Introduction
内生胞子は、細菌が不利な環境で存続することを可能にする細菌の代謝的に休止状態の形態です。多くの胞子形成細菌は、胞子形成は、栄養欠乏によって誘導されるが、このプロセスは、pH、酸素への曝露または他のストレス1に変更することによって制御することができます。それらの代謝休眠胞子の形で、一方、細菌は、UV照射、乾燥、高温、および2の凍結に耐えます。胞子形成過程に関する知識のほとんどは、モデル生物での研究、 枯草菌（Bacillus subtilis）から来ています。胞子形成のプロセスは、DNA複製および軸方向フィラメント3,4の形成から始まります。非対称隔壁は、2つの不均等サイズの区画にセルを分割します。大きなコンパートメントは、母細胞は、小さな区画、前胞子を飲み込みます。母細胞とドーマンを解放し、胞子、最終的に溶解する母細胞を成熟するために遺伝子発現を調整する前胞子の両方周囲の環境1へのT胞子。
胞子の構造と組成は、多くの細菌種間で保存されています。胞子コアは栄養細胞よりも低い含水量を有しており、ジピコリン酸（DPA）1,2と豊富です。胞子形成中、DPAは、水と引き換えに胞子コアに圧送されます。コアを囲むことは、ほとんどの芽胞形成菌で、発芽を刺激する小分子を認識する受容体（germinants）が2に位置している、内側の胞子膜です。ちょうど胞子の内膜の外側に位置する細胞壁ペプチドグリカンの層です。特殊なペプチドグリカン層（皮質）は、細胞壁のペプチドグリカンを囲み、[N-アセチルグルコサミン（NAG）およびN-アセチルムラミン酸（NAM）交互】細胞壁ペプチドグリカンと同じ構成要素の多くで構成されています。しかし、皮質におけるNAM残基の約50％は、ムラミン-δラクタム5,6に変換されています2のいくつかの層です。
発芽のプロセスを制御することは芽胞形成菌のために非常に重要です。発芽受容体は、それぞれのgerminants 2を操作する際に発芽が開始されます。多くの胞子形成細菌では、これらのgerminants 2そのアミノ酸、糖、ヌクレオチド、イオンまたはこれらの組み合わせである。C.ディフィシレ胞子の発芽は、特定の胆汁酸[ 例えば 、タウロコール酸（TA）]およびアミノ酸（ 例えば 、グリシン）7-10の組み合わせによって開始されます。 Cの相違はありますがディフィシル発芽経路および他の胞子形成に研究経路このようなB.などの細菌、 枯草菌は、すべてに共通の栄養細胞が発芽胞子2,8から成長できるようにするために胞子皮質を分解するための絶対条件です。 （多くのクロストリジウムに見られるような）皮質の劣化がSCLEs CwlJ / SleB（ 枯草菌に見られるような）またはSLECによって達成することができます。皮質の加水分解は、細胞壁と胞子上の制約を軽減します。これは完全なコアの再水和、細胞代謝2のために必要なタンパク質の多くを再活性化に必要なステップを可能にします。
胞子が発芽したときに、位相暗状態と、このプロセスのフェーズ明状態から休眠胞子の変更は600での光学密度（OD）の変化によって測定することができます。 11 nmの。前回のレポートでは、ODの変化の多くは胞子12からのDPAのリリースによるものであることを示唆しています。我々の最近の研究の間、我々はCのタイミングを比較しようとしましたディフィシレ胞子の発芽・監視DPAおよび皮質の断片9のリリース。彼らは胞子を発芽によって解放されるようになったように、この研究のためには、皮質の断片の放出を監視するために重要でした。
ここで使用される比色アッセイはGhuysen らが開発した還元末端を有する糖を検出するための方法に基づいていた。13。他の人が還元糖14の検出のためのプロトコルを記述しているか、それらのプロトコル15を変更したので、このテーマに関する文献は混乱することができます。ここでは、詳細C.発芽から遊離した還元糖の比色検出のためのステップバイステップ方法ディフィシレ胞子。この研究では、Cを使用しますがディフィシレ胞子は、他の芽胞形成菌からの胞子の発芽中に放出された還元糖は、このプロトコル9,16,17で検出することができます。
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Protocol
1.生成のサンプル
- 熱はCを活性化させます氷上で30分間、店舗65℃でディフィシレ胞子。
注：C.以前7,9,10説明したようにディフィシレ胞子は生産、精製することができます。 - Xは、サンプル数がアッセイ中に撮影されるX + 1 mlの発芽溶液を調製します。
注：発芽液が細菌の種に固有のもので検討されて胞子。 C.をアッセイするためのディフィシレ胞子発芽、我々は、10mMトリス（pH7.5）を、150mMのNaCl、脱イオン水中の100 mMグリシンおよび10mMタウロコール酸の溶液を用います。 - アッセイを開始する前に、皮質の断片を検出するためのブランクとして機能するように胞子をせずに発芽溶液1.0mlサンプルを描きます。
- すぐに発芽液と渦に〜3.0のOD 600に胞子を追加します。
