Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Afsløring Cortex Fragmenter Under Bakteriel Spore Spiring

doi: 10.3791/54146 Published: June 25, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Endosporer er metabolisk hvilende former for bakterier, der tillader bakterierne at persistere i ugunstige miljøer. I mange sporedannende bakterier, er sporedannelse induceret af næringsberøvelse men denne proces kan kontrolleres ved ændringer i pH, eksponering for oxygen eller andre belastninger 1. Mens der i deres metabolisk hvilende spore form bakterier modstå UV-stråling, udtørring, højere temperaturer, og frysning 2. Det meste af viden om sporulering proces kommer fra undersøgelser i modelorganismen, Bacillus subtilis. Sporuleringen begynder med DNA-replikation og dannelsen af en aksial filament 3,4. En asymmetrisk septum opdeler derefter cellen i to forskellig størrelse rum. Jo større rum, moderen cellen, opsluger de mindre rum, er forespore. Både mor celle og forespore koordinere genekspression at modne sporen og moderen cellen til sidst lyserer, slippe Dormant spore i det omgivende miljø 1.

Sporen struktur og sammensætning er konserveret på tværs af mange bakteriearter. Sporen kernen har en lavere vandindhold end den vegetative celle og er rig med dipicolinsyre (DPA) 1,2. Under sporedannelse, er DPA pumpes ind i sporen kernen i bytte for vand. Omgiver kernen er en indre sporedannelse membranen, hvor i de fleste sporedannende bakterier, er de receptorer, som genkender de små molekyler, der stimulerer spireevne (spirer) beliggende 2. Beliggende lige uden for sporen indre membran er et lag af celle væg peptidoglycan. En specialiseret peptidoglycan lag (cortex) omgiver cellevæggen peptidoglycan og er sammensat af mange af de samme komponenter som cellevæg peptidoglycan [alternerende N-acetylglucosamin (NAG) og N-acetylmuraminsyre (NAM)]. Imidlertid har ca. 50% af NAM rester i cortex blevet omdannet til muramic-δ-lactam 5,6 2.

Kontrol af processen med spiringen er kritisk vigtigt for sporedannende bakterier. Spiring påbegyndes, når germinant receptorer interagerer med deres respektive spirer 2. I mange sporedannende bakterier, disse spirerne er aminosyrer, sukkere, nukleotider, ioner eller kombinationer deraf 2. C. difficile sporespiring initieres af kombinationer af visse galdesyrer, [f.eks taurocholsyre (TA)] og aminosyrer (f.eks glycin) 7-10. Selv om der er forskelle mellem C. difficile spiring vej og de ​​undersøgte i veje andre sporedannendebakterier, såsom B. subtilis, der er fælles for alle er den absolut krav om at nedbryde sporen cortex at tillade en vegetativ celle at vokse fra de spirede Spore 2,8. Cortex nedbrydning kan opnås ved SCLEs CwlJ / SleB (som fundet i B. subtilis) eller SLEC (som findes i mange Clostridia). Cortex hydrolyse reducerer begrænsning på cellevæggen og Spore. Dette giver mulighed for fuld kerne rehydrering, et nødvendigt skridt i reaktivering mange af de proteiner, der er nødvendige for cellulære stofskifte 2.

Når sporer spirer, kan de sovende sporen skifter fra en fase-lys tilstand til en fase-mørke tilstand, og denne proces måles ved en ændring i optisk densitet (OD) ved 600 nm 11. En tidligere rapport viser, at en stor del af denne ændring i OD skyldes frigivelsen af DPA fra sporen 12. Under vores seneste undersøgelse, forsøgte vi at sammenligne timingen af C. difficile sporespiring og overvågetfrigivelse af DPA og cortex fragmenter 9. Til denne undersøgelse var det afgørende at overvåge frigivelse af cortex fragmenter, da de begyndte at blive frigivet ved spire sporer.

