Introduction
芽孢是细菌代谢，使细菌在不利的环境中坚持的休眠形式。在许多孢子形成细菌，孢子形成是通过营养剥夺诱导但此过程可通过改变pH值，暴露于氧或其它应力1进行控制。而在其代谢休眠孢子形式，细菌抵抗紫外线辐射，干燥，更高的温度，和冷冻2。最上的孢子形成过程的知识来自在模式生物的研究， 枯草芽孢杆菌 。在孢子形成过程开始于DNA复制和轴向灯丝3,4的形成。非对称隔膜然后把细胞分成两个大小不等车厢。较大的隔间里，母细胞，吞噬较小的隔间里，forespore。无论是母细胞和forespore协调基因表达成熟的孢子母细胞裂解最终，释放多尔曼吨孢子到周围环境中1。
孢子的结构和组合物在许多细菌物种保守的。孢子芯具有比营养细胞低水含量和有丰富的吡啶二羧酸（DPA）1,2。期间形成孢子，DPA被泵入孢子芯换取水。围绕核心的是一种内在的孢子膜的地方，在多数孢子形成的细菌，其中认识到刺激发芽（germinants）的小分子的受体位于2。刚好位于孢子的内膜外是细胞壁肽聚糖的层。一个专门的肽聚糖层（皮层）围绕细胞壁肽聚糖，并且由许多相同的部件，细胞壁肽聚糖[交替的N-乙酰葡糖胺酶（NAG）和N-乙酰胞壁酸（NAM）]的。但是，在皮质的NAM残基的约50％已被转化为胞壁-δ内酰胺5,6- 2几层。
控制发芽的方法对于形成孢子的细菌至关重要。当开端受体各自germinants 2交互萌发开始。在许多孢子形成的细菌，这些germinants是氨基酸，糖，核苷酸，离子或它们的2组合。C.难辨孢子萌发是由某些胆汁酸，[ 例如 ，牛磺胆酸（TA）]和氨基酸（ 例如 ，甘氨酸）7-10的组合引发。虽然有在C之间的差异难辨发芽途径和在所研究的途径其他孢子形成细菌，如B.枯草芽孢杆菌，共同所有的降解孢子皮质以允许营养细胞以从发芽孢子2,8成长的绝对要求。皮质降解可由SCLEs CwlJ / SleB来实现或SLEC（如在枯草芽孢杆菌中发现）（如在许多梭菌找到）。皮质水解降低了细胞壁和孢子的约束。这允许充分芯补液，在重新激活许多必需的细胞代谢2蛋白质的一个必要步骤。
当孢子发芽，从相亮状态到相暗状态，这个过程的休眠孢子的变化可以通过在600光密度（OD）的变化来测量 纳米11。先前的一份报告表明，在很多OD这一变化是由于DPA从12孢子释放。在我们最近的研究中，我们试图比较C的定时难辨孢子萌发和监测DPA和皮质碎片9的释放。在这项研究中是至关重要的监测皮质片段的释放，他们开始由萌芽孢子被释放。
此处所使用的比色测 定法是基于与还原末端检测糖的方法开发Ghuysen 等 13。因为其他人描述协议检测还原糖14或修改这些协议15，关于这一问题的文献可能会造成混淆。在这里，我们详细地一步一步方法还原糖的比色检测从发芽C.解放艰难梭菌芽孢。虽然本研究采用C.艰难梭菌芽孢，从其他孢子形成的细菌孢子的发芽过程中释放的还原糖能够与该协议9,16,17进行检测。
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Protocol
1.生成样本
- 热激活C.难辨孢子在65℃下30分钟，并存储在冰上。
注：C.如先前7,9,10所述艰难梭菌芽孢可以产生并纯化。 - 准备在X + 1毫升，其中X是在测定期间要采取的样本数萌发溶液。
注意：萌发溶液是特定细菌的物种孢子正在研究中。用于测定C.难辨孢子萌发，我们使用的10mM Tris（pH值7.5），150毫摩尔NaCl，在去离子水中的100mM甘氨酸和10mM牛磺胆酸的溶液。 - 在开始测定前，画出萌发溶液中的1.0 ml样品无孢子作为皮质片段检测空白。
- 加入孢子的外径〜3.0发芽解决方案，并迅速涡旋600。
注意：如果您在B.萌发研究枯草芽孢杆菌 ，我们使用相同的外径600孢子为C.难辨 。
注：孢子这一数额C.期间行之有效的监测皮质片段发布难辨孢子萌发。孢子在该试验中所使用的量应通过实验为每个细菌或应变来确定。 - 在14000×g下加入孢子和离心机在室温下1分钟后，立即删除在1.2 ml样品。这是在零时间点。
- 传送将1.0ml上清液从离心样品到新管用于随后皮质片段分析。
注意：如果DPA需要监控，取出一个单独的100微升样品在使用基于铽荧光9,18,19的测定溶液中的检测DPA的。 - 冷冻在-80℃下收集的样品。
- 定期重复步骤1.4和1.5，直到所有的时间点完成。
注：由于时间的关系所需的离心和取样时间点少次我们的过程期间的2分钟分开是不可能的，所以我们的采样间隔是一次14分钟每2分钟。 - 至于还原糖的检测和定量阳性对照，包括以下少量的正 -acetylglucosamine（纳摩尔）的：0，12.5，25，50，100，250，500，5000。同时作为皮质样品制备这些样品，并与皮质样品，使得标准曲线是有关由萌芽孢子产生的数据一起运行。
- 所有时间点样品的采集后，冻干样品。
注意：我们冻干我们的样品在2ml螺旋盖试管中。
2.测量皮质碎片
- 在3当量盐酸的120微升补充有1％的苯酚和0.5％β巯基乙醇悬浮冻干样品。
- 传送再悬浮样本以2毫升螺旋盖试管中。
注意：对于重复性，确保所有的冻干样品重悬于和转让。 <利>孵育再循环水浴将样品在95℃下4小时。 - 孵育后，将样品置于冰上，直到他们都很酷。
- 用120微升3 M氢氧化钠的中和样品。
- 添加80μl的饱和碳酸氢钠溶液和80μl的5％的乙酸酐溶液于每个样品和旋涡。
- 在室温下孵育样品10分钟。
- 转移样本回95℃水浴正好3分钟。
注意：此步骤是时间敏感的和更长的时间能影响下游信号的发展。 - 从水浴中取出样品，并在冰上冷却。
- 添加6.54％K 2 B 4 O 7·4H 2 O 400微升，每管和旋涡。
- 孵育在再循环水浴将样品在95℃EXACTLY 7分钟。
注意：此步骤是时间敏感的和更长的时间能影响下游信号的发展。 - 去掉样品，并在冰上地方5分钟。
3.显色剂
- 虽然样本上冰（步骤2.12），备显色剂。溶解0.320克对 -dimethylaminobenzaldehyde的; 1.9毫升冰醋酸的（DMAB埃利希氏试剂）。
注：试剂是时间，温度和光敏感，并且不应提前进行。 - 在DMAB完全溶解后，加入100微升10 N HCl和旋涡。
- 加入5毫升冰醋酸和旋涡。
4.显色反应
- 转移100μl的每个冷却皮质样品到一个新的1.5 ml离心管。
- 添加新鲜制备的色溶液至各样品的700微升。
- 立即将样品转移到37℃水浴中孵育整整20分钟。
- 转移200μl的各样品，以清晰的96孔板中。
- 在量化波长585样本一盘读者。样本应开始以黄色和阳性反应将转向紫色。越皮质目前，较深的紫色。
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Representative Results
表1示出了使用NAG标准的典型结果。数据被用于产生标准曲线。 表2示出从发芽缓冲器萌发测定补充有100mM的甘氨酸和10mM TA（发芽促进条件）或100mM的甘氨酸只（非发芽条件）的典型结果。在不存在TA，C的艰难梭菌芽孢不发芽并且在皮质片段在溶液中存在的小的变化。然而，在这两个TA和甘氨酸，C的存在艰难梭菌芽孢发芽并释放皮质片段在溶液中。这被观察为在反应样品的时间的增加的OD 585。该测定过程中释放皮质片段（纳摩尔）的总量，使用类似于图1B的标准曲线来计算。在该试验中，大部分的皮质的水解（或释放）为15分钟后开端曝光，这表明大部分孢子在这个时间帧已发芽（ 图2;与先前出版物7一致）。
显影在彩色试剂的样品后，大多数样品可能不会显示紫色肉眼。 图1示出了从N-乙酰氨基葡糖产生的有代表性的样品。许多样品不显示可见紫色。然而，250纳摩尔，500纳摩尔和5000纳摩尔样品出现从阴性对照组（0纳摩尔）目视不同。当在OD 585处测量，所产生的信号最适合的线性回归（R 2 = 0.999）。
图 1： 检测N-乙酰葡糖胺 （A）的N-乙酰氨基葡糖的样品（0纳摩尔，12.5纳摩尔，25纳摩尔，50纳摩尔，100纳摩尔，250纳摩尔，500纳摩尔，5000纳摩尔）按照所述步骤冻干并反应。 （B）的样品加入到96孔板中并在585处检测到的反应材料的量。该信号被用来产生标准曲线。 
图 2： 萌发结果的图形表示在表2中的计算纳摩尔皮质与时间的关系。 （●）100毫米甘氨酸+ 10毫米TA; （■）100毫米甘氨酸。 请点击此处查看该图的放大版本。
| NAG浓度（纳摩尔） | OD 585 |
| 0 | 0.047 |
| 12.5 | 0.054 |
| 25 | 0.066 |
| 50 | 0.084 |
| 100 | 0.128 |
| 250 | 0.285 |
| 500 | 0.556 |
| 5000 | 4 |
| 空白= | 0.046 |
表1：NAG标准。
| 艰难梭菌孢子萌发 | ||||
| 发芽溶液（10mM的Tris（pH值7.5），150mM的NaCl）中 | ||||
| 100毫米甘氨酸+ 10毫米TA | 100毫米甘氨酸 | |||
| 时间（分钟） | OD 585 | 计算（纳摩尔） | OD 585 | 计算（纳摩尔） |
| 0 | 0.046 | 0.00 | 0.047 | 0.00 |
| 2 | 0.048 | 2.54 | 0.048 | 1.27 |
| 4 | 0.05 | 5.07 | 0.049 | 2.54 |
| 6 | 0.055 | 11.41 | 0.05 | 3.80 |
| 8 | 0.059 | 16.49 | 0.05 | 3.80 |
| 10 | 0.06 | 17.76 | 0.051 | 5.07 |
| 12 | 0.061 | 19.02 | 0.05 | 3.80 |
| 14 | 0.063 | 21.56 | 0.051 | 5.07 |
表2：样品孢子Germinati对结果的。
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Discussion
在刺激时，进行发芽的过程孢子丧失其抗损伤性，而无需大分子合成。当孢子萌发被触发时，孢子释放核心DPA，以换取水2。由于休眠孢子的高DPA含量，孢子核心是在强烈渗透压和专门肽，皮质，有助于防止芯从通过作用，据推测，作为屏障，以扩张2肿胀。
上述的方法使用艾氏试剂（黄色溶液），以检测还原糖作为可测量的移位到紫色色调的存在。期间皮质水解，NAG和NAM糖解放（取决于水解酶的程度，糖类可以解放如二糖或多糖）。由盐酸（步骤2.1）的糖苷键的水解与自由还原端7产生单糖。 neutraliz后用等量的氢氧化钠（步骤2.5）ING酸，包围NAG醇类和NAM单糖是由乙酸酐酰化（步骤2.6）13。接着，未反应的乙酸酐是通过加热样品（步骤2.8）转化为乙酸。由于假设由摩根和埃尔森20，终端醛自发地转化为烯醇式。在碱性条件下（步骤2.10），此烯醇形式可以与相邻的乙酰反应以产生其中用Ehrlich试剂（步骤4.3），以产生紫色15,20反应的恶唑衍生物。
