Introduction
Endospores são metabolicamente formas latentes de bactérias que permitem que as bactérias para persistir em ambientes desfavoráveis. Em muitas bactérias formadoras de esporos, a formação de esporos é induzida pela privação de nutrientes, mas este processo pode ser controlada por alterações de pH, exposição ao oxigénio ou outros stresses 1. Embora em sua forma de esporos metabolicamente dormente, as bactérias resistir à radiação UV, a dessecação, temperaturas mais elevadas e que congela 2. A maior parte do conhecimento sobre o processo de esporulação vem de estudos no organismo modelo, Bacillus subtilis. O processo de esporulação começa com a replicação do ADN e a formação de um filamento de 3,4 axial. Um septo assimétrica, em seguida, divide a célula em dois compartimentos de tamanho desigual. O compartimento maior, a célula mãe, engolfa o compartimento mais pequeno, o forespore. Tanto a célula mãe e forespore coordenar a expressão do gene para amadurecer o esporo e a célula mãe, eventualmente, lisa, liberando o Dormant de esporos para o ambiente circundante um.
A estrutura e a composição de esporos é conservada entre várias espécies bacterianas. O núcleo de esporos tem um teor de água inferior a célula vegetativa e é rica em ácido dipicolínico (DPA) 1,2. Durante a formação de esporos, DPA é bombeado para dentro do núcleo de esporos em troca de água. Em torno do núcleo é uma membrana de esporos interior, onde, na maioria das bactérias formadoras de esporos, os receptores que reconhecem as pequenas moléculas que estimulam a germinação (germinants) estão localizados a 2. Localizado no exterior membrana interna do esporo é uma camada de peptidoglicano da parede celular. Uma camada de peptidoglicano especializado (córtex) rodeia o peptidoglicano da parede celular e é composta de muitos dos mesmos componentes como peptidoglicano da parede celular [alternando N-acetilglucosamina (NAG) e ácido N-acetilmurâmico (NAM)]. No entanto, aproximadamente 50% dos resíduos de NAM no córtex foram convertidos para murâmico-δ-lactama 5,6 2.
Controlando o processo de germinação é criticamente importante para as bactérias formadoras de esporos. A germinação é iniciada quando os receptores germinativa interagir com seus respectivos germinants 2. Em muitas bactérias formadoras de esporos, estes são germinants amino ácidos, açúcares, nucleótidos, iões, ou combinações destes dois. C. difficile germinação de esporos é iniciada por meio de combinações de certos ácidos biliares, [por exemplo, ácido taurocólico (TA)] e aminoácidos (por exemplo, glicina) 7-10. Embora existam diferenças entre o C. via de germinação difficile e as vias estudadas em outra forma de esporobactérias, tais como B. subtilis, comum a todos é a exigência absoluta para degradar o córtex esporos para permitir que uma célula vegetativa a crescer a partir do esporos germinados 2,8. Córtex degradação pode ser conseguida pela SCLEs CwlJ / SleB (como encontrado em B. subtilis) ou SLEC (como encontrado em muitos Clostridia). hidrólise córtex reduz a restrição na parede da célula e esporo. Isto permite uma re-hidratação completa do núcleo, um passo necessário para a reactivação muitas das proteínas necessárias para o metabolismo celular 2.
Quando esporos germinam, as mudanças de esporos a partir de um estado dormente de fase brilhante para um estado de fase-escuro e este processo pode ser medido por uma alteração na densidade óptica (DO) a 600 nm 11. Um relatório anterior sugere que grande parte dessa mudança de OD é devido à liberação da DPA do esporo 12. Durante a nossa recente estudo, buscou-se comparar o tempo de C. difficile germinação de esporos e acompanhou olançamento do DPA e córtex fragmentos 9. Para este estudo foi fundamental para monitorar o lançamento de fragmentos de córtex, quando começaram a ser lançado pela germinação de esporos.