注：Bの私たちの発芽試験のために枯草菌 、我々は同じODを使用6C.用として00胞子ディフィシル 。
注：胞子のこの量は、Cの間に皮質断片の放出をモニターするためによく働きましたディフィシレ胞子の発芽。このアッセイで使用される胞子の量は、それぞれ細菌または株について実験的に決定されるべきです。 - 14,000×gで1分間室温で胞子および遠心分離機を追加した直後に1.2ミリリットルのサンプルを削除してください。これは、ゼロ時点です。
- その後の皮質断片分析のために新しいチューブに遠心分離し、試料からの上清の1.0ミリリットルを転送します。
注：DPAを 監視する必要がある場合、テルビウム蛍光9,18,19に基づくアッセイを用いて、溶液中にDPAの検出のための別々の100μlのサンプルを削除します。 - -80℃で採取した試料を凍結します。
- 全ての時点が完了するまで繰り返して、定期的に1.4と1.5を繰り返します。
ために遠心分離し、サンプリングに必要な時間を、時間点は以下番目注2分は離れて私たちの手順の間には不可能だったので、私たちのサンプリング間隔は、一回14分ごとに2分でした。 - 0、12.5、25、50、100、250、500、および5000：砂糖の検出および定量化を減少させるためのポジティブコントロールとして、N個の -acetylglucosamine（ナノモル）以下の量が含まれています。皮質サンプルと同時にこれらのサンプルを調製し、標準曲線は、胞子を発芽によって生成されたデータに関連しているように、皮質サンプルと一緒に実行します。
- すべての時点のサンプルを収集した後、サンプルを凍結乾燥。
注：私たちは、2ミリリットルのスクリューキャップチューブ中で私たちのサンプルを凍結乾燥しました。
2.皮質断片を測定
- 1％のフェノール及び0.5％のβメルカプトエタノールを補充した3 N HClを120μlの凍結乾燥試料を再懸濁します。
- 2 mlのスクリューキャップチューブに再懸濁したサンプルを転送します。
注：再現性のために、すべての凍結乾燥した試料は再懸濁し、転送されていることを確認。 <LI> 4時間95℃で再循環水浴中でサンプルをインキュベートします。 - 彼らはクールになるまでインキュベートした後、氷上にサンプルを置きます。
- 3 M NaOHを120μlのサンプルを中和します。
- 飽和重炭酸ナトリウム溶液の80μlを、各サンプルと渦に5％無水酢酸溶液の80μLを加えます。
- 10分間、室温でサンプルをインキュベートします。
- 丁度3分のために戻って95℃の水浴にサンプルを転送します。
注：このステップは敏感で、より長い時間が下り信号の発達に影響を与えることができる時間です。 - 水浴からサンプルを取り出して、氷上で冷却します。
- 各チューブとボルテックスに6.54パーセントのK 2 B 4 O 7・4H 2 Oの400μlのを追加します。
- 丁度7分間95℃の循環水浴中でサンプルをインキュベートします。
注：このステップは敏感で、より長い時間が下り信号の発達に影響を与えることができる時間です。 - 削除します氷上で5分間のサンプルと場所。
3.色試薬
- サンプルは氷（ステップ2.12）であるが、発色試薬を準備します。氷酢酸1.9ミリリットルであり、pの -dimethylaminobenzaldehyde（エールリッヒ試薬DMAB）の0.320グラムを溶解させます。
注意：試薬は、時間、温度と光に敏感であり、事前に行われるべきではありません。 - DMABが完全に溶解した後、10 N HCl及び渦の100μlを添加します。
- 氷酢酸と渦の5ミリリットルを追加します。
4.比色反応
- 各100μlのを転送新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに皮質のサンプルを冷却しました。
- 各サンプルに新たに調製した色溶液700μLを加えます。
- 直ちに37℃の水浴にサンプルを転送し、正確に20分間インキュベートします。
- 透明な96ウェルプレートに200μlの各サンプルを転送します。
- プレート上の585 nmでのサンプルを定量リーダー。サンプルは黄色で開始すべきであると陽性反応が紫にシフトします。より多くの皮質の存在、深い紫色。
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Representative Results
表1は、NAG標準を使用した典型的な結果を示しています。データは、標準曲線を生成するために使用される。 表2は、100 mMグリシン及び10 mMのTA（発芽促進条件）、または100mMのグリシンのみ（未発芽状態）を補充した発芽バッファにおける発芽アッセイの代表的な結果を示しています。 TA、Cの非存在下ではディフィシレ胞子は発芽せず、溶液中の皮質の断片の存在はほとんど変化しません。しかし、C.、TAお よびグリシンの両方の存在下で、 ディフィシレ胞子は発芽し溶液中に皮質の断片を放出します。これは、反応した試料の経時的なOD 585の増加として観察されます。このアッセイの間に放出さ皮質断片（ナノモル）の合計量は、 図1Bと同様の標準曲線を用いて計算しました。このアッセイでは、皮質の大部分が加水分解される（または解放）15分後により発芽暴露、胞子の大部分はこの時間枠（ 図2;以前の出版物7と一貫）で発芽していることを示唆しています。
