Introduction
Эндоспоры метаболически покоящиеся формы бактерий, которые позволяют бактериям сохраняться в неблагоприятных условиях. Во многих спорообразующих бактерий, образование спор индуцируется недостатка питательных веществ , но этот процесс может контролироваться изменением до рН, воздействия кислорода или других напряжений 1. В то время как в их метаболически латентной форме спор, бактерий противостоять УФ - излучения, высушивание, более высокие температуры и заморозки 2. Большая часть знаний о процессе спорообразования исходит из исследований в модели организма, Сенная палочка. Процесс спорообразования начинается процесс репликации ДНК и образованием осевого 3,4 нити. Асимметричным перегородку затем делит клетку на две неравные размерных отсеков. Чем больше отсек, материнская клетка, поглотит меньший отсек, в forespore. И мать клетки и forespore координируют экспрессию генов созревать спору и материнской клетки в конечном итоге лизирует, выпустив Дормант Спора в окружающую среду 1.
Структура и состав спорово сохраняется во многих видов бактерий. Ядро Спора имеет более низкое содержание воды , чем в растительной клетке , и богата дипиколиновая кислоты (ДПА) 1,2. Во время образования спор ДПА перекачивается в активную зону споровой в обмен на воду. Вокруг ядра является внутренняя мембрана Спора , где в большинстве спорообразующих бактерий, рецепторы , которые распознают небольшие молекулы , которые стимулируют прорастание (germinants) расположены 2. Расположенный в непосредственной близости внутренней мембраны Спора представляет собой слой пептидогликана клеточной стенки. Специализированный пептидогликана слой (кора головного мозга) окружает клеточной стенки пептидогликана и состоит из многих из тех же компонентов, как клеточной стенки пептидогликана [чередующимися N-ацетилглюкозамина (NAG) и N-ацетилмурамовой кислоты (NAM)]. Тем не менее, примерно 50% остатков NAM в коре, были преобразованы в мурамовой-б-лактамные 5,6 2.
Управление процессом прорастания является критически важным для спорообразующих бактерий. Всхожесть инициируется , когда germinant рецепторы взаимодействуют с соответствующими germinants 2. Во многих спорообразующих бактерий, эти germinants являются аминокислоты, сахара, нуклеотиды, ионы или их комбинации 2. С. несговорчивый прорастание спор инициируется комбинаций определенных желчных кислот, [например, таурохолевая кислота (TA)] и аминокислот (например, глицина) 7-10. Хотя существуют различия между С. несговорчивый прорастание пути и пути изученных в других спорообразующихбактерии, такие как B. Сенная, общим для всех является абсолютным требованием , чтобы ухудшить спорами кору головного мозга , чтобы позволить вегетативные клетки расти из проросших спор 2,8. Деградация Cortex может быть достигнуто с помощью SCLEs CwlJ / SleB (как найдено в B. Сенная) или SLEC (например, во многих клостридий). гидролиз Cortex уменьшает ограничение на клеточной стенке и спорами. Это позволяет полный основной регидратации, необходимый шаг в реактивации многие из белков , необходимых для клеточного метаболизма 2.
Когда споры прорастают, недействующие изменения споровые из состояния фазы яркий в состояние фазы темноте, и этот процесс может быть измерено по изменению оптической плотности (OD) при 600 нм 11. В предыдущем докладе говорится , что большая часть этого изменения в ОД связано с выходом ДПА из спору 12. Во время нашего недавнего исследования, мы стремились сравнить сроки C. несговорчивый Прорастание спор и отслеживаетсявыпуск DPA и фрагментов коры головного мозга 9. Для этого исследования было важно контролировать выделение фрагментов коры головного мозга, когда они начали быть освобождены прорастающих спор.
