Introduction
Endospores metabolisch sluimerende vormen van bacteriën die het mogelijk maken bacteriën te volharden in ongunstige omgevingen. In veel sporenvormende bacteriën wordt spore vorming geïnduceerd door ontbering nutriënten maar dit proces kan worden geregeld door veranderingen in pH, blootstelling aan zuurstof of andere belastingen 1. Terwijl in hun metabolisch slapende spore vorm, bacteriën verzetten tegen UV-straling, uitdroging, hogere temperaturen en bevriezing 2. Het grootste deel van de kennis over de sporulatie proces komt uit studies in het model organisme, Bacillus subtilis. De sporulatie begint met DNA replicatie en de vorming van een axiaal filament 3,4. Een asymmetrisch septum verdeelt vervolgens de cel in twee ongelijke grootte compartimenten. Hoe groter compartiment, de moeder cel, overspoelt de kleinere compartiment, de forespore. Zowel de moeder cel en forespore coördineren genexpressie aan de spore en de moeder cel uiteindelijk lyseert rijpen, het loslaten van de dormant spore deze in het milieu 1.
De spore structuur en samenstelling is geconserveerd in vele soorten bacteriën. De spore kern heeft een lager watergehalte dan de vegetatieve cel en is rijk aan dipicolinezuur (DPA) 1,2. Tijdens spore vorming, is DPA gepompt in de spore kern in ruil voor water. Rondom de kern is een innerlijke spore membraan, waar in de meeste sporenvormende bacteriën, de receptoren die de kleine moleculen die de kieming (germinants) te stimuleren te herkennen zijn gelegen op 2. Gelegen net buiten binnenste membraan van de spore is een laag van celwand peptidoglycan. Een gespecialiseerde peptidoglycaanlaag (cortex) omgeeft de celwand peptidoglycan en bestaat uit veel van dezelfde componenten als celwand peptidoglycan [alternerende N-acetylglucosamine (NAG) en N-acetylmuraminezuur (NAM)]. Echter, circa 50% van de NAM residuen in de cortex omgezet naar muramic-δ-lactam 5,6 2.
Beheersing van het proces van kieming is van cruciaal belang voor de sporenvormende bacteriën. Kieming wordt gestart wanneer ontkiemende receptoren interageren met hun respectievelijke germinants 2. In veel sporenvormende bacteriën die germinants zijn aminozuren, suikers, nucleotiden, ionen of combinaties daarvan 2. C. difficile sporevorming wordt geïnitieerd door combinaties van bepaalde galzuren [bv taurocholinezuur (TA)] en aminozuren (bijvoorbeeld glycine) 7-10. Hoewel er verschillen tussen de C. difficile kieming route en de paden bestudeerd in andere sporenvormendebacteriën, zoals B. subtilis, voor alle is de absolute vereiste om de spore cortex degraderen om een vegetatieve cel te groeien van de gekiemde spore 2,8. Cortex afbraak kan door de SCLEs CwlJ / SleB (zoals in B. subtilis) of SLEC (zoals in veel Clostridia). Cortex hydrolyse reduceert de beperking op de celwand en spore. Dit maakt volledige kern rehydratatie, een noodzakelijke stap reactiveren veel van de eiwitten die nodig zijn voor cellulaire metabolisme 2.
Wanneer sporen ontkiemen kan de slapende spore verandert van een fase-heldere toestand naar een geleidelijk donkere toestand en dit proces worden gemeten door een verandering van de optische dichtheid (OD) bij 600 11 nm. Een eerdere rapport suggereert dat veel van deze verandering in OD door het vrijkomen van DPA uit de spore 12. Tijdens onze recente studie hebben we getracht de timing van C. vergelijken difficile spore kieming en bewaakt derelease van DPA en cortex fragmenten 9. Voor deze studie was het kritisch om de vrijlating van cortex fragmenten controleren zij begon te worden vrijgegeven door sporen ontkiemen.