O ensaio colorimétrico aqui utilizado baseou-se num método para a detecção de açúcares com extremidades redutoras desenvolvido Ghuysen et ai. 13. Porque os outros têm descrito protocolos para a detecção de açúcares redutores 14 ou modificou os protocolos 15, a literatura sobre este assunto pode ser confuso. Aqui, nós detalhe um método passo-a-passo para a detecção colorimétrica de açúcares redutores libertados de germinação C. esporos difficile. Embora este estudo utiliza C. esporos difficile, os açúcares redutores libertados durante a germinação de esporos a partir de outras bactérias formadoras de esporos são capazes de serem detectadas com este protocolo 9,16,17.
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Protocol
1. As amostras de Geração
- Calor ativar C. difficile esporos a 65 ° C durante 30 min e armazenar em gelo.
Nota: C. esporos difficile pode ser produzida e purificada tal como descrito anteriormente 7,9,10. - Preparar a solução de germinação a X + 1 ml onde X é o número de amostras a serem tomadas durante o ensaio.
Nota: A solução de germinação é específico para as espécies de bactérias esporos sendo estudado. Para ensaiar C. difficile a germinação de esporos, foi utilizada uma solução de Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, glicina 100 mM e 10 mM de ácido taurocólico em água desionizada. - Antes de iniciar o ensaio, retirar uma amostra da solução de 1,0 ml sem germinação de esporos para servir como uma estrutura para a detecção fragmento córtex.
- Adicionar esporos a um OD 600 de ~ 3.0 para a solução de germinação e vortex rapidamente.
Nota: Para os nossos estudos de germinação em B. subtilis, foi utilizada a mesma OD 600 esporos como por C. difficile.
Nota: Esta quantidade de esporos funcionou bem para monitoramento córtex liberação fragmento durante C. germinação de esporos difficile. A quantidade de esporos utilizada neste ensaio devem ser determinadas experimentalmente para cada bactéria ou estirpe. - Remover uma amostra de 1,2 ml, imediatamente após adição dos esporos e centrifugação à temperatura ambiente durante 1 min a 14.000 x g. Este é o ponto de tempo zero.
- Transferir 1,0 ml do sobrenadante a partir da amostra centrifugada para um tubo fresco para a análise de fragmentos de córtex posterior.
Nota: Se DPA necessitam de ser monitorizados, remover uma amostra de 100 ul em separado para a detecção de DPA na solução utilizando um ensaio baseado em fluorescência térbio 9,18,19. - Congelar a amostra recolhida a -80 ° C.
- Repita os passos 1.4 e 1.5, em intervalos regulares, até que todos os pontos de tempo completo.
Nota: Devido ao tempo necessário para a centrifugação e amostragem, momentos menos thum 2 min apart não fosse possível durante o nosso procedimento, para que os nossos intervalos de amostragem eram uma vez a cada 2 min para 14 min. - Como um controlo positivo para reduzir a detecção e quantificação de açúcar, incluem as seguintes quantidades de N-acetilglicosamina (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500, e 5000. Preparar estas amostras ao mesmo tempo como amostras de córtex e execute, juntamente com as amostras de córtex de modo que a curva padrão é relevante para os dados gerados pela germinação de esporos.
- Depois de todas as amostras ponto de tempo são recolhidas, liofilizar as amostras.
Nota: Nós liofilizado nossas amostras em tubos de 2 ml com tampa de rosca.
2. Medir Cortex Fragments
- Ressuspender as amostras liofilizadas em 120 mL de HCl 3 N suplementado com 1% de fenol e 0,5% β-mercaptoetanol.
- Transferir as amostras em suspensão para 2 ml tubos com tampa de rosca.
Nota: Para reprodutibilidade, assegurar toda a amostra liofilizada �ressuspenso e transferidos. <li> Incubar as amostras num banho de água em recirculação, a 95 ° C durante 4 h. - Após a incubação, colocar as amostras em gelo até que eles são legais.
- Neutraliza-se a amostras com 120 uL de NaOH 3 M.
- Adicionar 80 ul de uma solução saturada de bicarbonato de sódio e 80 mL de uma solução de anidrido acético a 5% a cada amostra e vortex.
- Incubam-se as amostras à temperatura ambiente durante 10 min.
- Transferir as amostras de volta para o banho de água C 95 ° para exatamente 3 min.
Nota: Esta etapa é hora vezes sensíveis e mais longas podem afetar o desenvolvimento do sinal a jusante. - Retirar amostras a partir do banho de água e arrefece-se em gelo.
- Adicionar 400 uL de 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O para cada tubo e vortex.
- Incubam-se as amostras num banho de água em recirculação, a 95 ° C durante exactamente 7 min.
Nota: Esta etapa é hora vezes sensíveis e mais longas podem afetar o desenvolvimento do sinal a jusante. - Removeras amostras e colocar em gelo durante 5 min.
3. Cor Reagente
- Enquanto as amostras estão no gelo (Passo 2,12), preparar o reagente de cor. Dissolve-se 0,320 g de p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; reagente de Ehrlich) em 1,9 ml de ácido acético glacial.
Nota: O reagente é o tempo, temperatura e sensível à luz e não devem ser feitas com antecedência. - Após o DMAB se dissolva completamente, adicionar 100 mL de HCl 10 N e vortex.
- Adicionar 5 ml de ácido acético glacial e agitar com vortex.
4. reacção colorimétrica
- Transferir 100 uL de cada amostra arrefecida córtex para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Adicionar 700 ul da solução de cor recém-preparadas para cada amostra.
- transferir imediatamente as amostras para um banho de água C 37 ° e incubar por exatamente 20 min.
- Transferir 200 ul de cada amostra para uma placa de 96 poços clara.
- Quantificar as amostras a 585 nm em um pratoleitor. As amostras devem começar em uma cor amarela e uma reacção positiva se deslocará para roxo. Quanto mais córtex presente, quanto mais profunda a cor roxa.
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Representative Results
A Tabela 1 mostra os resultados típicos usando padrões de NAG. Os dados são utilizados para gerar uma curva padrão. A Tabela 2 mostra os resultados típicos de um ensaio de germinação de germinação em tampão suplementado com 100 mM de glicina e TA 10 mM (condições de promoção da germinação) ou de glicina 100 mM apenas (condições não-germinação). Na ausência de TA, C. difficile esporos germinam e não há pouca alteração na presença de fragmentos do córtex na solução. No entanto, na presença de ambos TA e glicina, C. difficile esporos germinam e libertar os fragmentos do córtex para dentro da solução. Isto é observado como um aumento na OD a 585 ao longo do tempo das amostras que reagiram. A quantidade total de fragmentos de córtex (nmol) liberados durante este ensaio foi calculada utilizando uma curva padrão semelhante ao da Figura 1B. Neste ensaio, a maior parte do córtex é hidrolisado (ou solta) por 15 minutos pós-exposição germinativo, sugerindo que a maior parte dos esporos germinaram neste período de tempo (Figura 2; de acordo com uma publicação anterior 7).
Depois de desenvolver as amostras no reagente de cor, a maioria das amostras podem não mostrar a cor púrpura a olho nu. A Figura 1 mostra uma amostra representativa produzida a partir de N-acetilglucosamina. Muitas das amostras não mostram uma cor púrpura visível. No entanto, os 250 nmol, 500 nmol e 5.000 nmol amostras aparecer visualmente diferente do controlo negativo (0 nmol). Quando medida a OD 585 nm, o sinal gerado melhor se adapta uma regressão linear (R2 = 0,999).
Figura 1:. Detecção N-acetilglucosamina amostras (A) N-acetilglucosamina (0 nmol, 12,5 nmol,25 nmol, 50 nmol, 100 nmol, 250 nmol, 500 nmol, 5,000 nmol) foram liofilizadas e feito reagir de acordo com o procedimento descrito. (B) As amostras foram adicionadas a uma placa de 96 cavidades e a quantidade de material reagido detectado a 585 nm. O sinal foi usado para gerar uma curva padrão. 
Figura 2:. Representação gráfica dos resultados de germinação O córtex nmol calculado na Tabela 2 foi representada graficamente em função do tempo. (●) mM de glicina + TA mM 100 10; (■) glicina 100 mM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| NAG Concentração (nmol) | OD 585 |
| 0 | 0,047 |
| 12,5 | 0,054 |
| 25 | 0,066 |
| 50 | 0,084 |
| 100 | 0,128 |
| 250 | 0,285 |
| 500 | 0,556 |
| 5.000 | 4.0 |
| = em branco | 0,046 |
Quadro 1: Padrão de NAG.
| Clostridium difficile germinação de esporos | ||||
| Solução de Germinação (Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM) | ||||
| 100 mM de glicina a 10 mM + TA | 100 mM de glicina | |||
| Tempo (minutos) | OD 585 | Calculado (nmol) | OD 585 | Calculado (nmol) |
| 0 | 0,046 | 0.00 | 0,047 | 0.00 |
| 2 | 0,048 | 2.54 | 0,048 | 1,27 |
| 4 | 0,05 | 5,07 | 0,049 | 2.54 |
| 6 | 0,055 | 11,41 | 0,05 | 3.80 |
| 8 | 0,059 | 16,49 | 0,05 | 3.80 |
| 10 | 0,06 | 17,76 | 0,051 | 5,07 |
| 12 | 0,061 | 19.02 | 0,05 | 3.80 |
| 14 | 0,063 | 21,56 | 0,051 | 5,07 |
Tabela 2: Exemplo de Spore Germinatiem resultados.
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Discussion
Após estimulação, os esporos submetidos ao processo de germinação perder as suas propriedades de resistência, sem a necessidade de síntese macromolecular. Quando a germinação de esporos é acionado, o núcleo de esporos libera DPA em troca de água 2. Devido ao elevado teor de DPA do esporo dormente, o núcleo é de esporos sob intensa pressão osmótica e o peptidoglicano especializado, córtex, ajuda a impedir que o núcleo de inchaço, agindo, presumivelmente, como uma barreira para a expansão 2.
O método acima descrito utiliza reagente de Ehrlich (uma solução amarela) para detectar a presença de açúcares redutores como uma mudança mensurável para uma tonalidade púrpura. Durante a hidrólise córtex, NAG e NAM açúcares são libertados (dependendo do grau de hidrolisar enzimas, os açúcares podem ser libertados como dissacáridos ou polissacáridos). A hidrólise das ligações glicosídicas, por HCl (Passo 2.1) gera monossacáridos com extremidades redutoras livres 7. após neutralizção do ácido com uma quantidade equivalente de hidróxido de sódio (Passo 2.5), os álcoois em torno da NAG e monossacarídeos NAM são acilado com anidrido acético (Passo 2.6) 13. Subsequentemente, o anidrido acético que não reagiu é convertido em ácido acético por aquecimento da amostra (Passo 2.8). Como hipótese por Morgan e Elson 20, o aldeído terminal de converte-se espontaneamente para a forma enol. Sob condições alcalinas (passo 2.10), esta forma de enol pode reagir com o acetil adjacente para gerar um derivado de oxazol, que reage com o reagente de Ehrlich (Passo 4.3) para gerar uma cor púrpura 15,20.