Колориметрический анализ , используемый здесь был основан на методе обнаружения сахаров с отрезными концами разработаны Ghuysen и др. 13. Так как другие описали протоколы для обнаружения восстанавливающих сахаров 14 или модифицировали эти протоколы 15, литература по этому вопросу может привести к путанице. Здесь мы подробно метод шаг за шагом для колориметрического обнаружения восстанавливающих сахаров , освобожденной от прорастающих C. несговорчивый спорами. Хотя это исследование использует C. несговорчивый споры, восстанавливающие сахара , выделяющиеся во время прорастания спор из других спорообразующих бактерий могут быть обнаружены с этим протоколом 9,16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Генерирование Образцы
- Тепло активировать C. несговорчивый споры при 65 ° С в течение 30 мин и хранить на льду.
Примечание: C. Споры несговорчивый могут быть получены и очищены , как описано ранее 7,9,10. - Приготовьте раствор всхожесть на X + 1 мл, где Х обозначает число выборок, которые необходимо принять во время теста.
Примечание: Решение прорастание является специфическим для Spore изучаемые виды бактерий. Для опробования C. несговорчивый Прорастание спор, мы использовали раствор 10 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 100 мМ глицин и 10 мМ таурохолевая кислоты в деионизированной воде. - Перед началом теста, рисовать 1,0 мл пробу раствора для проращивания без спор, чтобы служить в качестве заготовки для обнаружения фрагмента коры головного мозга.
- Добавить спор на OD 600 из ~ 3,0 до раствора для проращивания и вихря быстро.
Примечание: Для наших исследований в всхожести B. Сенная, мы использовали тот же OD 600 Споры , как для C. несговорчивый.
Примечание: Это количество спор хорошо работает для мониторинга фрагмента коры головного мозга во время высвобождения C. несговорчивый прорастание спор. Количество спор, используемый в этом тесте должны быть определены экспериментально для каждой бактерии или штамма. - Удаление 1,2 мл образца сразу же после добавления спорами и центрифугировать при комнатной температуре в течение 1 мин при 14000 & bull; g. Это точка нулевое время.
- Передача 1,0 мл надосадочной жидкости из центрифугированной пробы в свежую пробирку для последующего анализа фрагментов коры головного мозга.
Примечание: Если ДПА необходимо контролировать, удалить отдельную пробу объемом 100 мкл для выявления ДПВ в растворе с использованием анализа , основанного на тербия флуоресценции 9,18,19. - Замораживание собранного образца при температуре -80 ° С.
- Повторите шаги 1.4 и 1.5 через регулярные промежутки времени, пока все моменты времени не завершено.
Примечание: Из-за времени, необходимого для центрифугирования и отбора проб, моменты времени меньше йAn 2 мин друг от друга не было возможно во время нашей процедуры, так что наши интервалы выборки были один раз каждые 2 мин в течение 14 мин. - В качестве положительного контроля для снижения сахара обнаружения и количественной оценки, включают в себя следующие суммы N -acetylglucosamine (нмоль): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 и 5000. Подготовка этих образцов в то же время как образцы коры головного мозга и работать вместе с образцами коры головного мозга таким образом, что стандартная кривая имеет отношение к данным, генерируемых прорастающих спор.
- После того, как все образцы временной точки собраны, лиофилизации образцы.
Примечание: Мы лиофилизировали наши образцы в 2 мл завинчивающейся крышкой трубки.
2. Измерение Cortex Фрагменты
- Ресуспендируют лиофилизированных образцов в 120 мкл 3 N HCl с добавлением 1% фенола и 0,5% бета-меркаптоэтанол.
- Передача ресуспендировали образцов в 2-мл завинчивающейся крышкой трубки.
Примечание: Для воспроизводимости, обеспечить все Лиофилизированный образец вновь суспендируют и передан. <Li> Инкубируйте образцы на водяной бане рециркуляционным при 95 ° С в течение 4 часов. - После инкубации поместите образцы на льду, пока они не остыли.
- Нейтрализовать образцы с 120 мкл 3 М NaOH.
- Добавляют 80 мкл насыщенного раствора бикарбоната натрия и 80 мкл 5% -ного раствора ангидрида уксусной кислоты в каждом образце и вихря.
- Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Передача образцов обратно в C водяной бане 95 ° в течение ровно 3 мин.
Примечание: Этот шаг является чувствительным ко времени и более длительное время может повлиять на развитие нисходящего сигнала. - Удалить образцы из водяной бани и охлаждают на льду.
- Добавить 400 мкл 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O в каждую пробирку и вихря.
- Инкубируйте образцы на водяной бане рециркуляционным при 95 ° С в течение ровно 7 мин.
Примечание: Этот шаг является чувствительным ко времени и более длительное время может повлиять на развитие нисходящего сигнала. - Удалитьобразцы и место на льду в течение 5 мин.
3. Цвет Реагент
- В то время как образцы на льду (шаг 2,12), подготовить реагент цвета. Растворите 0,320 г р -dimethylaminobenzaldehyde (КСППР; реагента Эрлиха) в 1,9 мл ледяной уксусной кислоты.
Примечание: Реагент время, температура и чувствительна к свету и не должны быть сделаны заранее. - После того, как КСППР полностью растворяется, добавляют 100 мкл 10 N HCl и вихря.
- Добавляют 5 мл ледяной уксусной кислоты и вихря.
4. колориметрической реакции
- Передача 100 мкл каждого образца охлажденный кортекса к новой 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Добавьте 700 мкл свежеприготовленного раствора цвета для каждого образца.
- Немедленно передать образцы на C водяной бане при 37 ° и инкубировать в течение 20 мин ТОЧНО.
- Перенести 200 мкл каждого образца в виде прозрачного 96-луночного планшета.
- Количественно образцов при 585 нм на пластинечитатель. Образцы должны начинаться в желтый цвет и положительная реакция будет переходить на фиолетовый. Чем больше коры головного мозга присутствует, тем глубже фиолетовый цвет.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В таблице 1 приведены типичные результаты с использованием стандартов Nag. Данные используются для получения стандартной кривой. В таблице 2 представлены типичные результаты анализа на всхожесть всхожесть буфере с добавлением 100 мМ 10 мМ TA (всхожесть условиях , способствующих образованию ) глицина и или 100 мМ глицина только (условия не прорастающих). При отсутствии Т.А., С. несговорчивый споры не прорастают , и есть небольшие изменения в присутствии фрагментов коры головного мозга в растворе. Тем не менее, в присутствии как ТА и глицин, C. несговорчивый споры прорастают и освободить фрагменты коры в раствор. Это наблюдается как увеличение наружного диаметра 585 с течением времени прореагировавшего образцов. Общее количество фрагментов коры (нмоль) , выделяющихся при данном анализе рассчитывали с использованием стандартной кривой , аналогичный фигуре 1В. В этом анализе, большая часть коры гидролизуется (или отпущена) на 15 минут, пост-germinant экспозиции, предполагая , что большинство спор проросли в этот период времени (рисунок 2, в соответствии с предыдущей публикации 7).
После разработки образцов в реагенте цвета, большинство образцов не может показать фиолетового цвета невооруженным глазом. На рисунке 1 показана репрезентативная выборка генерируется из N-ацетилглюкозамина. Многие из образцов не показывают видимого фиолетового цвета. Тем не менее, в 250 нмоль, 500 нмоль и 5000 нмоль выборки появляются визуально отличается от отрицательного контроля (0 нмоль). При измерении на OD 585 нм, генерируемый сигнал наилучшим образом соответствует линейной регрессии (R 2 = 0,999).
Рисунок 1:. Детектирование N-ацетилглюкозамина образцов (А) N-ацетилглюкозамина (0 нмоль, 12,5 нмоль,25 нмоль, 50 нмоль, 100 нмоль, 250 нмоль, 500 нмоль, 5000 нмоль) лиофилизировали и подвергали взаимодействию в соответствии с процедурой, описанной. (В) Образцы были добавлены к пластине 96-луночного и количества прореагировавшего материала обнаруженного при 585 нм. Сигнал был использован для получения стандартной кривой. 
