Introduction
Endospores sont métaboliquement formes dormantes de bactéries qui permettent aux bactéries de persister dans des environnements défavorables. Dans de nombreuses bactéries formant des spores, la formation de spores est induite par une carence en nutriments , mais ce processus peut être contrôlé par des changements à pH, l' exposition à l' oxygène ou d' autres contraintes 1. Alors que dans leur forme de spores métaboliquement dormance, les bactéries résistent rayonnement UV, la dessiccation, des températures plus élevées, et le gel 2. La plupart des connaissances sur le processus de sporulation provient d'études dans l'organisme modèle, Bacillus subtilis. Le processus de sporulation commence avec la réplication de l' ADN et la formation d'un filament de 3,4 axiale. Un septum asymétrique divise ensuite la cellule en deux compartiments de taille inégale. Le grand compartiment, la cellule mère, engloutit plus petit compartiment, préspore. Tant la cellule mère et préspore coordonner l'expression des gènes à mûrir la spore et la cellule mère lyses finalement, libérant le dormant spores dans le milieu environnant 1.
La structure des spores et la composition est conservée dans de nombreuses espèces bactériennes. Le noyau de spores a une teneur en eau inférieure à la cellule végétative et est riche en acide dipicolinique (DPA) 1,2. Au cours de la formation de spores, le DPA est pompée dans le noyau de spores en échange de l'eau. Entourant le noyau est une membrane de spores intérieure où, dans la plupart des bactéries sporulantes, les récepteurs qui reconnaissent les petites molécules qui stimulent la germination germinants (2) sont situés. Situé juste en dehors de la membrane interne de la spore est une couche de peptidoglycane de la paroi cellulaire. Une couche de peptidoglycane spécialisée (cortex) entoure le peptidoglycane de la paroi cellulaire et se compose d'un grand nombre des mêmes composants que le peptidoglycane de la paroi cellulaire [alternance N-acétylglucosamine (NAG) et de l'acide N-acétylmuramique (NAM)]. Toutefois, environ 50% des résidus non alignés dans le cortex ont été convertis en muramique-δ-lactame 5,6 2.
Contrôle du processus de germination est d'une importance cruciale pour les bactéries formant des spores. Germination est déclenchée lorsque les récepteurs de germination interagissent avec leurs germinants respectifs 2. Dans de nombreuses bactéries formant des spores, ces plantules sont des acides aminés, des sucres, des nucléotides, des ions ou des combinaisons de ces deux. C. difficile la germination des spores est initiée par des combinaisons de certains acides biliaires, [par exemple, l' acide taurocholique (TA)] et des acides aminés (par exemple la glycine) , 7-10. Bien qu'il existe des différences entre le C. voie de germination difficile et les voies étudiées dans d' autres sporuléedes bactéries telles que B. subtilis, commun à tous est l'exigence absolue de dégrader le cortex de spores pour permettre à une cellule végétative de croître à partir de la spore germée 2,8. La dégradation de Cortex peut être accompli par le SCLEs CWLj / SLEB (que l'on trouve dans B. subtilis) ou SLEC (que l'on trouve dans de nombreux Clostridia). Cortex hydrolyse réduit la contrainte sur la paroi cellulaire et de la spore. Cela permet noyau pleine réhydratation, une étape nécessaire dans réactivant la plupart des protéines nécessaires pour le métabolisme cellulaire 2.
Lorsque les spores germent, les spores dormantes passe d'un état de phase lumineuse à un état de phase sombre et ce processus peut être mesurée par un changement de densité optique (DO) à 600 11 nm. Un précédent rapport suggère qu'une grande partie de ce changement de OD est due à la libération de DPA de la spore 12. Au cours de notre étude récente, nous avons cherché à comparer le moment de C. difficile la germination des spores et la surveillancelibération de DPA et cortex fragments 9. Pour cette étude, il était essentiel de surveiller la libération de fragments de cortex comme ils ont commencé à être libéré par la germination des spores.