Den kolorimetrisk analyse anvendes her var baseret på en fremgangsmåde til påvisning sukkerarter med reducerende ender udviklede Ghuysen et al. 13. Fordi andre har beskrevet protokoller til påvisning af reducerende sukkerarter 14 eller har ændret disse protokoller 15, kan litteraturen om dette emne være forvirrende. Her har vi detaljeret en trin-for-trin metode til kolorimetrisk påvisning af reducerende sukkerarter frigivet i at spire C. difficile sporer. Selvom denne undersøgelse benytter C. difficile sporer, de reducerende sukkere frigjort under spiring af sporer fra andre sporedannende bakterier er i stand til at blive detekteret med denne protokol 9,16,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Generering Prøver

  1. Heat aktivere C. difficile sporer ved 65 ° C i 30 minutter og opbevares på is.
    Bemærk: C. difficile sporer kan produceres og oprenses som tidligere 7,9,10 beskrevet.
  2. Forbered spiring løsning på X + 1 ml, hvor X er antallet af prøver, der skal tages i løbet af analysen.
    Bemærk: Den spiring løsning er de specifikke arter af bakterier Spore blive undersøgt. Til analyse C. difficile sporespiring anvendte vi en opløsning af 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 100 mM glycin og 10 mM taurocholsyre i deioniseret vand.
  3. Inden analysen startes, tegne en 1,0 ml prøve af spiringen løsning uden sporer til at tjene som et råemne til cortex fragment detektion.
  4. Tilføj sporer til en OD 600 på ~ 3,0 til spiring opløsning og vortex hurtigt.
    Bemærk: For vores spireevne studier i B. subtilis, brugte vi den samme OD 600 sporer som for C. difficile.
    Bemærk: Denne mængde sporer arbejdede godt for overvågning cortex fragment frigivelse under C. difficile sporespiring. Mængden af ​​sporer anvendes i dette assay bør bestemmes eksperimentelt for hver bakterie eller stamme.
  5. Fjern en 1,2 ml prøve Umiddelbart efter tilsætning af sporer og centrifugeres ved stuetemperatur i 1 min ved 14.000 x g. Dette er den nul tidspunkt.
  6. Overfør 1,0 ml af supernatanten fra den centrifugerede prøve til et frisk rør til efterfølgende cortex fragment analyse.
    Bemærk: Bør DPA bør overvåges, fjerne en separat 100 pi prøve til påvisning af DPA i opløsningen ved hjælp af en analyse baseret på terbium fluorescens 9,18,19.
  7. Frys den opsamlede prøve ved -80 ° C.
  8. Gentag trin 1.4 og 1.5 med jævne mellemrum, indtil alle tidspunkter afsluttet.
    Bemærk: På grund af tid, der kræves for centrifugering og prøvetagning, tidspunkter mindre then 2 min fra hinanden ikke var muligt under vores procedure, så vores prøveudtagning intervaller var engang hver 2 min til 14 min.
  9. Som en positiv kontrol for reducerende sukker detektion og kvantificering, omfatte følgende mængder N -acetylglucosamine (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500, og 5000. Fremstille disse prøver på samme tid som cortex prøver og køre sammen med cortex prøver så standardkurven er relevant for de data, der genereres ved spire sporer.
  10. Efter at alle tidspunkt udtages, lyofilisere prøverne.
    Bemærk: Vi lyofiliseret vores prøver i 2 ml glas med skruelåg.

2. Måling Cortex Fragmenter

  1. Resuspender lyofiliserede prøver i 120 pi 3 N HCI suppleret med 1% phenol og 0,5% β-mercaptoethanol.
  2. Overfør de resuspenderede prøver til 2 ml glas med skruelåg.
    Bemærk: reproducerbarhed, sikre al den frysetørrede prøve resuspenderes og overføres.
  3. <li> Inkubér prøverne i en recirkulerende vandbad ved 95 ° C i 4 timer.
  4. Efter inkubation placere prøverne på is, indtil de er cool.
  5. Neutraliser prøverne med 120 pi 3 M NaOH.
  6. Der tilsættes 80 ul af en mættet natriumbicarbonatopløsning og 80 pi af en 5% eddikesyreanhydrid-opløsning til hver prøve og vortex.
  7. Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 10 minutter.
  8. Overfør prøverne tilbage til 95 ° C vandbad i præcis 3 minutter.
    Bemærk: Dette trin er tidsfølsomme og længere tider kan påvirke nedstrøms signal udvikling.
  9. Fjern prøverne fra vandbadet og afkøles på is.
  10. Tilføj 400 pi af 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O til hvert rør og vortex.
  11. Inkubér prøverne i en recirkulerende vandbad ved 95 ° C i nøjagtigt 7 min.
    Bemærk: Dette trin er tidsfølsomme og længere tider kan påvirke nedstrøms signal udvikling.
  12. Fjerneprøverne og anbring på is i 5 min.