Рисунок 2:. Графическое представление результатов всхожести Рассчитанное нмоль кортекс в таблице 2 , наносили на график в зависимости от времени. (●) 100 мМ глицин + 10 мМ ТА; (■) 100 мМ глицина. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| NAG Концентрация (нмоль) | OD 585 |
| 0 | 0,047 |
| 12,5 | 0.054 |
| 25 | 0.066 |
| 50 | 0.084 |
| 100 | 0.128 |
| 250 | 0.285 |
| 500 | 0,556 |
| 5000 | 4.0 |
| пусто = | 0,046 |
Таблица 1: НАГ стандарт.
| Clostridium несговорчивый прорастание спор | ||||
| Прорастание раствор (10 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ NaCl), | ||||
| 100 мМ глицин + 10 мМ Т.А. | 100 мМ глицина | |||
| Время (в минутах) | OD 585 | Рассчитано (нмоль) | OD 585 | Рассчитано (нмоль) |
| 0 | 0,046 | 0.00 | 0,047 | 0.00 |
| 2 | 0,048 | 2,54 | 0,048 | 1,27 |
| 4 | 0,05 | 5,07 | 0,049 | 2,54 |
| 6 | 0.055 | 11,41 | 0,05 | 3,80 |
| 8 | 0,059 | 16.49 | 0,05 | 3,80 |
| 10 | 0.06 | 17.76 | 0.051 | 5,07 |
| 12 | 0,061 | 19,02 | 0,05 | 3,80 |
| 14 | 0,063 | 21.56 | 0.051 | 5,07 |
Таблица 2: Пример Spore Germinatiпо результатам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При стимуляции, спорами происходит процесс прорастания теряют свои свойства сопротивления без необходимости синтеза макромолекул. Когда спор прорастание срабатывает, ядро Спора выпускает DPA в обмен на воду 2. Из - за высокого содержания DPA неактивного споровых, ядро Спора под сильным осмотического давления и специализированной пептидогликана, коры, помогает предотвратить ядро от опухоли, действуя, по- видимому, в качестве барьера для расширения 2.
Описанный выше способ использует реактив Эрлиха (раствор желтого цвета), чтобы обнаружить присутствие редуцирующих сахаров в качестве измеримого перехода к фиолетовым отливом. Во время гидролиза коры головного мозга, NAG и NAM сахара освобождаются (в зависимости от степени гидролизовать ферментов, сахара могут быть освобождены в качестве дисахаридов или полисахаридами). Гидролиз гликозидных связей с помощью HCl (этап 2.1) генерирует моносахариды со свободными концами , снижающих 7. После того, как neutralizИнг кислоты с равным количеством гидроксида натрия (этап 2.5), спирты , окружающие NAG и NAM моносахариды ацилируют уксусным ангидридом (этап 2.6) 13. Впоследствии, не вступивший в реакцию уксусный ангидрид превращается в уксусную кислоту, путем нагрева образца (этап 2.8). Как выдвинули гипотезу , Морган и Элсон 20, терминал альдегид самопроизвольно превращается в енольной форме. В щелочных условиях (этап 2.10), эта енольная форма может реагировать с соседним ацетила генерировать производное оксазола , которое вступает в реакцию с реагентом Эрлиха (этап 4.3) , чтобы генерировать фиолетовый цвет 15,20.
Этот описанный выше метод дает последовательные, надежные результаты для обнаружения фрагментов коры головного мозга от прорастающих спор, как B. Сенная и C. несговорчивый 9,16,17. Анализ требует особого внимания , чтобы обеспечить время реакции, температуры и процедуры выполняются с точностью. Без должного вниманияк деталям, его легко условия реакции потерпеть неудачу или не воспроизводят между экспериментами 13. Тем не менее, включение стандартного пособия НАГ в применении анализа между лабораторных условиях. Положительный стандарт управления NAG включены в каждый эксперимент управления для любого между экспериментальной изменчивости (например, небольшие изменения в продолжительности реакции или эффективности реагента цвета). Реакции с использованием только буферных условий и реакции со спорами, неспособных к гидролизу коры головного мозга как не дали каких-либо изменений в цвете.