Este método descrito acima produz resultados consistentes e fiáveis para a detecção de fragmentos de córtex de germinação de esporos, tanto B. subtilis e C. difficile 9,16,17. O ensaio requer uma atenção especial para garantir a reação vezes, temperaturas e procedimentos são realizados com precisão. Sem a devida atençãoaos detalhes, é fácil para as condições da reacção a falhar ou não reproduzir entre experiências 13. No entanto, a inclusão de um padrão NAG SIDA na aplicação do ensaio entre ambientes laboratoriais. A norma de controlo positivo NAG incluídos em cada controlos experimentais para qualquer variabilidade inter-experimental (por exemplo, pequenas variações de tempos de reação ou a eficácia do reagente de cor). Reações usando apenas condições tampão e reações com esporos incapazes de hidrolisar córtex ambos produziram nenhuma mudança na cor.
O problema mais comum com este método é a variabilidade inter-experimental ou completa falta de sinal. Para controlar a variabilidade, as preparações de esporos devem ser livres de quaisquer detritos célula vegetativa. Este detritos celulares irá conter fragmentos de peptidoglicano (NAG e NAM) e resultará em um sinal de alta fundo para os esporos germinam. Para garantir uma preparação de esporos pura (> 99,9% esporos), referem-se à literature de métodos para preparar as suspensões de esporos puros no organismo a ser estudado 7,9,21-23.
Se o ensaio não está rendendo qualquer sinal detectável, observou-se que a etapa de liofilização pode introduzir variabilidade. Devido à força com que o vácuo é liberado, observou-se que o pó de amostra seca pode ser soprado para fora do tubo de amostra. Para reduzir / evitar que isso ocorra, use uma agulha de seringa pequena para picar furos nas tampas de tubos de amostra. A pequena área de os furos introduzidos irá reduzir a probabilidade de a amostra liofilizada (agora na forma de pó) seja perturbada. Finalmente, como observado nos métodos acima, os vários passos de incubação são muito sensíveis ao tempo. Certifique-se de que todas as etapas cronometradas são monitorados com cuidado. Uma consideração importante para este ensaio é que os fragmentos de córtex deve ser libertado a partir da germinação de esporos, de modo a ser detectado. Se o córtex é hidrolisado em grandes fragmentos, estes fragmentos podem ser demasiado grande para ser released através do revestimento de esporos. Embora uma consideração importante ao solucionar um experimento que não deu um sinal, recomendamos confirmar que as condições usado para germinar a maioria dos esporos na solução e as outras opções de resolução de problemas listados aqui antes de se considerar o tamanho do fragmento córtex como um problema potencial no o ensaio.
Nem todos os tampões de germinação / condições são adequadas para este ensaio. Uma vez que este ensaio detecta a presença de açúcares redutores libertados durante o processo de germinação 13, qualquer tampão de germinação que contém açúcares redutores ou qualquer germinativo que é, em si, um açúcar redutor (por exemplo, glicose) irá resultar num sinal forte neste ensaio. Se este for o caso, a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) pode ser usado para detectar a presença de fragmentos de córtex 24-26. No entanto, porque nem todos os laboratórios estão equipados com tais instrumentos, o método aqui descrito pode ser utilizado pela maiorialaboratórios e oferece resultados simples e facilmente quantificáveis.
Germinação de esporos de bactérias tem sido amplamente estudado em Bacillus e algumas espécies de Clostridium 2,8. O processo geralmente é conservada, no entanto, existem diferenças. Importante, nem todos os organismos germinar usando mecanismos de germinação de esporos, como observado no modelo de esporos formadores de 9,27. Porque a germinação está sendo estudado em mais diversos organismos, o ensaio descrito acima pode ser aplicada a estes organismos para detectar fragmentos de córtex durante a germinação dos esporos. Ao aplicar este método para estes organismos recém-estudados, os pesquisadores podem determinar o papel proteínas diferentes germinação jogar na hidrólise córtex.
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Acknowledgments
O Projeto descrito é suportado pelo Prêmio Número 5R01AI116895 do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas ou o National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p200 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p20 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| 100 - 1,250 μl pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1 - 200 μll pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid - 10 N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine |
References
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