3. farvereagens

  1. Mens prøverne på is (trin 2.12), forberede farve reagens. Opløs 0,320 g p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; Ehrlich-reagens) i 1,9 ml iseddike.
    Bemærk: Reagenset er tid, temperatur og lysfølsomt og bør ikke ske på forhånd.
  2. Efter DMAB helt opløses, tilsættes 100 pi 10 N HCI og vortex.
  3. Der tilsættes 5 ml iseddike og vortex.

4. kolorimetrisk reaktion

  1. Transfer 100 ul af hver afkølet cortex prøve til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  2. Tilføj 700 pi af frisk fremstillede farveopløsning til hver prøve.
  3. overdrage prøverne til et 37 ° C vandbad og inkuberes i nøjagtigt 20 minutter.
  4. Overfør 200 ul af hver prøve til en klar plade med 96 brønde.
  5. Kvantificer prøverne ved 585 nm på en pladelæser. Prøver skal starte på en gul farve og en positiv reaktion vil skifte til lilla. Jo mere cortex til stede, jo dybere den lilla farve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tabel 1 viser typiske resultater ved anvendelse NAG standarder. Data anvendes til at danne en standardkurve. Tabel 2 viser typiske resultater fra en spiring assay i spiring puffer suppleret med 100 mM glycin og 10 mM TA (spireevne-fremmende betingelser) eller 100 mM glycin kun (ikke-spirende forhold). I mangel af TA, C. difficile sporer ikke spire og der er ringe ændring i nærvær af cortex fragmenter i opløsningen. Men i nærværelse af både TA og glycin, C. difficile sporer spirer og frigivelse cortex fragmenter i opløsningen. Dette observeres som en stigning i OD 585 over tid af de omsatte prøver. Den totale mængde af cortex fragmenter (nmol) frigøres under dette assay blev beregnet ved anvendelse af en standardkurve svarende til fig 1B. I dette assay er det meste af cortex hydrolyseret (eller frigives) med 15 minutter post-germinant eksponering, hvilket antyder, at de fleste af sporerne har spiret i denne tidsramme (figur 2; linje med en tidligere publikation 7).

Efter at have udviklet prøverne i farven reagens, kan de fleste prøver ikke vise den lilla farve med det blotte øje. Figur 1 viser en repræsentativ prøve dannet fra N-acetylglucosamin. Mange af prøverne ikke udviser en synlig lilla farve. Men de 250 nmol, 500 nmol og 5.000 nmol prøver vises visuelt forskellige fra den negative kontrol (0 nmol). Når den måles ved OD 585 nm, signalet genereres bedst passer til en lineær regression (R2 = 0,999).

figur 1
Figur 1:. Detektering N-acetylglucosamin (A) N-acetylglucosamin prøver (0 nmol, 12,5 nmol,25 nmol, 50 nmol, 100 nmol, 250 nmol, 500 nmol, 5000 nmol) blev lyofiliseret og omsat ifølge den beskrevne fremgangsmåde. (B) Prøver blev tilsat til en plade med 96 brønde, og mængden af omsat materiale detekteres ved 585 nm. Signalet blev anvendt til at danne en standardkurve. Figur 2
Figur 2:. Grafisk repræsentation af spireevnen Resultater Den beregnede nmol cortex i tabel 2 blev afbildet som funktion af tiden. (●) 100 mM glycin + 10 mM TA; (■) 100 mM glycin. Klik her for at se en større version af dette tal.

NAG Koncentration (nmol) OD 585
0 0,047
12.5 0,054
25 0,066
50 0,084
100 0,128
250 0,285
500 0,556
5.000 4.0
tomme = 0,046

Tabel 1: NAG Standard.