Le dosage colorimétrique utilisé ici a été basé sur une méthode de détection des sucres avec des extrémités réductrices développé Ghuysen et al. 13. Parce que d' autres ont décrit des protocoles pour la détection des sucres réducteurs 14 ou ont modifié les protocoles 15, la littérature sur ce sujet peut être déroutant. Ici, nous détaillons une méthode étape par étape pour la détection colorimétrique de sucres réducteurs libérés de germant C. Les spores difficile. Bien que cette étude utilise C. Les spores difficile, les sucres réducteurs libérés au cours de la germination des spores provenant d' autres bactéries formant des spores puissent être détectées avec ce protocole 9,16,17.
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Protocol
1. Échantillons Génération
- Heat activer C. difficile spores à 65 ° C pendant 30 min et magasin sur la glace.
Remarque: C. Les spores difficile peuvent être produits et purifiés comme décrit précédemment 7,9,10. - Préparer la solution de germination à X + 1 ml où X est le nombre d'échantillons à prélever au cours de l'essai.
Remarque: La solution de germination est spécifique aux espèces de bactéries SPORE à l'étude. Pour doser C. difficile la germination des spores, on a utilisé une solution de Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, glycine 100 mM , et 10 mM d' acide taurocholique dans de l' eau déminéralisée. - Avant de commencer l'essai, prélever un échantillon de la solution de germination 1,0 ml sans spores pour servir de blanc pour la détection de fragments de cortex.
- Ajouter des spores à une DO 600 de 3,0 ~ à la solution de germination et vortexer rapidement.
Remarque: Pour nos études de germination en B. subtilis, nous avons utilisé le même OD 600 spores en tant que de C. difficile.
Note: Cette quantité de spores a bien fonctionné pour la surveillance du cortex fragment de presse au cours de C. difficile la germination des spores. La quantité de spores utilisée dans cet essai doit être déterminée expérimentalement pour chaque bactérie ou souche. - Prélever un échantillon de 1,2 ml immédiatement après l'addition des spores et centrifuger à la température ambiante pendant 1 min à 14 000 x g. Ceci est le point de temps zéro.
- Transférer 1,0 ml du surnageant de l'échantillon centrifugé à un nouveau tube pour analyse subséquente des fragments de cortex.
Remarque: Si DPA doivent être surveillés, prélever un échantillon de 100 pi séparé pour la détection de la DPA dans la solution en utilisant un test basé sur la fluorescence de terbium 9,18,19. - Congeler l'échantillon prélevé à -80 ° C.
- Répétez les étapes 1.4 et 1.5 à intervalles réguliers jusqu'à ce que tous les points de temps terminés.
Remarque: En raison du temps nécessaire pour la centrifugation et de l'échantillonnage, des points de temps moins th2 min étaient en dehors pas possible lors de notre procédure, de sorte que nos intervalles d'échantillonnage ont été une fois toutes les 2 min pour 14 min. - En tant que contrôle positif pour la réduction de la détection du sucre et la quantification, comprennent les montants suivants de N - acétylglucosamine (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 et 5000. Préparer ces échantillons en même temps que des échantillons de cortex et exécuter en même temps que les échantillons de cortex de telle sorte que la courbe d'étalonnage est pertinente pour les données générées par la germination des spores.
- Une fois que tous les échantillons de points de temps sont collectées, lyophiliser les échantillons.
Note: Nous lyophilisée nos échantillons dans 2 ml tubes à bouchon à vis.
2. La mesure Cortex Fragments
- Remettre en suspension les échantillons lyophilisés dans 120 ul de HCl 3N additionné de 1% de phénol et 0,5% de β-mercaptoéthanol.
- Transférer les échantillons remis en suspension à 2 ml tubes à bouchon à vis.
Remarque: Pour la reproductibilité, d'assurer toute l'échantillon lyophilisé est remis en suspension et transféré. <li> Incuber les échantillons dans un bain d'eau de remise en circulation à 95 ° C pendant 4 heures. - Après incubation, placer les échantillons sur la glace jusqu'à ce qu'ils sont cool.