Наиболее распространенная проблема с этим методом интер-экспериментальная изменчивость или полное отсутствие сигнала. Для контроля за вариабельности, препараты споровые должны быть свободны от любых вегетативного остатков клеток. Это остатки клеток будет содержать фрагменты пептидогликана (NAG и NAM) и приведет к высоким фонового сигнала для прорастающих спор. Для того, чтобы обеспечить чистый препарат спор (> 99,9%) спорами, относятся к literatuRe для методов , чтобы подготовить чистые суспензии спор в организме , чтобы изучать 7,9,21-23.
Если анализ не приносит никакого заметного сигнала, мы наблюдали, что этап лиофилизации может ввести изменчивость. Из-за силы, с которой вакуум освобождается, мы наблюдали, что высушенный порошок образец может быть унесено из образца трубы. Чтобы уменьшить / предотвратить это, используйте маленькую иглу шприца, чтобы ткнуть отверстия в вершинах пробирок. Небольшая площадь введенных отверстий уменьшит вероятность лиофилизированного образца (в настоящее время в виде порошка) от нарушения. И, наконец, как было отмечено в вышеприведенных способах, несколько стадий инкубации очень чувствительным ко времени. Убедитесь, что все шаги, приуроченные под тщательным наблюдением. Важным моментом в этом анализе является то, что фрагменты коры головного мозга, должны быть освобождены от прорастающих спор, для того, чтобы быть обнаружены. Если кора головного мозга гидролизуют в крупные фрагменты, эти фрагменты могут быть слишком большими, чтобы быть ReleAsed через споровой пальто. Хотя важным фактором при устранении неполадок эксперимент, который не дает сигнал, мы рекомендуем, чтобы подтвердить, что условия, используемые для прорастают большинство спор в растворе и другие варианты поиска и устранения неисправностей, перечисленных здесь до рассмотрения размер фрагмента коры головного мозга в качестве потенциальной проблемы в анализ.
Не все прорастание буферы / условия подходят для данного анализа. Поскольку этот анализ обнаруживает присутствие восстанавливающих сахаров , освобожденные в ходе процесса проращивания 13, любой проращивания буфер, содержащий редуцирующие сахара , или любой germinant , который, само собой, восстанавливающий сахар (например, глюкоза) , приведет к сильным сигналом в этом анализе. Если дело обстоит именно так, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) может быть использован для обнаружения присутствия фрагментов коры головного мозга 24-26. Тем не менее, так как не все лаборатории оснащены такой аппаратуры, описанный здесь способ может быть использован наиболеелаборатории и предлагает простые и легко поддающиеся количественной оценке результаты.
Прорастание спор бактерий в значительной степени изучены и Bacillus несколько видов Clostridium 2,8. Процесс, как правило, сохраняется, однако существуют различия. Важно отметить, что не все организмы прорастают с использованием механизмов прорастания спор , как наблюдалось в модельных спорообразные 9,27. Поскольку прорастание становится изучен в более разнообразных организмов, анализа, описанного выше, могут быть применены к этим организмам, чтобы обнаружить фрагменты коры во время прорастания. Применяя этот метод для этих вновь изученных организмов, исследователи могут определить роль различных прорастание белки играют в гидролизе коры головного мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Проект описывается при поддержке премии Номер 5R01AI116895 из Национального института аллергии и инфекционных заболеваний. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института аллергии и инфекционных заболеваний или Национального института здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p200 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p20 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| 100 - 1,250 μl pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1 - 200 μll pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid - 10 N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine |
References
- Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
- Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
- Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
- Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
- Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
- Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22 (7), (2014).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197 (14), (2015).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).
- Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
- Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).
- Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
- Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
- Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
- Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
- Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
- Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
- Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
- Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
- Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
- Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
- Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
- Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
- Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
- Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
- Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).