Clostridium difficile Spore Spiring
Spiring Solution (10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl)
100 mM glycin + 10 mM TA 100 mM glycin
(Minutter) OD 585 Beregnet (nmol) OD 585 Beregnet (nmol)
0 0,046 0.00 0,047 0.00
2 0,048 2,54 0,048 1,27
4 0.05 5.07 0,049 2,54
6 0,055 11.41 0.05 3,80
8 0,059 16.49 0.05 3,80
10 0.06 17,76 0,051 5.07
12 0,061 19.02 0.05 3,80
14 0,063 21.56 0,051 5.07

Tabel 2: Prøve Spore Germinatipå resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ved stimulering, sporer gennemgår processen med spiring mister deres resistens egenskaber uden behov for makromolekylær syntese. Når sporespiring udløses, sporen kerne frigiver DPA i bytte for vand 2. På grund af det høje DPA-indhold af de sovende sporedannelse, sporen kerne er under intens osmotisk tryk, og det specialiserede peptidoglycan, cortex, hjælper med at forhindre kernen i at svulme ved at virke, formodentlig som en barriere for ekspansion 2.

Den ovenfor beskrevne metode benyttes Ehrlich-reagens (en gul opløsning) for at detektere tilstedeværelsen af ​​reducerende sukkerarter som en målelig skift til en lilla nuance. Under cortex hydrolyse, er NAG og NAM sukkere frigjort (afhængigt af omfanget af hydrolyserende enzymer, kan sukkerarterne frigøres som disaccharider eller polysaccharider). Hydrolyse af glycosidbindinger ved HCl (trin 2.1) genererer monosaccharider med frie reducerende ender 7. efter neutralizing syren med en tilsvarende mængde natriumhydroxid (trin 2.5), er alkoholerne omkring NAG og NAM monosaccharider acyleres ved eddikesyreanhydrid (trin 2.6) 13. Efterfølgende uomsat eddikesyreanhydrid omdannes til eddikesyre ved opvarmning af prøven (trin 2.8). Som hypotese af Morgan og Elson 20, terminalen aldehyd spontant konverterer til enolformen. Under alkaliske betingelser (trin 2.10), kan denne enolformen reagere med det tilstødende acetyl at generere en oxazolderivat som reagerer med Ehrlich-reagens (trin 4.3) til at generere en lilla farve 15,20.

Denne metode er beskrevet ovenfor giver ensartede, pålidelige resultater til påvisning af cortex-fragmenter fra spirende sporer, både B. subtilis og C. difficile 9,16,17. Analysen kræver særlig opmærksomhed for at sikre reaktionstider, temperaturer og procedurer udføres med præcision. Uden ordentlig opmærksomhedfor detaljer, er det let for reaktionsbetingelserne til at mislykkes eller ikke reproducere mellem forsøgene 13. Men inddragelsen af ​​en NAG standard hjælpemidler i anvendelsen af ​​analysen mellem laboratorie miljøer. Den NAG positiv kontrol standard inkluderet i hver eksperiment styringer til en inter-eksperimentel variation (f.eks små variationer i reaktionstider eller effektiviteten af farven reagens). Reaktioner kun bruger pufferbetingelser og reaktioner med sporer ikke er i stand til at hydrolysere cortex både gav nogen farveændring.

Det mest almindelige problem med denne metode er inter-eksperimentel variabilitet eller fuldstændig mangel på signal. For at kontrollere for variabiliteten skal sporen præparater være fri for vegetative celle debris. Denne cellerester vil indeholde peptidoglycan fragmenter (NAG og NAM) og vil resultere i en høj baggrund signal for de spirende sporer. For at sikre et rent spore forberedelse (> 99,9% sporer), henvises til Literature for fremgangsmåder til fremstilling af rene sporesuspensioner i organismen, der skal undersøges 7,9,21-23.

