmıştır.

Bu çalışmada, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için, ince bir polidimetilsiloksan (PDMS) yapışkan tabaka kullanarak, herhangi bir hedef alt-tabakanın yüzeyi üzerine, NF halılar electrospun aktarmak için yeni bir teknoloji geliştirilmiştir. furthermore, başarılı polikarbonat (PC) yapılan bir santrifüj mikroakışkan cihaz üzerine electrospun TiO NF paspaslar 2 entegrasyonunu gösterdi. Bu cihazı kullanarak, C-reaktif protein, hassas bir yüksek tam otomatik ve entegre (CRP) ve kardiyak troponin I (cTnl) tam kan sadece 10 uL, 30 dakika içinde elde edilmiştir. 21 nedeniyle birleştirilebilir UF ve merkezkaç platformun özelliklerinin avantajları, deney alt saptama sınırı 100 ng / ml (~ 12:08) 1 ug / ml (~ 8 FM) den altı mertebe geniş bir dinamik aralık sergilemiştir CRP ve 37 pg / ml (~ 01:05) içindeki bir saptama sınırı 100 ng / ml (~ 4 nM), 10 pg / ml (~ 12:04) bir dinamik aralık için 0.8 ug / ml (~ 6 FM) ve cTnI için. Bu tespit limitleri ~ 300 ve 20 Hangi kat bunlara karşılık gelen geleneksel ELISA sonuçlarına göre daha düşük. Bu teknik, uygun antikorlar ile, herhangi bir hedef proteinlerin tespiti için uygulanabilir. Genel olarak, bu cihaz coörneğin, tam kan 10 ul; biyolojik numunelerin çok küçük miktarlarda bile büyük bir hassasiyetle hedef proteinlerin nadir miktarlarda algılayabilir beri uld in vitro diagnostik ve biyokimyasal tahliller büyük katkı. Biz sadece bu çalışmada ELISA kullanılarak serum protein algılama gösterdi rağmen, mikroakışkan cihazlar ile electrospun UF'lerin transferi ve entegrasyon teknolojisi daha geniş yüksek algılama hassasiyeti için büyük bir yüzey alanı gerektiren diğer biyokimyasal reaksiyonlarda uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Kan sağlıklı bireylerden alınmış ve bir kan toplama tüpü içinde toplanmıştır. Yazılı bilgilendirilmiş olur Tüm gönüllülerden elde edilmiştir.

TiO2 NF Mat 1. Fabrikasyon

  1. Ön-madde 22 solüsyonuna hazırlanması
    1. Etanol (% 99.9, 3 mi) ve buzlu asetik asit (3 mi) içindeki bir karışımına titan tetraizopropoksit (TTIP), 1.5 g çözülür ve bir manyetik karıştırıcı ile 30 dakika boyunca oda sıcaklığında çözelti (25 ° C) karıştırılır.
    2. etanol (% 99.9) 3.64 g polivinil pirolidon (PVP) ağırlık bakımından% 11 çözülür ve bir sıcak levha manyetik karıştırıcı kullanılarak 1 saat boyunca 65 ° C'da, çözelti karıştırılır.
    3. Birleştirin ve bir sıcak levha manyetik bir karıştırıcı ile 4 saat 65 ° C sıcaklıkta iki çözüm karıştırın.
  2. elektrospinning
    1. 200 um iç Diame bir paslanmaz çelik iğne bağlı bir şırınga içine hazırlanan çözelti yükter. dalgıç çıkardıktan sonra şırıngaya doğrudan çözüm dökün.
    2. yüksek DC voltajı (15 kV) topraklanmış alt-tabaka üzerine yerleştirilmiş bir silisyum üzerinde 10 dakika süre ile 0.3 ml / st bir akış oranında (2 cm x 2 cm) sürekli solüsyonun verilmesini. Elektrospinning sırasında iğne ve 10 cm topraklı alt-tabaka arasındaki mesafeyi ayarlamak.
  3. NF mat kalsinasyon
    1. Bir fırın içinde NF koruyucu serin ve yüksek vakum koşullarında (5 x 10 -5 torr) altında 3 ° C / dk'lık bir rampa oranında 500 ° C'ye kadar sıcaklık kadar değişebilmektedir.
    2. 3 saat 500 ° C sıcaklık muhafaza edin. fırın içinde oda sıcaklığında (25 ° C) örneklerinin sıcaklık soğutun.