上述这种方法产生的检测皮质碎片一致的，可靠的结果，从萌芽孢子，无论是B.枯草和C.难辨 9,16,17。该试验需要特别注意以确保时间，温度和程序的精度进行该反应。如果没有适当关注细节，很容易在反应条件失败或不实验13之间再现。然而，在实验室环境之间的测定的应用中纳入NAG标准助剂。包括在任何跨实验变异性（ 例如，在反应时间的细微变化，或显色剂的有效性），每一个实验对照组的NAG阳性对照标准。仅使用缓冲液条件和孢子不能水解皮质两者的反应的反应，得到了无颜色变化。
这种方法的最常见的问题是跨实验变异或完全没有信号。为了控制的可变性，孢子制剂必须无任何营养细胞碎片。此细胞碎片将包含肽片段（NAG和NAM），并会导致对萌芽孢子高背景信号。以确保纯孢子制剂（> 99.9％孢子），指的是literatu重新为方法，以在生物体准备纯孢子悬浮液进行研究7,9,21-23。
如果该测定没有产生任何可检测的信号，我们观察到，冻干步骤可以引入可变性。由于与该释放真空的力，我们观察到干燥后的样品的粉末可以吹出的样品管。为了减少/防止这种情况发生，使用一个小的注射器针头戳在样品管的顶部孔。引入孔的小区域将受到干扰（粉末形式现在）降低冻干样品的可能性。最后，如在上述方法中指出的那样，几个孵育步骤都非常时间敏感。确保所有定时步骤仔细监测。对于该测定的一个重要考虑因素是，皮质碎片必须从发芽孢子被释放以便被检测到。如果皮层被水解成较大的碎片，这些碎片可能太大是RELE通过芽孢外壳ASED。虽然一个重要的考虑因素的故障排除的实验不产生信号时，我们建议，以确认使用的条件发芽最此处列出在溶液中的孢子和其它故障排除之前考虑皮质片段大小作为一个潜在的问题化验。
不是所有的发芽缓冲器/条件是适合于这种检测。因为该测定法检测减少在发芽过程13，它包含还原糖或即，本身的任何开端，还原糖任何发芽缓冲解放糖的存在（ 例如 ，葡萄糖），将导致在该测定中的强烈信号。如果是这种情况，高压液相色谱（HPLC）可用于检测皮质片段24-26的存在。然而，因为不是所有的实验室都配备这样的仪器，本文描述的方法可以通过使用最多的实验室和提供简单且容易量化的结果。
通过发芽细菌孢子已经在很大程度上被研究芽孢杆菌和少数梭菌属2,8。该方法一般保守的，但是存在差异。重要的是，并不是所有的生物体发芽作为模型孢子形成剂9,27观察用孢子萌发的机制。因为发芽在更加多样的生物变得研究，上述测定可用于这些微生物孢子萌发期间检测皮质片段。通过应用该方法对这些新研究的生物体，研究人员能够确定皮质水解作用的各种蛋白质发芽玩。
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Acknowledgments
描述该项目由奖号5R01AI116895从过敏和传染病国家研究所的支持。内容完全是作者的责任，并不一定代表国家过敏和传染病研究所和美国国立卫生研究院的官方意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p200 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p20 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| 100 - 1,250 μl pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1 - 200 μll pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid - 10 N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine |
References
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