- Neutraliser les échantillons avec 120 pi de NaOH 3 M.
- Ajouter 80 ul d'une solution de bicarbonate de sodium saturée et de 80 ul d'une solution à 5% d'anhydride acétique à chaque échantillon et vortexer.
- Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 min.
- Transférer les échantillons vers le bain C de l'eau à 95 ° C pendant EXACTEMENT 3 min.
Remarque: Cette étape est temps fois plus sensibles et peuvent affecter le développement du signal en aval. - Retirer les échantillons du bain d'eau et refroidir sur glace.
- Ajouter 400 pi de 6,54% de K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O dans chaque tube et vortexer.
- Incuber les échantillons dans un bain d'eau de remise en circulation à 95 ° C pendant exactement 7 minutes.
Remarque: Cette étape est temps fois plus sensibles et peuvent affecter le développement du signal en aval. - Retirerles échantillons et les placer sur la glace pendant 5 min.
3. Couleur Réactif
- Alors que les échantillons sont sur la glace (étape 2.12), préparer le réactif coloré. Dissoudre 0,320 g de p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB, le réactif d'Ehrlich) dans 1,9 ml d'acide acétique glacial.
Remarque: Le réactif est temps, la température et sensible à la lumière et ne doit pas être fait à l'avance. - Après la DMAB se dissout complètement, ajouter 100 pi de N HCl et vortex 10.
- Ajouter 5 ml d'acide acétique glacial et vortex.
4. Réaction Colorimétrie
- Transfert 100 ul de chaque échantillon refroidi cortex dans un nouveau tube de 1,5 ml.
- Ajouter 700 ul de la solution de couleur fraîchement préparé pour chaque échantillon.
- transférer immédiatement les échantillons dans un bain d'eau C 37 ° et incuber pendant EXACTEMENT 20 min.
- Transfert 200 ul de chaque échantillon à une plaque de 96 puits clair.
- Quantifier les échantillons à 585 nm sur une plaquelecteur. Les échantillons doivent commencer à une couleur jaune et une réaction positive se déplacera au violet. Plus cortex présente, plus la couleur pourpre.
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Representative Results
Le tableau 1 présente des résultats typiques en utilisant des normes NAG. Les données sont utilisées pour générer une courbe standard. Le tableau 2 montre des résultats typiques d'un essai de germination dans un tampon de germination supplémenté avec de la glycine 100 mM et TA 10 (conditions de germination favorisant) ou mM de glycine 100 uniquement (conditions de non-germination). En l'absence de TA, C. spores Difficile ne germent et il y a peu de changement dans la présence de fragments de cortex dans la solution. Cependant, en présence des deux TA et de la glycine, C. Les spores germent et Difficile libérer des fragments de cortex dans la solution. Ceci est observé comme une augmentation de la densité optique 585 au cours du temps des échantillons ayant réagi. La quantité totale de fragments de cortex (de nmol) libérés au cours de cet essai a été calculée en utilisant une courbe standard semblable à la figure 1B. Dans cet essai, la plupart du cortex est hydrolyse (ou libérés) par 15 minutes post-exposition germinant, ce qui suggère que la plupart des spores ont germé dans ce laps de temps (figure 2; compatible avec une publication antérieure 7).
Après avoir développé les échantillons dans le réactif de couleur, la plupart des échantillons ne peuvent pas montrer la couleur pourpre à l'œil nu. La figure 1 montre un échantillon représentatif généré à partir de N-acétyl-glucosamine. La plupart des échantillons ne montrent pas une couleur pourpre visible. Cependant, les 250 nmol, 500 nmol et 5.000 nmol échantillons apparaissent visuellement différent du contrôle négatif (0 nmol). Lorsqu'elle est mesurée à une DO de 585 nm, le signal généré correspond le mieux à une régression linéaire (R2 = 0,999).