Bir Santrifüj mikroakışkan Disc içine TiO 2. Entegrasyon 2 NF Mat

  1. Bir diskin Fabrikasyon
    1. 3D tasarım yazılımı (örneğin, Sol kullanınidWorks veya) benzer diskin her katmanın odaları, kanal, ya da vanaları tasvir. Kod üreten yazılım (örn EdgeCAM veya benzeri) kullanarak bilgisayar nümerik kontrol (CNC) kod tasarım dosyalarını dönüştürün. Talimatlara göre yazılımları kullanın manuel 23,24 Not:. Bu cihazda kullanılan tipik kanal boyutları x 0.3 mm (genişlik x derinlik) 1,0 mm'dir.
    2. (CNC freze makinesinin çalışma yazılımını açın, örneğin., DeskCNC veya benzeri) ve işletim yazılımı, CNC kodu yüklemek ve sırasıyla aşağıdaki tıklatın: "AUTO" -> "G KODU AÇIK" -> oluşturulan CNC kodu seçin.
    3. CNC freze PC plakasını: Disk tabakası için üst tabaka ve 5 mm PC plakaları için 1 mm PC tabak kullanın. "BAŞLAT" butonuna tıklayarak diskin her katmanı kesmek için CNC freze makinesi çalıştırın.
  2. Diske TiO2 NF mat Transferi
    1. bir silikon alt-tabaka ve 40 uL (tridekaflor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl), 30 dakika boyunca vakum altında bir vakum odasına -1-trichlorosilane ihtiva eden küçük bir Petri tabağına yerleştirin. fluorosilane buharlaşmakta ve alt tabaka üzerine kaplanmış olur.
    2. Bir vakum odası 1 oranında ve gazını: 10 bir sertleştirici madde ile birlikte polidimetilsiloksan (PDMS) ön-polimer karıştırın. Spin-kat 60 saniye boyunca 650 rpm'de bir silikon yüzeye PDMS.
    3. 10 dakika yapışkan bir duruma ulaşmak için 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde, silikon alt-tabaka üzerine kaplanmış PDMS Cure.
      Not: Kür süresi çevre koşullarına bağlı olarak değişebilir, ve yapışma kuvveti reometresi kullanılarak yapışma testi ile test edilebilir.
    4. Bir cımbız kullanarak PDMS kaplı silikon üzerine elektrospinning ve kalsinasyon tarafından hazırlanan TiO2 NF mat aktarın. Daha sonra el (cam slayt, örneğin.) Düz bir nesneyle transfer TiO2 NF mat bir konformal baskı uygulamak ve nesneyi çıkartın. koymak4 saat 65 ° C ya da 1 saat boyunca 80 ° C'de bir fırında Bu örnek tamamen PDMS tabakasını sertleştirmek için.
    5. 20 ul PDMS / sertleştirici karışımı kullanılarak disk kaplayın bağlanma reaksiyonu odaları (10: 1), bir yapışkan tabaka olarak işlev yapar diske TiO2 NF mat takmak için.
    6. PDMS katmanda TiO2 NF mat, etanol (% 99.9), 50 ul koyun, 6 mm çapında bir zımba deliği olan NF mat kesilmiş ve 20 ul ile kaplanmış bağlanma reaksiyonu odalarına TiO2 NF mat kesim transfer önceki adımda PDMS.
      NOT: Bu adımda, etanol Si substrat kesilmiş TiO2 NF mat ayırmak için yararlı olacaktır.
    7. 1 saat tam PDMS tedavi etmek için 4 saat boyunca ya da 80 ° C 'de 65 ° C' de fırında TiO2 NF MAT entegre disk inkübe edin.
  3. Diskte TiO2 NF mat yüzey modifikasyonu
    1. PEtanol (3-glisidoksipropil) metildietoksi silan (GPDES) onarılması% 1 h / h çözeltisi (% 99.9).
    2. 140 W, 180 saniye boyunca 50 sccm oksijen akışı oksijen plazma ile TiO2 NF mat entegre disk davranın. Her bir nano mat GPDES çözeltisi 100 ul koyun ve 2 saat oda sıcaklığında (25 ° C) inkübe edilir.
    3. Bir yıkama şişesi kullanılarak etanol (% 99.9) dağıtım yoluyla yüzeyler kısaca yıkayın, ardından diski tersini ve temiz karşı mendil lekeleme tamamen etanol çıkarın. 1 saat boyunca 80 ° C'de tedavi. Yukarıda belirtildiği gibi, fiziksel olarak adsorbe edilmiş ve bağlanmamış GPDES molekülleri uzaklaştırmak için, aynı şekilde, etanol (% 99.9) ile iki kez yıkanır.
    4. Kuru vakum altında, bir azot akımı ile kurutma.
      NOT: Disk kullanılıncaya kadar RT (25 ° C) kapalı bir kapta saklanabilir.
  4. Yüzey üzerindeki antikorların immobilizasyonu
    1. antikorlarla 200 ug / ml 'lik bir solüsyonu (monoklonal fare anti yapmakİnsan hsCRP ya da bir fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), tampon (pH 7.4) sahip antikorlar seyreltilmesiyle monoklonal fare anti-cTnI). bir mikropipet kullanarak bir diskin her NF hasır üzerine çözeltinin 5 ul koyun. antikorlar hakkında daha fazla bilgi için malzeme listesine bakın.
    2. nemli bir oda içinde diskleri tutmak ve 4 saat 37 ° C'de inkübe edin. % 0.1 BSA-PBS tamponuyla NF MAT kaplanmış antikorları yıkayın. bir mikropipet kullanarak yıkama tamponu 100 ul ile odasını doldurmak, aspire veya boşaltma yoluyla tampon kaldırmak. Son olarak, diski ters çevirin ve temiz bir mendil karşı kurulayın ve ardından diski monte edin.
  5. disk montaj
    1. Bir paket program (örn AutoCAD veya benzeri) kullanılarak, çift taraflı yapışkan bant ile disk tasarımı çizin. Kesme plotter CAD tasarım yükleyin.
    2. kesim plotter kullanarak çift taraflı yapışkan bant kesti. çift ​​yapışkan bant bir koruma tabakası soyulabilir ve i takmakDisk tabakanın üzerine t. diğer koruma katmanı soyulabilir ve disk katman üzerinde üst tabaka ekleyin.
    3. presleme makinesinde ön monte disk yerleştirin ve tam her valf, kanal ve odaları bağlamak için her katmanda hizalama işaretleri kullanarak üst / yapışkan / disk katmanı hizalamak. presleme makinesi kullanılarak konformal basınç uygulayın.

3. İmmunoassay

  1. Mikropipet kullanılarak% 1 BSA-PBS tamponuyla odaları doldurun ve 1 saat 37 ° C'de inkübe diski. bir mikropipet kullanarak aspirasyon ile tamponu çıkarın. reaksiyona girmemiş siteleri engellemek için bir diskin proteinin spesifik olmayan adsorpsiyon azaltmak için bu adım gerçekleştirin.
  2. doldurma ve bir mikropipet kullanılarak odaları aspire% 0.1 BSA-PBS ile iki kez yıkanır.
    NOT: Bu aşamada, disk, kullanılana kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
  3. Bir micropipett kullanarak disk üzerinde CRP tespiti için antijen-çivili tam kan ya da CRP serbest serum yük 10 ule. Kalibrasyon grafikler yapmak için, 100 ng / ml, 1 ug / ml CRP konsantrasyonları kullanır; ve cTnl 10 ug / ml ila 100 ng / ml olmuştur.
    Not: uM aralığında genellikle tam kan içinde daha yüksek CRP seviyeleri nedeniyle, CRP içermeyen serumu cihazın düşük algılama sınırı göstermek için kullanılmıştır.
  4. kırmızı kan hücreleri ayırmak için 60 saniye boyunca 3600 rpm (391 xg) diski Spin.
  5. Açık valf lazer ışınlama ile 1. ve aktarım 3 sn 2,400 rpm'de diski iplik HRP ile konjuge antikorları tespit 8 ul içeren odasına süpernatant plazma 4 ul.
    Not:. Valf harekete ve disk işlemi görselleştirilmesi için genel işlemler önceki raporunda ayrıntılı olarak anlatılmıştır 21
  6. Protein ve tespit antikorlarının bağlanma için, 5 saniye süreyle bir karıştırma modu (15Hz s-1, 15 °) uygulanır.
  7. Valf # 2 ve bağlanma reaksiyonu odasına aşama 6'da elde edilen karışım transferi (2400 rpm3 sn). Daha sonra, karışım ve TiO2 UF bağlayıcı antikorlar arasında bir immunoreaksiyonunu elde etmek için 20 dakika boyunca bir karıştırma modu (60 Hz s-1, 2 °) uygulanır. ve reaksiyon açık valf 3. sonra atık haznesi (2400 rpm, 10 sn) rezidüel karışımı aktarın.
  8. Valf 4. açılması ve disk (2400 rpm, 4 sn) iplik bağlama reaksiyon odasına yıkama tamponu (600 ul) aktarın. Ardından odasında TiO2 UF'lerini yıkamak için 120 saniye boyunca bir karıştırma modu (30 Hz s -1, 30 °) uygulanır.
  9. Adım 3.8 aynı durumu takip ederek iki kez daha TiO2 UF'lerini yıkayın ve 20 saniye boyunca 2400 rpm'de diski iplik tamamen kalıntı yıkama tamponu çıkarın. Ardından, vana 5. kapatın.
  10. Kemilüminesan reaksiyon için, kapak 6 ve eğirme açarak bağlanma reaksiyonu odasına kemilüminesan substrat çözeltisi aktarıldıktan sonra 1 dakika boyunca bir karıştırma modu (30 Hz s-1, 2 °) uygulanırdaha sonra 10 saniye boyunca 2400 rpm'de disk.
  11. Valf 7. açılması ve 10 saniye boyunca 2400 rpm'de diski iplik algılama odalarına tepki substrat çözüm aktarın.
  12. Bir photomultiplier tüp (PMT) modülü donanımlı algılama sistemi kullanarak tepki gösterdi substrat çözeltisinden kemilüminesans sinyalleri ölçün.
    NOT: step motor, optik-bileşenler, çeviri aşamaları ve piyasada mevcut PMT: algılama sistemi aşağıdaki parçaları kullanarak özel inşa edilmiş bir makinedir. optomechanical parçalar ve step motor cihazı tutmak için monte edilir ve motor diski döndürebilirsiniz. algılama optik-parça sabit PMT tarafından gerçekleştirilir ve bu cihazın algılama odası üzerinde yer almaktadır. adım motor manipüle ederek, algılama odaları sağ PMT algılama bölgesi altında hizalanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokol, yüksek hassasiyet hazırlanan ile tam kandan protein tespiti için tam otomatik santrifüj mikroakışkan cihaz kullanarak. TiO2 NF paspaslar Elektrospinning ve kalsinasyon işlemleri ile hazırlanmıştır. Bu akış hızı, voltaj ve eğirme süresi gibi koşullar, Elektrospinning, arzu edilen çapta, morfoloji ve kalınlığı UF'lerini imal etmek için optimize edilmiştir. koşulları optimize değildi zaman, oluşan UF'lerden kalitesi kötü. Özellikle, UF'ler düşük voltaj (5 kV) polimer çözeltisinden dışarı bükülmüş değildi ve gerilim yüksek iken (> 20 kV) kırıldı. Benzer şekilde, eğirme zaman uygun yoğunluk, çok seyrek değil (1 dakika) veya çok yoğun (30 dk) ile UF'lere imalatı için kritik oldu. Ayrıca, yüksek akış oranları nedeniyle kordon oluşmasını önlemek için, akış hızı manipüle edilmiştir. Bu nedenle, bir 15 kV uygulanan voltaj, 10 dakika electrospinning süresi ve 0.3 mi saatlik bir akış oranı (Şekil 1) göre, NF üretimi için en uygun koşulları kullanılmıştır.