De colorimetrische bepaling hier was gebaseerd op een werkwijze voor het detecteren van suikers met reducerende uiteinden ontwikkeld Ghuysen et al. 13. Omdat andere protocollen zijn beschreven voor de detectie van reducerende suikers of 14 hebben die protocollen 15 gewijzigd, kan de literatuur over dit onderwerp verwarrend. Hier hebben we detail een stap-voor-stap werkwijze voor de colorimetrische detectie van reducerende suikers vrijgemaakt ontkiemt C. difficile sporen. Hoewel deze studie maakt gebruik van C. difficile sporen, de reducerende suikers vrijkomt bij de kieming van sporen van andere sporenvormende bacteriën kunnen worden gedetecteerd met dit protocol 9,16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het genereren van Monsters
- Heat activeren C. difficile sporen bij 65 ° C gedurende 30 min en op te slaan op ijs.
Opmerking: C. difficile sporen kunnen worden geproduceerd en gezuiverd zoals eerder beschreven 7,9,10. - Bereid de kieming oplossing X + 1 ml waarbij X het aantal te nemen monsters tijdens de test.
Opmerking: De kieming oplossing is specifiek voor de soort bacteriën Spore bestudeerd. Voor het bepalen van C. difficile sporevorming, gebruikten we een oplossing van 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 100 mM glycine en 10 mM taurocholinezuur in gedeïoniseerd water. - Voor aanvang van de test opneming van een 1,0 ml monster van de kieming oplossing zonder sporen om te dienen als een blanco voor cortex fragment detectie.
- Sporen toevoegen aan een OD 600 van 3,0 ~ de kieming oplossing en vortex snel.
Opmerking: Voor onze kieming studies in B. subtilis, gebruikten we dezelfde OD 600 sporen als voor C. difficile.
Let op: Deze hoeveelheid sporen werkte goed voor het toezicht op cortex fragment vrijkomen tijdens C. difficile spore kieming. De hoeveelheid sporen die in deze test moet proefondervindelijk worden bepaald voor elke bacterie of stam. - Verwijderen van een 1,2 ml monster onmiddellijk na toevoeging van de sporen en centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min bij 14.000 x g. Dit is het tijdstip nul.
- Transfer 1,0 ml van de supernatant van het gecentrifugeerde monster naar een nieuwe buis voor daaropvolgende cortex fragmentanalyse.
Opmerking: Als DPA moeten worden gecontroleerd, verwijdert een aparte 100 gl monster voor de detectie van DPA in de oplossing gebruik van een test gebaseerd op terbium fluorescentie 9,18,19. - Bevries de verzamelde monster bij -80 ° C.
- Herhaal de stappen 1,4 en 1,5 op regelmatige afstanden totdat alle tijdstippen voltooid.
Let op: Als gevolg van de tijd die nodig is voor centrifugeren en bemonstering, tijdstippen minder theen 2 min uit elkaar waren niet mogelijk tijdens onze procedure, zodat onze sampling intervallen waren eenmaal per 2 min gedurende 14 min. - Als een positieve controle op reducerende suikers detectie en kwantificering, de volgende hoeveelheden N-acetylglucosamine (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 en 5000. Bereid deze monsters tegelijk als cortex monsters en langs de cortex monsters zodat de standaardcurve gegenereerd door de kiemende sporen gegevens relevant is.
- Immers tijdstip monsters worden verzameld, lyofiliseren de monsters.
Let op: We gevriesdroogd onze monsters in 2 ml schroefdop buizen.
2. Het meten van Cortex Fragments
- Resuspendeer gevriesdroogde monsters in 120 gl 3 N HCl gesupplementeerd met 1% fenol en 0,5% β-mercaptoethanol.
- Breng de geresuspendeerde monsters tot 2 ml schroefdop buizen.
Opmerking: Voor reproduceerbaarheid, zorgen voor al het gevriesdroogde monster wordt gesuspendeerd en overgebracht. <li> Incubeer de monsters in een recirculerend waterbad bij 95 ° C gedurende 4 uur. - Na incubatie, plaatst de monsters op ijs totdat ze zijn cool.
- Neutraliseer de monsters met 120 ui 3 M NaOH.