Figure 1: Détection. N-acétylglucosamine échantillons (A) N-acétylglucosamine (0 nmol, 12,5 nmol,25 nmol, 50 nmol, 100 nmol, 250 nmol, 500 nmol, 5000 nmol) ont été lyophilisées et on fait réagir selon le mode opératoire décrit. (B) Des échantillons ont été introduits dans une plaque à 96 puits et la quantité de matériau ayant réagi détectée à 585 nm. Le signal a été utilisé pour générer une courbe standard. 
Figure 2:. Représentation graphique des résultats Germination Le cortex nmol calculé dans le tableau 2 a été tracée en fonction du temps. (●) mM glycine + 10 mM TA 100; (■) glycine 100 mM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| NAG Concentration (nmol) | OD 585 |
| 0 | 0,047 |
| 12.5 | 0,054 |
| 25 | 0,066 |
| 50 | 0,084 |
| 100 | 0,128 |
| 250 | 0,285 |
| 500 | 0,556 |
| 5000 | 4.0 |
| = blank | 0,046 |
Tableau 1: NAG standard.
| Clostridium difficile Spore Germination | ||||
| Solution de germination (10 mM de Tris (pH 7,5), NaCl 150 mM) | ||||
| 100 mM Glycine + 10 mM TA | 100 mM Glycine | |||
| Temps (minutes) | OD 585 | Calculé (nmol) | OD 585 | Calculé (nmol) |
| 0 | 0,046 | 0.00 | 0,047 | 0.00 |
| 2 | 0,048 | 2,54 | 0,048 | 1,27 |
| 4 | 0,05 | 5.07 | 0,049 | 2,54 |
| 6 | 0,055 | 11.41 | 0,05 | 3,80 |
| 8 | 0,059 | 16,49 | 0,05 | 3,80 |
| dix | 0,06 | 17.76 | 0,051 | 5.07 |
| 12 | 0,061 | 19.02 | 0,05 | 3,80 |
| 14 | 0,063 | 21.56 | 0,051 | 5.07 |
Tableau 2: Exemple de Spore Germinatisur les résultats.
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Discussion
Lors de la stimulation, les spores subissant le processus de germination perdent leurs propriétés de résistance, sans la nécessité de la synthèse macromoléculaire. Lorsque la germination des spores est déclenchée, le noyau de spores libère DPA en échange d'eau 2. En raison de la forte teneur en DPA de la spore dormante, le noyau de spores est sous pression osmotique intense et le peptidoglycane spécialisé, cortex, aide à prévenir le noyau de l' enflure en agissant, sans doute, comme un obstacle à l' expansion 2.
Le procédé décrit ci-dessus utilise le réactif d'Ehrlich (solution jaune) pour détecter la présence de sucres réducteurs comme un changement mesurable d'une teinte pourpre. Au cours de l'hydrolyse du cortex, NAG et les sucres sont libérés NAM (en fonction de l'étendue des enzymes hydrolysant les sucres peuvent être libérés comme disaccharides ou polysaccharides). L' hydrolyse des liaisons glycosidiques par HCl (étape 2.1) génère oses avec des extrémités libres 7 réductrices. Après Neutraliztion de l'acide avec une quantité égale d'hydroxyde de sodium (étape 2.5), les alcools entourant la NAG et des monosaccharides NAM sont acylés par de l' anhydride acétique (étape 2.6) 13. Par la suite, l'anhydride acétique qui n'a pas réagi est converti en acide acétique, en chauffant l'échantillon (étape 2.8). Comme l' hypothèse par Morgan et Elson 20, l'aldéhyde terminal convertit spontanément à la forme énol. Dans des conditions alcalines (étape 2.10), cette forme énol peut réagir avec l'acétyl adjacent pour générer un dérivé d'oxazole qui réagit avec le réactif d'Ehrlich (étape 4.3) pour générer une couleur pourpre 15,20.