TiO2 NF MAT başarıyla silanize silikon alt-tabaka ve 65 ° C'de bir fırında önceden tedavi ile ilgili spin kaplama PDMS ile hazırlandı bir yapışkan PDMS tabaka kullanarak hedef alt tabaka üzerine transfer edildi. Ön kür PDMS katmanı için zaman, yapışma kuvveti kontrol yapışma testi (Şekil 2A) kullanılarak optimize edilmiştir. Şekil 2B nanolif eki zaman kür etkisini göstermektedir. PDMS 3 dakika boyunca ısıtıldı ise PDMS henüz vulkanize olmamış ve bir sıvı olarak kalır ve NFS PDMS tabakası içine gömülü var gibi, hiç bir yapışma kuvveti vardır. 30 dakika boyunca ısıtıldığında PDMS sertleşir ve yapışkan özelliği kaybeder ve NF'ler üzerinde takılı değil gibi, yapışma kuvveti çok zayıftır. PDMS fo ısıtıldığındar 10 dk, PDMS güçlü yapışma kuvveti gösterdi ve UF'ler kuvvetle bağlanmıştır. sonuçlarından, güçlü bir bağlantı için PDMS ön sertleştirme için optimal süre 10 dakika olduğu sonucuna varılmıştır.

Disk montaj sonrası, immunoassay Tablo 1'de listelenen disk çalıştırma süreçlerinin bir dizi takip ederek TiO2 NF mat entegre disk üzerinde yürütülmüştür. Bilinmeyen örneklerde CRP ve cTnI konsantrasyonlarının belirlenmesi için, her biri için kalibrasyon grafikleri çizerek yapılmıştır CRP veya cTnl konsantrasyonuna karşı nispi ışık birimleri (RLU) (Şekil 3). Şekil 3A ve 3B'de, disk üzerinde deney sonuçları, sırasıyla CRP ve cTnI'yi için 96 oyuklu bir plaka üzerinde, geleneksel ELISA ile karşılaştırılmıştır. deneyler, bir disk üzerindeki cTnI 0.8 CRP için pg / ml (~ 6 FM) ve 37 ug / ml (1:05) bir saptama sınırı ile geniş bir lineer dinamik aralığı sergilemiştirCRP için yaklaşık 300 kat daha yüksek ve bunların ilgili geleneksel ELISA sonuçları (824 ug / ml, cTnI 32 pM 286 pg / ml, CRP, 14:03) ile karşılaştırıldığında cTnI 20 kat daha yüksektir.

Şekil 1

Şekil elektro koşulları 1. optimizasyonu. Her koşulda SEM görüntüleri oluşan UF morfoloji göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Yapışkan PDMS katman ve transfer TiO2 NF mat SEM görüntüleri Şekil 2. Tack testi. (A) yapıştırıcı Yapışma kuvvetiZaman birkaç uzunlukları, (B), farklı zaman uzunlukları için tedavi PDMS takılı nano SEM görüntüleri için önceden vulkanize PDMS tabaka. Bu rakam Ref modifiye edilmiştir. 21. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
On-a-disk laboratuar ve 96 oyuklu bir plaka kullanılarak CRP ve cTnI tespiti için Şekil 3. Kalibrasyon grafikleri. CRP saptanması CRP içermeyen serumu (A) tutturuldu ve cTnl yürütülmüştür tam kan (B) 'de bir artış gösterdi. Hata çubukları, en az üç bağımsız ölçümün standart sapma gösterir. Saptama sınırı (LOD) cTnI'nın spike olmayan CRP içermeyen serum veya tam kan ölçülen negatif kontrol verilerinin standart sapmanın 3 kez hesaplanmıştırCRP ve cTnl sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Spin No Hızı (rpm) Vana No Süresi (sn) operasyon
1 3600 60 kan ayırma
2 2400 1 3 Açık vana HRP ile konjüge edilmiş antikorları tespit 8 ul ihtiva eden bölme içine plazma aktarmak
3 15Hz, 15 ° 5 Plazma ve tespit antikorları karıştırın
4. </ Td> 2400 2 3 Açık vana bağlayıcı reaksiyon haznesine karışımı aktarmak
5 60 Hz, 2 ° 1.200 TiO2 NF mat ve plazma tespit antikorlar karışımı yakalama antikorları mix
6 2400 3 10 açık valf karışımı kaldırmak için
7 2400 4 4 Açık vana yıkama tamponu aktarmak
8 30 Hz, 30 ° 120 yıkama tamponu karıştırmak ve TiO2 NF mat yıkama
9 2400 4 Transfer yıkama tamponu
10 30 Hz, 30 ° 120 TiO2 NF mat
11 2400 4 Transfer yıkama tamponu
12 30 Hz, 30 ° 120 yıkama tamponu karıştırmak ve TiO2 NF mat yıkama
13 2400 4 Transfer yıkama tamponu
14 30 Hz, 30 ° 120 yıkama tamponu karıştırmak ve TiO2 NF mat yıkama
15 2400 20 Kalan yıkama tamponu çıkarmak
16 5 yakın valf
17 2400 6 10 açık valve ve kemilüminesan substrat aktarmak
18 30 Hz, 2 ° 60 substrat ve TiO2 NF mat immunoreagents mix
19 2400 7 10 valf açılır ve tespit bölmesinin sokularak substrat aktarmak
Toplam zaman ~ 30 dakika

Bir diskte immunoassay Tablo 1. Çalışma programı. Bu tablo Ref modifiye edilmiştir. 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TiO2 NF entegre disk üzerinde deney kan çok düşük hacimde, düşük fazla proteinler arasında derece hassas saptanması için hızlı, ucuz ve kullanışlı bir yöntemdir. Bu teknik, küçük örnek hacimlerini (10 ul) kullanılarak avantajı vardır ve aynı anda birden fazla numune analiz için elverişlidir. Bu bir çoklayıcı immunoassay cihazı olarak büyük bir potansiyel sunmaktadır. Cihaz, geleneksel ELISA gereklidir plazma ayrılması gibi örnek ön-işlem aşamaları gerekli değildir ilave bir avantajı vardır. Ayrıca, cihaz sayesinde önceden tasarlanmış odaları, kanal ve vanaları bütün immunoassay prosedürleri (örneğin, karıştırma, yıkama, bağlayıcı vb) otomatik olarak gerçekleştirebilirsiniz. Yapıştırıcılar kullanarak yerine freze ve manuel montaj Ayrıca, ticari disk üretim yöntemleri kullanılarak (örneğin, enjeksiyon kalıplama, UV / ultrasonik / ısıl bağlama), analize cihaz imalattan gelen tüm prosedürü olabilirOtomatik.

Ayrıca burada sunulan transfer baskı metodu ince yapışkan PDMS tabaka kullanılarak alt-tabakanın hedef donörden electrospun NF basit ve kolay bir transferi gösterir. Genel olarak, kalsinasyon işleminden sonra elde edilen TiO2 UF'ler kırılgandır ve kolayca zayıf yapışma topraklı substrattan sıyırın. 25 dolayı karakteristik kırılganlık, diğer cihazlarla TiO2 NF paspaslar entegre zordur. Bu sorunu çözmek için, pek çok yöntem bildirilmiştir. Örneğin, sıcak pres 26 ve solvent buharı 27 teknikleri kalsinasyon işleminden önce TiO2 NF'ler paspas ve hedef yüzey arasındaki yapışma artışı gösterdi. Bu yöntemler yapışmayı artmasına rağmen, TiO2 NF paspaslar, yüksek mekanik basınç sağlam değildi ya da çözücü ilgili teknikler sırasında uygulanan. Bundan başka, çünkü kalsinasyon aşamasının, TiO2 entegrasyonu </ Sub> bu yöntemleri kullanarak NF paspaslar sadece sınırlı hedef yüzeyler için uygulanabilir.