発色試薬でサンプルを開発した後、ほとんどのサンプルは、肉眼に紫色が表示されない場合があります。 図1は、N-アセチルグルコサミンから生成された代表的なサンプルを示しています。サンプルの多くは、目に見える紫色を示していません。しかし、250ナノモル、500ナノモル及び5000 nmolのサンプルは、陰性対照（0ナノモル）と視覚的に異なる表示されます。 OD 585 nmで測定した場合、信号が最高の線形回帰（R 2 = 0.999）をフィット生成しました。
図1： 検出N-アセチルグルコサミン （A）N-アセチルグルコサミンサンプル（0ナノモル、12.5ナノモル、。25ナノモル、50ナノモルを、100ナノモル、250ナノモル、500ナノモル、5,000ナノモル）が記載された手順に従って凍結乾燥して反応させました。 （B）サンプルを、96ウェルプレート、および585 nmで検出した反応物質の量に添加しました。信号は、標準曲線を作成するために使用されました。 
図2： 発芽結果のグラフィカルな表現は、 表2の計算されたナノモル皮質は、時間に対してプロットしました。 （●）100 mMグリシン+ 10mMのTA。 （■）100 mMグリシン。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| NAG濃度（ナノモル） | OD 585 |
| 0 | 0.047 |
| 12.5 | 0.054 |
| 25 | 0.066 |
| 50 | 0.084 |
| 100 | 0.128 |
| 250 | 0.285 |
| 500 | 0.556 |
| 5,000 | 4.0 |
| ブランク= | 0.046 |
表1：NAG標準。
| クロストリジウム・ディフィシレ胞子の発芽 | ||||
| 発芽液（10mMトリス（pH7.5）を、150mMのNaCl） | ||||
| 100mMのグリシン+ 10mMのTA | 100mMのグリシン | |||
| 時間（分） | OD 585 | 計算された（ナノモル） | OD 585 | 計算された（ナノモル） |
| 0 | 0.046 | 0.00 | 0.047 | 0.00 |
| 2 | 0.048 | 2.54 | 0.048 | 1.27 |
| 4 | 0.05 | 5.07 | 0.049 | 2.54 |
| 6 | 0.055 | 11.41 | 0.05 | 3.80 |
| 8 | 0.059 | 16.49 | 0.05 | 3.80 |
| 10 | 0.06 | 17.76 | 0.051 | 5.07 |
| 12 | 0.061 | 19.02 | 0.05 | 3.80 |
| 14 | 0.063 | 21.56 | 0.051 | 5.07 |
表2：スポアGerminatiサンプル結果に。
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Discussion
刺激を受けると、発芽の過程を経て胞子は巨大分子の合成を必要とせずに、それらの抵抗特性を失います。胞子の発芽がトリガされると、胞子コアは水2と引き換えにDPAを 解放します。休眠胞子の高いDPA内容に、胞子コアは、拡張2に対するバリアとして、おそらく、作用することにより、膨潤コアを防ぐことができます強烈な浸透圧や専門ペプチドグリカン、皮質下にあります。
上述の方法は、紫の色合いの測定シフトと還元糖の存在を検出するためにエールリッヒ試薬（黄色溶液）を使用します。皮質の加水分解の間、NAGとNAM糖が遊離する（加水分解酵素の程度に応じて、糖は、二糖類または多糖類として遊離させることができます）。塩酸（ステップ2.1）によるグリコシド結合の加水分解は、自由還元末端7で単糖を生成します。 neutraliz後水酸化ナトリウム（ステップ2.5）の等量酸る、NAGとNAM単糖類を囲むアルコールは無水酢酸（ステップ2.6）13によりアシル化されます。その後、未反応の無水酢酸を試料（ステップ2.8）を加熱して酢酸に変換されます。モーガンとエルソン20によって仮説を立てたように、末端アルデヒドは、自発的にエノール型に変換します。アルカリ性条件（ステップ2.10）の下で、このエノール形態は紫色15,20を生成するために、エールリッヒ試薬（ステップ4.3）と反応し、オキサゾール誘導体を生成するために、隣接アセチルと反応することができます。