Hvis analysen ikke er opnåelse nogen påviseligt signal, observerede vi, at lyofilisering trin kan introducere variabilitet. På grund af den kraft, hvormed vakuumet udløses, observerede vi, at den tørrede prøve pulver kan blæses ud af prøverøret. For at reducere / forhindre dette i at ske, bruge en lille sprøjte nål til at stikke huller i toppen af ​​prøverør. Det lille område af de indførte huller reducerer sandsynligheden af ​​det lyofiliserede prøve (nu i pulverform) i at blive forstyrret. Endelig, som nævnt i de ovennævnte metoder, de adskillige inkubationstrin er meget tidsfølsomme. Sørg for, at alle tidsbestemte skridt overvåges nøje. En vigtig overvejelse for dette assay er, at cortex fragmenter skal frigives fra den spirende sporen for at blive detekteret. Hvis cortex hydrolyseres i store fragmenter, kan disse fragmenter være for store til at være released gennem sporen pels. Selvom en vigtig overvejelse ved fejlfinding et eksperiment, der ikke giver et signal, anbefaler vi at bekræfte, at de betingelser, der anvendes til at spire de fleste af sporerne i løsningen, og de andre muligheder fejlfinding opført her før overvejer cortex fragment størrelse som et potentielt problem i assayet.

Ikke alle spireevne buffere / betingelser er egnede til dette assay. Fordi dette assay detekterer tilstedeværelsen af reducerende sukkerarter frigivet under spiringsprocessen 13, helst spiring buffer, der indeholder reducerende sukkere eller enhver germinant der er, selv, et reducerende sukker (fx glucose) vil resultere i et kraftigt signal i dette assay. Hvis dette er tilfældet, kan højtryksvæskekromatografi (HPLC) anvendes til at påvise tilstedeværelsen af cortex fragmenter 24-26. Men fordi ikke alle laboratorier er udstyret med en sådan instrumentering, den heri beskrevne fremgangsmåde kan anvendes af de flestelaboratorier og tilbyder enkle og let kvantificerbare resultater.

Spiring af bakteriesporer er stort set blevet undersøgt i Bacillus og få Clostridium arter 2,8. Processen er generelt konserveret imidlertid forskelle. Vigtigere er det, ikke alle organismer spire bruge mekanismer sporespiring som observeret i modellen spore-formere 9,27. Fordi spiringen er ved at blive undersøgt i flere forskellige organismer, kan den ovenfor beskrevne assay anvendes på disse organismer til at opdage cortex fragmenter under sporespiring. Ved at anvende denne metode til disse nyligt studerede organismer, kan forskerne bestemme, hvilken rolle forskellige spireevne proteiner spiller i cortex hydrolyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Det beskrevne projekt er støttet af Award nummer 5R01AI116895 fra National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter Statens Institut for Allergi og Smitsomme Sygdomme eller National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 ml screw cap tube USA scientific 1420-3700
p1000 Eppendorf pipet Eppendorf
p200 Eppendorf pipet Eppendorf
p20 Eppendorf pipet Eppendorf
100 - 1,250 μl pipet tips VWR 89079-486
1 - 200 μll pipet tips VWR 89079-458
N-acetyl-D-glucosamine Sigma A3286-25G
Hydrochloric Acid - 10 N BDH-Aristar BDH3032-3.8LP
Acetic Anhydride Alfa Aesar L04295
Sodium Bicarbonate BDH BDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrate Alfa Aesar 39435
Sodium Hydroxide BDH BDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehyde Sigma 156477-100G
Saturated Phenol Fisher BP1750-400
2-Mercaptoethanol Aldrich M6250-100ML
SpectraMax M3 Molecular Devices
Acetic Acid, Glacial BDH BDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water Bath VWR Scientific Model 1136
Microtest 96 Falcon 353072 96 well clear tissue culture plates
Culture tubes VWR 89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
  2. Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
  3. Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
  4. Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
  5. Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
  6. Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
  7. Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
  8. Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22, (7), (2014).
  9. Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197, (14), (2015).
  10. Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).
  11. Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
  12. Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).
  13. Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
  14. Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
  15. Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
  16. Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
  17. Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
  18. Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
  19. Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
  20. Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
  21. Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
  22. Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
  23. Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
  24. Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
  25. Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
  26. Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
  27. Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Francis, M. B., Sorg, J. A. Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination. J. Vis. Exp. (112), e54146, doi:10.3791/54146 (2016).More

Francis, M. B., Sorg, J. A. Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination. J. Vis. Exp. (112), e54146, doi:10.3791/54146 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter