Introduction
Endospore sono metabolicamente forme dormienti di batteri che permettono ai batteri di persistono in ambienti sfavorevoli. In molti batteri sporigeni, formazione di spore è indotta da privazione di nutrienti, ma questo processo può essere controllato da cambiamenti di pH, esposizione ad ossigeno o altre sollecitazioni 1. Mentre nella loro forma spore metabolicamente dormiente, i batteri resistono ai raggi UV, essiccazione, temperature più elevate, e il congelamento 2. La maggior parte delle conoscenze sul processo di sporulazione deriva da studi in organismo modello, Bacillus subtilis. Il processo inizia con sporulazione replicazione del DNA e la formazione di un 3,4 filamento assiale. Un setto asimmetrica quindi divide la cella in due compartimenti di dimensioni disuguale. Il vano più grande, la cellula madre, avvolge il vano più piccolo, il forespore. Sia la cellula madre e forespore coordinare l'espressione genica a maturare le spore e la cellula madre alla fine lisa, rilasciando il Dormant spore nell'ambiente circostante 1.
La struttura e la composizione delle spore si conserva in molte specie batteriche. Il nucleo spora ha un contenuto d'acqua inferiore a quella cellula vegetativa ed è ricco di acido dipicolinico (DPA) 1,2. Durante la formazione di spore, DPA viene pompato nel nucleo spore in cambio di acqua. Che circonda il nucleo è una membrana spore interno dove, nella maggior parte dei formare spore dei batteri, i recettori che riconoscono le piccole molecole che stimolano la germinazione (germinants) si trovano 2. Situato appena fuori membrana interna della spora è uno strato di peptidoglicano della parete cellulare. Uno strato peptidoglicano specializzata (corteccia) circonda la peptidoglicano della parete cellulare ed è composto da molti degli stessi componenti come peptidoglicano della parete cellulare [alternati N-acetilglucosamina (NAG) e acido N-acetilmuramico (NAM)]. Tuttavia, circa il 50% dei residui NAM nella corteccia sono stati convertiti in muramico-δ-lattame 5,6 2.
Controllo del processo di germinazione è di fondamentale importanza per la sporulazione. La germinazione è iniziato quando i recettori germinant interagiscono con i loro rispettivi germinants 2. In molti sporulazione, questi germinants sono aminoacidi, zuccheri, nucleotidi, ioni o loro combinazioni 2. C. difficile germinazione è avviata da combinazioni di alcuni acidi biliari, [ad esempio, acido taurocolico (TA)] e amminoacidi (ad esempio, glicina) 7-10. Anche se ci sono differenze tra il C. percorso di germinazione difficile e le vie studiate in altri sporebatteri, come B. subtilis, comune a tutti è il requisito assoluto per degradare la corteccia spore per consentire una cellula vegetativa a crescere dal spore germinato 2,8. Il degrado della corteccia può essere compiuta dal SCLEs CwlJ / SleB (come si trova in B. subtilis) o SLEC (come si trova in molti clostridi). Cortex idrolisi riduce il vincolo sulla parete cellulare e spore. Questo permette di reidratazione pieno centro, un passo necessario per riattivare molte delle proteine necessarie per il metabolismo cellulare 2.
Quando spore germinano, i cambiamenti spore dormienti da uno stato di fase luminoso ad uno stato di fase buia e questo processo può essere misurato da un cambiamento di densità ottica (OD) a 600 nm 11. Un rapporto precedente suggerisce che gran parte di questo cambiamento di OD è dovuto al rilascio di DPA dalla spore 12. Durante il nostro recente studio, abbiamo cercato di confrontare i tempi di C. difficile la germinazione delle spore e monitorato ilrilascio di DPA e corteccia frammenti 9. Per questo studio è stato fondamentale per monitorare il rilascio di frammenti di corteccia come hanno cominciato ad essere rilasciato dalla germinazione delle spore.
Il saggio colorimetrico qui usato si basava su un metodo per rilevare gli zuccheri con estremità riducenti sviluppato Ghuysen et al. 13. Perché altri hanno descritto i protocolli per la rilevazione di zuccheri riducenti 14 o hanno modificato i protocolli 15, la letteratura su questo argomento può essere fonte di confusione. Qui, noi dettaglio un metodo step-by-step per la determinazione colorimetrica di zuccheri riduttori liberati da germinare C. spore difficile. Anche se questo studio utilizza C. spore difficile, gli zuccheri riducenti liberati durante la germinazione di spore da altri batteri sporigeni sono in grado di essere rilevato con questo protocollo 9,16,17.
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Protocol
1. Generazione di campioni
- Calore attivare C. difficile spore a 65 ° C per 30 min e conservare in ghiaccio.
Nota: C. spore difficile può essere prodotto e purificato come descritto in precedenza 7,9,10. - Preparare la soluzione di germinazione a X + 1 ml dove X è il numero di campioni da prelevare durante il dosaggio.
Nota: La soluzione di germinazione è specifico per le specie di batteri spore in fase di studio. Per saggiare C. difficile germinazione delle spore, abbiamo utilizzato una soluzione di 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 100 mM glicina e 10 mM acido taurocolico in acqua deionizzata. - Prima di iniziare il test, estrarre un campione della soluzione di germinazione 1,0 ml senza spore per servire come bianco per il rilevamento frammento corticale.
- Aggiungere spore ad un OD 600 di ~ 3,0 alla soluzione germinazione e vortex rapidamente.
Nota: per i nostri studi di germinazione in B. subtilis, abbiamo utilizzato la stessa OD 600 spore come per C. difficile.
Nota: Questa quantità di spore ha funzionato bene per il monitoraggio corteccia rilascio frammento durante C. difficile la germinazione delle spore. La quantità di spore saggio utilizzare deve essere determinato sperimentalmente per ogni batterio o ceppo. - Rimuovere un campione 1,2 ml subito dopo aver aggiunto le spore e centrifugare a temperatura ambiente per 1 min a 14.000 xg. Questo è il punto di tempo zero.
- Trasferire 1,0 ml del surnatante dal campione centrifugato in una nuova provetta per la successiva analisi di frammenti corteccia.
Nota: Dovrebbe DPA devono essere monitorati, rimuovere un campione di 100 microlitri separato per il rilevamento di DPA nella soluzione utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza terbio 9,18,19. - Congelare il campione raccolto a -80 ° C.
- Ripetere i punti 1.4 e 1.5, a intervalli regolari fino a quando tutti i punti di tempo completati.
Nota: A causa dei tempi necessari per la centrifugazione e campionamento, punti di tempo meno esimoun 2 min a parte, non fosse possibile durante la nostra procedura, così i nostri intervalli di campionamento sono stati una volta ogni 2 min per 14 min. - Come controllo positivo per ridurre rilevamento zucchero e quantificazione, includere le seguenti quantità di N -acetylglucosamine (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 e 5.000. Preparare questi campioni allo stesso tempo come campioni corteccia e correre lungo con i campioni di corteccia in modo che la curva standard è rilevante ai dati generati da germinare spore.
- Dopo che tutti i campioni punto di tempo vengono raccolti, liofilizzare i campioni.
Nota: liofilizzato nostri campioni in tubi con tappo a vite 2 ml.
2. Misura Cortex Frammenti
- Risospendere campioni liofilizzati in 120 ml di 3 N HCl integrato con 1% di fenolo e 0,5% β-mercaptoetanolo.
- Trasferire i campioni risospeso in provette con tappo a vite a 2 ml.
Nota: Per la riproducibilità, garantire tutto il campione liofilizzato viene risospeso e trasferito. <li> Incubare i campioni in un bagno d'acqua di ricircolo a 95 ° C per 4 ore. - Dopo l'incubazione, posizionare i campioni sul ghiaccio fino a quando non sono cool.
- Neutralizzare i campioni con 120 ml di 3 M NaOH.
- Aggiungere 80 ml di una soluzione satura di sodio bicarbonato e 80 ml di una soluzione di anidride acetica 5% per ciascun campione e vortex.
- Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min.
- Trasferire i campioni di nuovo al bagno di acqua C 95 ° per esattamente 3 min.
Nota: questo passaggio è il tempo periodi sensibili e più lunghi possono influenzare lo sviluppo del segnale a valle. - Rimuovere campioni dal bagnomaria e raffreddare su ghiaccio.
- Aggiungere 400 ml di 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O per ogni provetta e vortex.
- Incubare i campioni in un bagno d'acqua di ricircolo a 95 ° C per esattamente 7 min.
Nota: questo passaggio è il tempo periodi sensibili e più lunghi possono influenzare lo sviluppo del segnale a valle. - Rimuoverei campioni e posto in ghiaccio per 5 min.
3. Colore reagente
- Mentre i campioni sono sul ghiaccio (Passo 2.12), preparare il reagente colorato. Sciogliere 0,320 g di p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; reagente di Ehrlich) in 1,9 ml di acido acetico glaciale.
Nota: Il reagente è tempo, temperatura e sensibile alla luce e non dovrebbe essere fatta in anticipo. - Dopo il DMAB dissolve completamente, aggiungere 100 ml di 10 N HCl e vortice.
- Aggiungere 5 ml di acido acetico glaciale e vortice.
4. reazione colorimetrica
- Trasferire 100 ml di ogni campione raffreddati corteccia in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
- Aggiungere 700 ml di soluzione di colore appena preparata per ogni campione.
- trasferire immediatamente i campioni ad un bagno d'acqua C 37 ° e incubare per esattamente 20 minuti.
- Trasferire 200 ml di ogni campione in una piastra a 96 pozzetti chiaro.
- Quantificare i campioni a 585 nm su un piattolettore. I campioni dovrebbero iniziare in un colore giallo e una reazione positiva si sposteranno al viola. Il più corticale presente, il più profondo il colore viola.
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Representative Results
La tabella 1 mostra i risultati tipici utilizzando standard NAG. I dati vengono utilizzati per generare una curva standard. La tabella 2 mostra i risultati tipici della un saggio di germinazione in tampone germinazione supplementato con 100 mM glicina e 10 mM TA (condizioni di germinazione-promozione) o 100 mM glicina solo (condizioni non germinazione). In assenza di TA, C. spore difficile del non germinano e c'è poco cambiamento nella presenza di frammenti corteccia nella soluzione. Tuttavia, in presenza di entrambi TA e glicina, C. spore germinano difficile del rilascio e frammenti di corteccia nella soluzione. Questo si osserva come l'aumento della OD 585 nel tempo dei campioni reagito. La quantità totale di frammenti di corteccia (nmol) rilasciati nel corso di questo dosaggio è stata calcolata usando una curva standard simile alla Figura 1B. In questo saggio, la maggior parte della corteccia è idrolizzato (o rilasciato) per 15 minuti postesposizione germinant, suggerendo che la maggior parte delle spore sono germinati in questo lasso di tempo (Figura 2; coerente con una precedente pubblicazione 7).
Dopo aver sviluppato i campioni nel reagente colorato, la maggior parte dei campioni non possono mostrare il colore viola ad occhio nudo. La Figura 1 mostra un campione rappresentativo generato da N-acetilglucosamina. Molti dei campioni non mostrano un colore viola visibile. Tuttavia, i 250 nmol, 500 nmol e 5.000 nmol campioni appaiono visivamente diverso dal controllo negativo (0 nmol). Quando misurata a OD 585 nm, il segnale generato meglio si adatta una regressione lineare (R 2 = 0,999).
Figura 1: Rilevamento. N-acetilglucosamina campioni (A) N-acetilglucosamina (0 nmol, 12.5 nmol,25 nmol, 50 nmol, 100 nmol, 250 nmol, 500 nmol, 5,000 nmol) sono state liofilizzate e fatti reagire secondo la procedura descritta. (B) I campioni sono stati aggiunti ad una piastra a 96 pozzetti e la quantità di materiale reagito rilevato a 585 nm. Il segnale è stato utilizzato per generare una curva standard. 
Figura 2:. Rappresentazione grafica di germinazione Risultati La corteccia nmol calcolato nella tabella 2 è stata tracciata in funzione del tempo. (●) 100 mM glicina + 10 mM TA; (■) 100 mM glicina. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| NAG Concentrazione (nmol) | OD 585 |
| 0 | 0.047 |
| 12.5 | 0,054 |
| 25 | 0,066 |
| 50 | 0,084 |
| 100 | 0,128 |
| 250 | 0,285 |
| 500 | 0,556 |
| 5.000 | 4.0 |
| = vuote | 0,046 |
Tabella 1: NAG standard.
| Clostridium difficile germinazione delle spore | ||||
| Germinazione Solution (10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl) | ||||
| 100 mM glicina + 10 mM TA | 100 mM glicina | |||
| Tempo (minuti) | OD 585 | Calcolato (nmol) | OD 585 | Calcolato (nmol) |
| 0 | 0,046 | 0.00 | 0.047 | 0.00 |
| 2 | 0,048 | 2,54 | 0,048 | 1.27 |
| 4 | 0.05 | 5.07 | 0,049 | 2,54 |
| 6 | 0,055 | 11.41 | 0.05 | 3.80 |
| 8 | 0,059 | 16.49 | 0.05 | 3.80 |
| 10 | 0.06 | 17.76 | 0.051 | 5.07 |
| 12 | 0,061 | 19.02 | 0.05 | 3.80 |
| 14 | 0,063 | 21.56 | 0.051 | 5.07 |
Tabella 2: Sample Spore Germinatisui risultati.
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Discussion
Dopo stimolazione, spore sottoposti al processo di germinazione perdono le loro caratteristiche di resistenza senza la necessità per la sintesi macromolecolare. Quando la germinazione delle spore viene attivato, il nucleo spore rilascia DPA in cambio di acqua 2. A causa dell'elevato contenuto DPA della spora dormienti, il nucleo spore è sotto forte pressione osmotica ed il peptidoglicano specializzata, corteccia, aiuta a prevenire il nucleo di gonfiore agendo, presumibilmente, come barriera all'espansione 2.
Il metodo sopra descritto utilizza il reagente di Ehrlich (una soluzione gialla) per rilevare la presenza di zuccheri riducenti come misurabile ad una tinta viola. Durante corteccia idrolisi NAG e NAM zuccheri sono liberati (a seconda della portata di enzimi idrolizzano, gli zuccheri possono essere liberati come disaccaridi o polisaccaridi). L'idrolisi dei legami glicosidici da HCl (Step 2.1) genera monosaccaridi con estremità libere riducendo 7. dopo neutralizzione dell'acido con una pari quantità di idrossido di sodio (punto 2.5), gli alcoli circondano il NAG e monosaccaridi NAM sono acilati da anidride acetica (punto 2.6) 13. Successivamente, non reagito anidride acetica viene convertito in acido acetico riscaldando il campione (passo 2.8). Come ipotizzato da Morgan e Elson 20, l'aldeide terminale converte spontaneamente alla forma enolica. In condizioni alcaline (passo 2.10), questa forma enolica può reagire con l'acetil adiacente per generare un derivato oxazole che reagisce con il reagente di Ehrlich (Passo 4.3) per generare un colore viola 15,20.
Questo metodo sopra descritto produce risultati coerenti e affidabili per la rivelazione di frammenti di corteccia di germinare spore, sia B. subtilis e C. difficile 9,16,17. Il test richiede una particolare attenzione per assicurare la reazione di tempi, temperature e le procedure vengono eseguite con precisione. Senza la giusta attenzioneper i dettagli, è facile per le condizioni di reazione a fallire o non riprodurre tra esperimenti 13. Tuttavia, l'inserimento di un NAG serie contribuisce nell'applicazione del dosaggio tra gli ambienti di laboratorio. Lo standard di controllo positivo NAG incluso in ogni esperimento di controllo per qualsiasi variabilità inter-sperimentale (ad esempio, leggere variazioni nei tempi di reazione e l'efficacia del reagente colore). Le reazioni che utilizzano solo le condizioni di buffer e le reazioni con le spore incapaci di idrolizzare corteccia sia ceduto nessun cambiamento di colore.
Il problema più comune con questo metodo è la variabilità inter-sperimentale o completa mancanza di segnale. Per controllare la variabilità, la preparazione di spore devono essere privi di qualsiasi residuo cellula vegetativa. Questo detriti cellulari conterrà frammenti di peptidoglicano (NAG e NAM) e si tradurrà in un segnale alto di sfondo per le spore germinano. Per garantire una preparazione spora puro (> 99,9% spore), fare riferimento alla Literature per i metodi per preparare sospensioni di spore puro nell'organismo da studiare 7,9,21-23.
Se il test non sta dando alcun segnale rilevabile, abbiamo osservato che la fase di liofilizzazione può introdurre variabilità. Grazie alla forza con cui viene rilasciato il vuoto, abbiamo osservato che la polvere campione essiccato può essere soffiata fuori della provetta. Per ridurre / impedire che ciò si verifichi, utilizzare un piccolo ago della siringa per colpire i fori nella parte superiore delle provette dei campioni. La piccola area dei fori introdotte riduce la probabilità che il campione liofilizzato (ora in forma di polvere) venga disturbato. Infine, come osservato nei metodi di cui sopra, le varie fasi di incubazione sono molto sensibili tempo. Assicurarsi che tutti i passaggi cronometrati sono monitorati con attenzione. Una considerazione importante per questo dosaggio è che i frammenti corteccia devono essere rilasciati dal spore germinazione per essere rilevata. Se la corteccia viene idrolizzato in grandi frammenti, questi frammenti possono essere troppo grandi per essere released attraverso il cappotto spore. Anche se una considerazione importante per la risoluzione di un esperimento che non cede un segnale, si consiglia di confermare che le condizioni utilizzate per germinare la maggior parte delle spore nella soluzione e le altre opzioni di risoluzione dei problemi elencati di seguito, prima di considerare dimensione del frammento corticale come un potenziale problema in il dosaggio.
Non tutti i buffer di germinazione / condizioni sono adatti per questo test. Poiché questo test rileva la presenza di zuccheri riducenti liberati durante il processo di germinazione 13, ogni buffer di germinazione che contiene zuccheri riducenti o qualsiasi germinant che è, a sua volta, uno zucchero riducente (ad esempio, glucosio) si tradurrà in un forte segnale in questo saggio. Se questo è il caso, ad alta pressione cromatografia liquida (HPLC) può essere utilizzato per rilevare la presenza di frammenti corteccia 24-26. Tuttavia, poiché non tutti i laboratori sono dotati di tale strumentazione, il metodo descritto può essere utilizzato da piùlaboratori e offre risultati semplici e facilmente quantificabili.
La germinazione da spore batteriche è stato ampiamente studiato in Bacillus e un paio di specie di Clostridium 2,8. Il processo è generalmente conservata, tuttavia esistono differenze. È importante sottolineare che non tutti gli organismi germinano utilizzando meccanismi di germinazione delle spore, come osservato nelle modello di spore-formatori 9,27. Poiché la germinazione sta diventando studiato in organismi più diversi, il test sopra descritto può essere applicato a questi organismi per rilevare frammenti corteccia durante la germinazione delle spore. Applicando questo metodo a questi nuovi organismi studiati, i ricercatori possono determinare il ruolo delle proteine diverse germinazione giocano nella corteccia idrolisi.
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Acknowledgments
Il progetto descritto è supportato da premio Numero 5R01AI116895 dal National Institute of Allergy e Malattie infettive. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institute of Allergy e Malattie infettive o il National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p200 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p20 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| 100 - 1,250 μl pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1 - 200 μll pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid - 10 N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine |
References
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