Bildiğimiz kadarıyla, bu hatta transferden sonra UF'lere yeni özelliklerini koruyarak, termoplastik yapılmış bir cihaza üzerinde NF paspaslar transfer baskı göstermek için ilk tekniktir. Cihazın daha iyi performans için, yüksek kaliteli UF'lerin imalat ve ön kür koşullarının optimizasyonu arzu edilir. protokolü de belirtildiği gibi, zaman, çevre koşullarına bağlı olarak değişebilir ön-vulkanizasyon için gerekli olan; Bu nedenle, ön sertleştirme koşulları yapışma testi kullanılarak yapışma kuvvetini ölçerek optimize edilmesi bulunmaktadır.

Ayrıca, protokol burada sunulan, bir disk üzerinde tam otomatik ELISA işlemi için usta kılavuzları sunar. Protokol sadece diskin imalat hem de tam kan ayırma, ölçme, karıştırma, yıkama ve algılama dahil olmak üzere ELISA için gerekli olan bütün işlemler, otomasyonunu getirmektedir.Her adım Dönüş hızı, karıştırma sıklığı ve çalışma süresi ile optimize edilmiştir. Bu işlem kılavuzunda dayanarak, bir disk üzerinde yüklü reaktifler tek motoru kullanılarak transfer edilebilir. Cihaz kan çok düşük hacmi ile mükemmel algılama hassasiyetini gerçekleştirilen bu yana, hastalığın erken bir aşamada biyobelirteçlerini tarama ile teşhis uygulamaları için mükemmel bir potansiyel sunmaktadır. Cihaz spesifik antikorların varlığına bağlı olarak herhangi bir biyobelirteç tespit etmek için etkin olacak.