- Voeg 80 pl van een verzadigde natriumbicarbonaatoplossing en 80 pi van een 5% oplossing van azijnzuuranhydride aan elk monster en vortex.
- Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Breng de monsters terug naar de 95 ° C waterbad gedurende precies 3 minuten.
Opmerking: Deze stap is tijd gevoelig en langere tijden kunnen downstream signaal ontwikkeling beïnvloeden. - Verwijder monsters uit het waterbad en koelen op ijs.
- Voeg 400 ul van 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O aan elke buis en vortex.
- Incubeer de monsters in een recirculerend waterbad bij 95 ° C gedurende precies 7 min.
Opmerking: Deze stap is tijd gevoelig en langere tijden kunnen downstream signaal ontwikkeling beïnvloeden. - Verwijderende monsters en plaats op ijs gedurende 5 minuten.
3. Kleur reagens
- Terwijl de monsters op ijs (stap 2.12), de voorbereiding van de kleur reagens. Los op 0,320 g p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; Ehrlich's reagens) in 1,9 ml ijsazijn.
Opmerking: Het reagens, temperatuur en lichtgevoelig en moet niet van tevoren. - Na het DMAB volledig oplost, voeg 100 ul van 10 N HCl en vortex.
- Voeg 5 ml ijsazijn en vortex.
4. colorimetrische reactie
- Breng 100 pi van elk monster gekoeld cortex een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Voeg 700 ul van vers bereide kleurenoplossing aan elk monster.
- Geeft de monsters over te brengen naar een 37 ° C waterbad en incubeer gedurende precies 20 min.
- Transfer 200 ul van elk monster een duidelijke 96-well plaat.
- Kwantificeren van de monsters bij 585 nm op een bordlezer. De monsters moeten beginnen bij een gele kleur en een positieve reactie zal verschuiven naar paars. Hoe meer cortex aanwezig, hoe dieper de paarse kleur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabel 1 toont typische resultaten met behulp NAG normen. De gegevens worden gebruikt om een standaardcurve te genereren. Tabel 2 toont typische resultaten van een assay kieming kieming buffer gesupplementeerd met 100 mM glycine en 10 mM TA (-kiemen bevorderen omstandigheden) of 100 mM glycine alleen (niet-kiemende omstandigheden). Aangezien TA, C. difficile sporen niet ontkiemen en er weinig verandering in de aanwezigheid van fragmenten cortex in de oplossing. In de aanwezigheid van zowel TA en glycine, C. difficile sporen ontkiemen en laat cortex fragmenten in de oplossing. Dit wordt waargenomen als een toename van de OD 585 tijd van het gereageerde monsters. De totale hoeveelheid cortex fragmenten (nmol) vrijkomende test werd berekend onder toepassing van een standaardcurve overeenkomstig figuur 1B. In deze assay meeste cortex wordt gehydrolyseerd (of losgelaten) door 15 minuten post-ontkiemende blootstelling suggereert dat de meeste sporen in deze periode ontkiemd (Figuur 2, in overeenstemming met een eerdere publicatie 7).
Na het ontwikkelen de monsters in de kleur reagens kan meeste monsters niet de paarse kleur het blote oog zien. Figuur 1 toont een representatief monster gegenereerd uit N-acetylglucosamine. Veel van de monsters geen zichtbare paarse kleur vertonen. De 250 nmol, 500 nmol en 5000 nmol monsters verschijnen visueel verschillen van de negatieve controle (0 nmol). Gemeten bij OD 585 nm signaal opgewekt beste past een lineaire regressie (R 2 = 0,999).
Figuur 1:. Detectie N-acetylglucosamine (A) N-acetylglucosamine monsters (0 nmol, 12,5 nmol,25 nmol, 50 nmol, 100 nmol, 250 nmol, 500 nmol, 5000 nmol) werden gelyofiliseerd en in reactie gebracht volgens de procedure beschreven. (B) Monsters werden toegevoegd aan een 96-putjesplaat en de hoeveelheid gereageerde stof gedetecteerd bij 585 nm. Het signaal werd gebruikt om een standaardcurve te genereren. 
Figuur 2:. Grafische weergave van kiem De berekende nmol cortex in Tabel 2 werd uitgezet tegen de tijd. (●) 100 mM glycine + 10 mM TA; (■) 100 mM glycine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| NAG Concentratie (nmol) | OD 585 |
| 0 | 0,047 |
| 12.5 | 0,054 |
| 25 | 0,066 |
| 50 | 0,084 |
| 100 | 0,128 |
| 250 | 0,285 |
| 500 | 0,556 |
| 5000 | 4.0 |
| blank = | 0,046 |
Tabel 1: NAG Standard.
| Clostridium difficile Spore Kiemkracht | ||||
| Kieming oplossing (10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl) | ||||
| 100 mM glycine + 10 mM TA | 100 mM Glycine | |||
| (Minuten) | OD 585 | Berekend (nmol) | OD 585 | Berekend (nmol) |
| 0 | 0,046 | 0.00 | 0,047 | 0.00 |
| 2 | 0,048 | 2.54 | 0,048 | 1.27 |
| 4 | 0.05 | 5.07 | 0,049 | 2.54 |
| 6 | 0,055 | 11.41 | 0.05 | 3.80 |
| 8 | 0,059 | 16.49 | 0.05 | 3.80 |
| 10 | 0.06 | 17.76 | 0,051 | 5.07 |
| 12 | 0,061 | 19.02 | 0.05 | 3.80 |
| 14 | 0,063 | 21.56 | 0,051 | 5.07 |
Tabel 2: Sample Spore Germinatiop de resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij stimulatie, sporen het kiemproces ondergaan verliezen hun resistentie eigenschappen zonder de noodzaak voor macromoleculaire synthese. Wanneer spore kieming wordt geactiveerd, de spore kern releases DPA in ruil voor water 2. Door de hoge DPA gehalte van de slapende spore, de spore kern onder hoge osmotische druk en de gespecialiseerde peptidoglycaan, cortex, helpt voorkomen dat de kern van zwelling door zich vermoedelijk als een belemmering voor uitbreiding 2.
De hierboven beschreven werkwijze gebruikt Ehrlich's reagens (een gele oplossing) om de aanwezigheid van reducerende suikers als meetbare verschuiving naar een paarse tint detecteren. Tijdens cortex hydrolyse worden NAG NAM en suikers bevrijd (afhankelijk van de mate van hydrolyserende enzymen, kunnen de suikers worden bevrijd als disacchariden of polysacchariden). Hydrolyse van de glycosidische bindingen van HCl (stap 2,1) genereert monosacchariden met vrije reducerende uiteinden 7. na neutralizing het zuur met een gelijke hoeveelheid natriumhydroxide (stap 2,5), worden de alcoholen rond de NAG NAM en monosacchariden geacyleerd met azijnzuuranhydride (stap 2,6) 13. Vervolgens wordt ongereageerd azijnzuuranhydride omgezet azijnzuur door verwarming van het monster (stap 2,8). Als hypothese door Morgan en Elson 20, de terminal aldehyde omgezet spontaan de enol vorm. Onder alkalische omstandigheden (stap 2.10), kan deze enolvorm reageren met de aangrenzende acetyl een oxazoolderivaat dat reageert met Ehrlich's reagens (stap 4,3) een paarse kleur 15,20 genereren.
Deze werkwijze hierboven beschreven levert consistente, betrouwbare resultaten voor de detectie van fragmenten cortex van ontkiemende sporen, zowel B. subtilis en C. difficile 9,16,17. De assay vereist speciale aandacht voor de reactietijden, temperaturen en procedures worden uitgevoerd met nauwkeurigheid te waarborgen. Zonder de juiste aandachtvoor detail, is het gemakkelijk voor de reactieomstandigheden wordt verhinderd of reproduceren tussen 13 experimenten. De opname van een standaard NAG helpt bij de uitvoering van de test tussen laboratoriumomstandigheden. De NAG positieve controle standaard opgenomen in elk experiment controles voor een inter-experimentele variabiliteit (bijvoorbeeld kleine variaties in reactietijden of effectiviteit van de kleur reagens). Reacties met alleen bufferomstandigheden en reacties met sporen staat hydrolyseren cortex beide gaf geen kleurverandering.
Het meest voorkomende probleem met deze methode is inter-experimentele variabiliteit of volledig gebrek aan signaal. Om te controleren voor de variabiliteit, moet de spore voorbereidingen vrij van vegetatieve cel puin. Het celafval wordt peptidoglycaan fragmenten (NAG NAM en) bevatten en zal resulteren in een hoog achtergrondsignaal voor het ontkiemen sporen. Om een zuivere spore voorbereiding (> 99,9% sporen) te waarborgen, wordt verwezen naar de literature methoden om pure sporen suspensies in het organisme te onderzoeken 7,9,21-23.
Als de test niet is waardoor geen detecteerbaar signaal, we hebben geconstateerd dat het vriesdrogen stap variabiliteit kunnen introduceren. Door de kracht waarmee het vacuüm losgelaten namen wij waar dat het gedroogde monster poeder uit de monsterbuis kan worden geblazen. Te verminderen / voorkomen dat dit zich voordoet, gebruik dan een kleine injectienaald om gaten in de toppen van monsterbuizen porren. Het kleine gebied van het ingebrachte gaten zal de waarschijnlijkheid van het gevriesdroogde monster (nu in poedervorm) te verminderen wordt verstoord. Tenslotte, zoals in de bovenstaande methoden, de verschillende incubatiestappen erg tijdgevoelig. Zorg ervoor dat alle getimede stappen zorgvuldig worden gemonitord. Een belangrijke overweging voor deze test is dat de cortex fragmenten om te worden vrijgelaten uit de kiemende spore te detecteren. Als de cortex wordt gehydrolyseerd in grote fragmenten, kunnen deze fragmenten te groot te zijn released door de spore jas. Hoewel een belangrijke overweging bij het oplossen van een experiment dat geen signaal oplevert, raden wij bevestigen dat de toegepaste de meeste sporen in de oplossing en de andere opties probleemoplossing genoemde ontkiemen vóór gezien cortex fragmentgrootte als een potentieel probleem in de assay.
Niet alle kieming buffers / omstandigheden geschikt voor deze test. Omdat deze test de aanwezigheid van reducerende suikers vrijgemaakt tijdens het kiemproces 13, elke kieming buffer die reducerende suikers of ontkiemende die zelf een reducerende suiker bevat detecteert (bijvoorbeeld glucose) leiden tot een sterk signaal in deze test. Als dit het geval is, kan hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) worden gebruikt om de aanwezigheid van cortex fragmenten 24-26 detecteren. Omdat niet alle laboratoria zijn uitgerust met dergelijke instrumenten de hierin beschreven werkwijze kan worden gebruikt door de meestelaboratoria en biedt eenvoudige en gemakkelijk meetbare resultaten.
Kieming door bacteriële sporen grotendeels is onderzocht in Bacillus en een paar Clostridium species 2,8. Het wordt in het algemeen geconserveerd echter verschillen. Belangrijk is dat niet alle organismen ontkiemen met behulp van mechanismen van spore kieming zoals waargenomen in het model spore-vormers 9,27. Omdat kieming steeds onderzocht meer diverse organismen, kunnen de bovenbeschreven assay worden toegepast op deze organismen cortex fragmenten ontdekt gedurende sporevorming. Door het toepassen van deze methode om deze nieuw onderzochte organismen kunnen onderzoekers de rol van verschillende kieming eiwitten spelen in cortex hydrolyse te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Het project beschreven wordt ondersteund door Award Nummer 5R01AI116895 van het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten en de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p200 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p20 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| 100 - 1,250 μl pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1 - 200 μll pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid - 10 N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine |
References
- Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
- Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
- Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
- Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
- Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
- Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22 (7), (2014).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197 (14), (2015).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).
- Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
- Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).
- Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
- Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
- Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
- Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
- Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
- Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
- Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
- Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
- Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
- Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
- Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
- Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
- Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
- Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
- Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).