Cette méthode décrite ci - dessus donne des résultats cohérents, fiables pour la détection de fragments de cortex de germination des spores, à la fois B. subtilis et C. difficile 9,16,17. Le dosage nécessite une attention particulière pour assurer la réaction fois, les températures et les procédures sont effectuées avec précision. Sans une attention appropriéeau détail, il est facile pour les conditions de réaction à l' échec ou pas reproduire entre les expériences 13. Toutefois, l'inclusion d'un adjuvants classiques NAG dans l'application du dosage entre les environnements de laboratoire. La norme de contrôle positif NAG inclus dans tous les contrôles d'expérimentation pour toute variabilité inter-expérimental (par exemple, de légères variations dans le temps de réaction ou de l' efficacité du réactif de couleur). Les réactions en utilisant uniquement des conditions et des réactions avec des spores incapables d'hydrolyser cortex deux tampons ont donné aucun changement de couleur.
Le problème le plus commun avec cette méthode est la variabilité inter-expérimentale ou absence totale de signaux. Pour contrôler la variabilité, les préparations de spores doivent être exempts de tout débris de cellule végétative. Ces débris de cellules contient des fragments peptidoglycane (NAG et NAM) et se traduira par un signal de fond élevé pour les spores germent. Pour assurer une préparation de spores pur (> 99,9% des spores), reportez-vous à la Literature des méthodes pour préparer des suspensions de spores pures dans l'organisme à étudier 7,9,21-23.
Si l'essai ne cède pas tout signal détectable, nous avons observé que l'étape de lyophilisation peut introduire une variabilité. En raison de la force avec laquelle le vide est libéré, on a observé que la poudre d'échantillon séché peut être soufflée hors du tube d'échantillon. Pour réduire / éviter ce problème, utilisez une petite aiguille de la seringue pour faire des trous dans les sommets des tubes d'échantillons. La petite zone des trous introduits réduira la probabilité de l'échantillon lyophilisé (maintenant sous forme de poudre) d'être dérangé. Enfin, comme il est indiqué dans les procédés ci-dessus, les différentes étapes d'incubation sont très sensibles au temps. Veiller à ce que toutes les étapes chronométrées sont surveillées attentivement. Une considération importante pour cette analyse est que les fragments de cortex doivent être libérés de la spores de germination pour être détectée. Si le cortex est hydrolyse dans de grands fragments, ces fragments peuvent être trop grandes pour être releelon à travers la couche de spores. Bien que d'une considération importante lors de la résolution d'une expérience qui ne donne pas un signal, nous recommandons de confirmer que les conditions utilisées pour germer la plupart des spores dans la solution et les autres options de dépannage répertoriés ici avant d'envisager la taille des fragments de cortex comme un problème potentiel le dosage.
tous les tampons de germination / conditions ne conviennent pas pour ce dosage. Étant donné que cet essai détecte la présence de sucres réducteurs libérés au cours du processus de germination 13, tout tampon de germination contenant des sucres réducteurs ou tout germinant qui est lui - même un sucre réducteur (par exemple, le glucose) se traduira par un signal fort dans cet essai. Si tel est le cas, la chromatographie liquide haute pression (HPLC) peut être utilisée pour détecter la présence de fragments de cortex 24-26. Cependant, parce que tous les laboratoires sont équipés de tels instruments, le procédé décrit ici peut être utilisé par la plupartlaboratoires et offre des résultats simples et facilement quantifiables.
Germination par des spores bactériennes a été largement étudié dans Bacillus et quelques espèces de Clostridium 2,8. Le procédé est généralement conservée, mais des différences existent. Surtout, tous les organismes germent en utilisant des mécanismes de germination des spores comme observé dans les modèles sporulés 9,27. Parce que la germination est de plus en plus étudié divers organismes, le dosage décrit ci-dessus peut être appliquée à ces organismes pour détecter des fragments de cortex pendant la germination des spores. En appliquant cette méthode à ces nouveaux organismes étudiés, les chercheurs peuvent déterminer le rôle des protéines différentes de germination jouent dans l'hydrolyse du cortex.
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Acknowledgments
Le projet décrit est soutenu par le Prix Numéro 5R01AI116895 de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses. Le contenu est uniquement la responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses ou de la National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p200 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p20 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| 100 - 1,250 μl pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1 - 200 μll pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid - 10 N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine |
References
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