上記のこの方法は、胞子を発芽から皮質の断片を検出するための一貫性のある、信頼性の高い結果が得られ、両方のB.枯草菌およびC.ディフィシル 9,16,17。アッセイは、反応時間、温度および手順を精密に行われることを保証するために特別な注意が必要です。適切な配慮なし反応条件は、実験13との間で再現失敗するかしないために詳細に、それは簡単です。しかし、実験室環境間アッセイのアプリケーションでNAG標準補助を含めます。 NAG陽性対照標準は、任意の実験間のばらつき（ 例えば 、反応時間で、わずかな変動や色試薬の有効性）のため、すべての実験のコントロールに含まれています。緩衝液のみの条件と皮質の両方を加水分解することができないの胞子との反応を用いて、反応は、色に変化は生じませんでした。
この方法の最も一般的な問題は、実験間のばらつきや信号の完全な欠如です。変動を制御するために、胞子調製物は、任意の栄養細胞破片の自由でなければなりません。この細胞破片はペプチドグリカンフラグメント（NAGとNAM）を含有し、発芽胞子のための高いバックグラウンドシグナルになります。純粋な胞子製剤（> 99.9％の胞子）を確保するために、literatuを参照してください。再7,9,21-23を研究する生物に純粋な胞子懸濁液を調製するための方法のために。
アッセイは、検出可能なシグナルが得られていない場合は、凍結乾燥工程は、変動性を導入することができることを観察しました。真空が解放される力のために、我々は、乾燥した試料粉体を試料管から噴出することができることを観察しました。減らすために/試料管の上部の穴を突くために小さな注射針を使用し、これを防ぎます。導入孔の小領域が乱されるから（現在粉末形態の）凍結乾燥されたサンプルの可能性を減少させます。上記の方法で述べたように最後に、いくつかのインキュベーションステップは非常に時間に敏感です。すべての時限の手順を注意深く監視していることを確認してください。このアッセイの重要な考慮事項は、皮質断片を検出するために発芽胞子から放出されなければならないということです。皮質は、大きな断片に加水分解されている場合は、これらの断片はRELEであるには余りにも大きくなることがあり胞子殻を通してASED。信号が得られない実験のトラブルシューティングを行うときに考慮すべき重要なことが、私たちは前に潜在的な問題のように皮質のフラグメントサイズを考慮に条件がここに記載されている溶液中の胞子およびその他のトラブルシューティングオプションのほとんどを発芽するために使用されることを確認することをお勧めしますアッセイ。
全て発芽バッファは/条件は、このアッセイに適しています。このアッセイは発芽過程13の間に遊離還元糖の存在、糖または、それ自体が任意の発芽を減らす含む任意の発芽・バッファを検出するので、還元糖（ 例えば 、グルコース）は、このアッセイで強いシグナルをもたらすであろう。この場合、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）は、皮質断片24-26の存在を検出することができます。すべての研究所は、このような計測機器が装備されていないので、しかし、本明細書に記載される方法は、ほとんどの地域で使用されることができます研究所や、シンプルで簡単に定量化可能な結果を提供しています。
細菌胞子によって発芽は、主としてバチルスといくつかのクロストリジウム属の種2,8に研究されてきました。差異が存在するが、プロセスは、一般的に、保存されています。モデルの胞子形成剤9,27に観察されるように重要なことは、すべての生物は、胞子の発芽のメカニズムを使用して発芽しません。発芽は、より多様な生物において研究になっているので、上述のアッセイは、胞子発芽の間皮質断片を検出するために、これらの生物に適用することができます。これらの新たに研究の生物にこの方法を適用することにより、研究者はさまざまな発芽タンパク質が皮質の加水分解において果たす役割を決定することができます。
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Acknowledgments
説明プロジェクトは、アレルギーと国立感染症研究所から賞数5R01AI116895でサポートされています。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立アレルギー感染症研究所や国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p200 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p20 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| 100 - 1,250 μl pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1 - 200 μll pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid - 10 N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine |
References
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