TiO2 NF paspaslar ile cihaz son derece bağlı paspaslar geniş yüzey alanına hassasiyeti gelişmiş başararak rağmen, bu tekniğin kalan meydan tek tip NF paspaslar seri üretimine olabilir. ELISA hassasiyeti güçlü nano mat yüzey alanı tarafından etkilendiği için, yüksek bir yüzey alanına hem de seri üretim farklı gruplar halinde, bir tekrar üretilebilir ve düzgün bir yüzey alanı sadece elde etmek için kritiktir. Sonuç olarak, son derece hassas bir protein tespit edilmesi için bir cihazdan bir kırılgan NF mat entegre için basit bir yöntem gösterilmiştir. Bu, aşağıdaki gibi yöntemin avantajları şunlardır: 1) daha önce electrospun TiO2 UF'ler iletken ve termal olarak kararlı yüzeylerde hazırlanabilir; Burada, bunlar iletken olmayan ve plastik malzemeler dahil herhangi bir alt-tabaka üzerine transfer edilebilir olduğunu göstermiştir; 2) TiO2 NF paspaslar basınca dayanıklı ve bağlı PDMS tabakasının yüksek yapışma gücüne yıkama adımları sırasında stabil kalabilir; 3) biyo-tahliller için nispeten yüksek bir yüzey alanı sağlar; ve 4) antikorları, kovalent bağlı NFS bozulmamış yüzey özelliklerine TiO2 UF bağlı olabilir. Bu teknik, farklı uygulamalar için cihazlara nanofibröz malzeme entegrasyonu için büyük bir potansiyel kullanılmak zorundadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Bu eser Kore Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK) hibeler (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), Kore Hükümeti tarafından finanse edilen Kore Sağlık Teknoloji Ar-Ge Projesi, Sağlık ve Refah (A121994) ve IBS-R020-D1 Bakanlığı'ndan bir hibe ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Si wafer LG SILTRON Polished Wafer, test grade Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700
Polycarbonate (PC)  Daedong Plastic PCS#6900 Thickness (mm) = 1 and 5 
Titanium tetraisopropoxide, 98%, Sigma-Aldrich 205273
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 Sigma-Aldrich 437190
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099
Anhydrous ethanol Sigma-Aldrich 459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane Sigma-Aldrich 448931
PDMS and curing agent Dow Corning SYLGARD 184
GPDES Gelest Inc SIG5832.0 
Ethanol J T Baker
FE-SEM FEI Nova NanoSEM
X-ray photoelectron spectroscopy ThermoFisher K-alpha
3D modeling machine M&I CNC Lab, Korea CNC milling machine
Wax-dispensing machine Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea Customized
Double-sided adhesive tape FLEXcon, USA DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
Cutting plotter Graphtec Corporation, Japan Graphtec CE3000-60 MK2
Spin coater MIDAS SPIN-3000D
Furnace (calcination) R. D. WEBB COMPANY WEBB 99
Rheometer (Tack test) Thermo Scientific Haake MARS III - ORM Package
Oxygen plasma system FEMTO CUTE
Monoclonal mouse antihuman hsCRP Hytest Ltd., Finland 4C28 (clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnI Hytest Ltd., Finland 4T21 (clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP Abcam plc., MA ab19175
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI Abcam plc., MA ab24460 (clone # 16A11)
hsCRP Abcam plc., MA ab111647
cTnI Fitzgerald, MA 30-AT43
Bovine Albumin Sigma-Aldrich A7906
PBS Amresco Inc E404
Blood collection tubes BD vacutainer 367844 K2 EDTA 7.2 mg plus blood
collection tubes
SuperSignal ELISA femto Invitrogen 37074
Modular multilabel plate reader Perkin Elmer Envision 2104
Disc operating machine Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea Customized
Photomultiplier tube (PMT) Hamamatsu Photonics H1189-210
AutoCAD AutoDesk Version 2012 Design software
SolidWorks 3D CAD software  SOLIDWORKS Corp. Version 2013 3D Design software,
Edgecam Vero software version 2009.01.06928 Code generating software
DeskCNC Carken Co. version 2.0.2.18 CNC milling machine software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
  2. Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
  3. Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. Biosensors and Cancer. , Science Publishers. 164-183 (2012).
  4. Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , Pan Stanford Publishing. 265-282 (2011).
  5. Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).
  6. Yang, D., et al. Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV. Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).
  7. Chantasirichot, S., Ishihara, K. Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system. Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).
  8. Zhang, N., et al. Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).
  9. Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics. Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).
  10. Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).
  11. Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles. Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).
  12. Liu, S., Chen, A. Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing. Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).
  13. Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts. J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).
  14. Dettin, M., et al. Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).
  15. Kim, W. -J., et al. Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group. Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).
  16. Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -G. Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).
  17. Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays. Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).
  18. Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
  19. Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors. Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).
  20. Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays. ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).
  21. Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -R., Park, Y. -S., Cho, Y. -K. Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood. Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).
  22. Li, D., Xia, Y. Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning. Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).
  23. Lombard, M. SolidWorks 2013 BIBLE. , John Wiley & Sons Inc. Indianapolis, IN. (2013).
  24. Tickoo, S. EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , CADCIM Technologies. Schererville, IN. (2007).
  25. Zhu, R., et al. Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices. Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).
  26. Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -P. TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells. Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).
  27. Katsuhiro, O., et al. Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications. Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).

Tags

Biyomühendislik Sayı 110 lab-on-a-disk elektrospinning TiO immunoassay tam otomasyon transfer baskı on-disk algılama düşük hacimli tahlil tam kan ultrasensitif
Tüm Blood adlı ultrasensitive Protein Algılama için Tam Otomatik Santrifüj mikroakışkan Cihazı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, Y. S., Sunkara, V., Kim, Y.,More

Park, Y. S., Sunkara, V., Kim, Y., Lee, W. S., Han, J. R., Cho, Y. K. Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood. J. Vis. Exp. (110), e54143, doi:10.3791/54143 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter