Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

كشف اللحاء شظايا خلال البكتيرية سبور الإنبات

doi: 10.3791/54146 Published: June 25, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الأبواغ هي عملية الأيض أشكال نائمة من البكتيريا التي تسمح للبكتيريا ان تستمر في البيئات غير المواتية. في كثير من البكتيريا المكونة للبوغ، هو فعل تشكيل بوغ بالحرمان من المغذيات ولكن يمكن التحكم في هذه العملية من خلال التغييرات في درجة الحموضة، والتعرض للأكسجين أو ضغوط أخرى 1. بينما في شكل بوغ نائمة عملية الأيض، والبكتيريا تقاوم الأشعة فوق البنفسجية، جفاف، ارتفاع درجات الحرارة، وتجميد 2. معظم المعارف على عملية تكاثر يأتي من دراسات في الكائن الحي نموذج، العصوية الرقيقة. تبدأ عملية تبوغ مع تكرار الحمض النووي وتشكيل 3،4 خيوط المحوري. والحاجز غير المتماثلة ثم يقسم الخلية إلى قسمين الحجم غير متكافئ. مقصورة أكبر، الخلية الأم، يجتاح حجرة صغيرة، وforespore. كل من الخلية الأم وforespore تنسيق التعبير الجيني لانضاج الجراثيم والخلية الأم انحلال في نهاية المطاف، والإفراج عن دورمانر بوغ في البيئة المحيطة 1.

يتم حفظها هيكل الجراثيم والتكوين عبر العديد من الأنواع البكتيرية. جوهر بوغ يحتوي على نسبة الماء أقل من الخلية النباتية وغنية بحمض dipicolinic (د ب أ) 1،2. خلال تشكيل بوغ، يتم ضخ DPA في صلب بوغ في مقابل الماء. المحيطة الأساسية هو غشاء بوغ الداخلي حيث، في معظم البكتيريا بوغ تشكيل، والمستقبلات التي تعترف الجزيئات الصغيرة التي تحفز إنبات (germinants) تقع 2. يقع خارج الغشاء الداخلي للبوغ هو طبقة من ببتيدوغليكان جدار الخلية. وهناك طبقة ببتيدوغليكان المتخصصة (القشرة) تحيط ببتيدوغليكان جدار الخلية وتتكون من العديد من نفس المكونات كما ببتيدوغليكان جدار الخلية [بالتناوب N-اسيتيل (ناغ) وحمض N-acetylmuramic (NAM)]. ومع ذلك، فقد تم تحويل ما يقرب من 50٪ من بقايا حركة عدم الانحياز في القشرة لالموراميك-δ لاكتام 5،6 2.

السيطرة على عملية الإنبات أمرا شديد الأهمية للبكتيريا تشكيل بوغ. يبدأ الإنبات عندما تتفاعل مستقبلات germinant مع germinants كل فيما يخصه 2. في كثير من البكتيريا المكونة للبوغ، هذه germinants هي الأحماض الأمينية والسكريات، النيوكليوتيدات، أيونات أو خليط منها 2. C. يبدأ صعب بوغ إنبات عن طريق مزيج من بعض أنواع الحوامض الصفراء، [على سبيل المثال، حمض taurocholic (TA)] والأحماض الأمينية (على سبيل المثال، الجلايسين) 7-10. على الرغم من وجود اختلافات بين C. العسيرة مسار الإنبات ومسارات درس في البعض تشكيل بوغالبكتيريا، مثل B. الرقيقة، مشتركة بين جميع هو شرط مطلق للحط من القشرة بوغ للسماح للخلية النباتية لتنمو من بذرة نبتت 2،8. تدهور القشرة يمكن أن يتحقق من قبل SCLEs CwlJ / SleB (كما هو موجود في B. الرقيقة) أو SleC (كما هو موجود في كثير من المطثيات). قشرة المائي يقلل من القيود على جدار الخلية والجراثيم. وهذا يسمح لمعالجة الجفاف الأساسية كاملة، خطوة ضرورية في تنشيط العديد من البروتينات اللازمة لعمليات أيض الخلايا 2.

عندما تنبت الجراثيم، والتغيرات بوغ نائمة من دولة مرحلة مشرقة لدولة مرحلة مظلمة وهذه العملية يمكن قياس التغير في الكثافة الضوئية (OD) في 600 نانومتر 11. ويشير التقرير السابق أن جزءا كبيرا من هذا التغيير في التطوير التنظيمي ويرجع ذلك إلى الإفراج عن DPA من بوغ 12. خلال دراستنا الأخيرة، سعينا لمقارنة توقيت C. صعب بوغ الإنبات ومراقبةالافراج عن الشؤون السياسية والقشرة شظايا 9. لهذه الدراسة انه من الضروري مراقبة الإفراج عن شظايا القشرة لأنها بدأت سيصدر من قبل الإنبات جراثيم.

واستند الفحص اللونية المستخدمة هنا على طريقة للكشف عن السكريات مع الحد من الغايات وضعت Ghuysen وآخرون. 13. لأن الآخرين قد وصف بروتوكولات للكشف عن السكريات المختزلة 14 أو عدلت هذه البروتوكولات 15، والأدب حول هذا الموضوع يمكن أن يكون مربكا. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة خطوة بخطوة للكشف اللونية من السكريات المختزلة تتحرر من الإنبات C. جراثيم صعب. على الرغم من يستخدم هذه الدراسة C. جراثيم صعب، والسكريات المختزلة صدر خلال إنبات الجراثيم من البكتيريا الأخرى لتشكيل بوغ هي قادرة على أن الكشف عن هذا البروتوكول 9،16،17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. عينات توليد

  1. الحرارة تفعيل C. صعب الجراثيم عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتخزينها على الجليد.
    ملاحظة: C. جراثيم صعب يمكن أن تنتج وتنقيته كما هو موضح سابقا 7،9،10.
  2. إعداد الحل الإنبات في X + 1 مل حيث X هو عدد العينات التي تؤخذ أثناء الفحص.
    ملاحظة: الحل إنبات محددة لأنواع من البكتيريا الجراثيم التي تجري دراستها. لمعايرة C. صعب بوغ الإنبات، استخدمنا حل 10 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 100 الجلايسين ملي و 10 ملي حمض taurocholic في الماء منزوع الأيونات.
  3. قبل البدء في الفحص، رسم 1.0 مل عينة من الحل إنبات الجراثيم دون أن تكون فارغة للكشف عن القشرة شظية.
  4. إضافة الجراثيم إلى OD 600 من ~ 3.0 إلى حل الإنبات ودوامة بسرعة.
    ملاحظة: للحصول على الدراسات الإنبات لدينا في B. الرقيقة، استخدمنا نفس OD 600 الجراثيم بالنسبة للC. صعب.
    ملاحظة: هذا المبلغ من الجراثيم عملت بشكل جيد للرصد القشرة الافراج عن جزء خلال C. صعب بوغ الإنبات. وينبغي أن تحدد كمية من الجراثيم المستخدمة في هذا الاختبار تجريبيا لكل بكتيريا أو السلالة.
  5. إزالة 1.2 مل عينة فورا بعد إضافة الجراثيم وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة في 14000 × ز. وهذه هي النقطة الساعة الصفر.
  6. نقل 1.0 مل من طاف من العينة طرد لأنبوب جديد لتحليل قشرة جزء لاحق.
    ملاحظة: يجب DPA تحتاج إلى رصد، إزالة عينة 100 ميكرولتر منفصلة للكشف عن DPA في الحل باستخدام مقايسة على أساس التيربيوم مضان 9،18،19.
  7. تجميد العينة التي تم جمعها في -80 درجة مئوية.
  8. كرر الخطوات من 1.4 و 1.5 على فترات منتظمة حتى الانتهاء من جميع نقاط الوقت.
    ملاحظة: بسبب الوقت اللازم لالطرد المركزي وأخذ العينات، ونقاط وقت أقل عشركان ل2 دقيقة بعيدا يكن من الممكن أثناء إجراء دينا، لذلك كانت فترات أخذ العينات لدينا مرة واحدة كل دقيقة 2 لمدة 14 دقيقة.
  9. كما تحكم إيجابية للحد من الكشف عن السكر وتقدير، وتشمل المبالغ التالية N -acetylglucosamine (نانومول): 0، 12.5، 25، 50، 100، 250، 500، و 5،000. إعداد هذه العينات في نفس الوقت الذي عينات القشرة وتشغيل جنبا إلى جنب مع عينات القشرة بحيث منحنى هو معيار ذات الصلة البيانات التي تم إنشاؤها من قبل الإنبات جراثيم.
  10. بعد أن يتم جمع كل العينات نقطة زمنية، يجفد العينات.
    ملاحظة: نحن مجفف بالتجميد عينات لدينا في 2 مل أنابيب المسمار الحد الأقصى.

2. قياس اللحاء شظايا

  1. و resuspend العينات مجفف بالتجميد في 120 ميكرولتر من 3 N حمض الهيدروكلوريك تستكمل مع الفينول 1٪ و 0.5٪ β-المركابتويثانول.
  2. نقل العينات معلق إلى 2 مل أنابيب المسمار الحد الأقصى.
    ملاحظة: للحصول على التكاثر، وضمان معلق كل عينة مجفف بالتجميد ونقل.
  3. <لى> احتضان هذه العينات في حمام مائي إعادة تدوير في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
  4. بعد الحضانة، ووضع العينات على الجليد حتى أنها باردة.
  5. تحييد العينات مع 120 ميكرولتر من 3 M هيدروكسيد الصوديوم.
  6. إضافة 80 ميكرولتر من محلول بيكربونات الصوديوم المشبعة و 80 ميكرولتر من 5٪ محلول أنهيدريد الخل لكل عينة ودوامة.
  7. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  8. نقل العينات إلى 95 ° C حمام الماء لمدة 3 دقائق بالضبط.
    ملاحظة: هذه الخطوة وقتا طويلا الأوقات الحساسة وأطول يمكن أن يؤثر على نمو إشارة المصب.
  9. إزالة عينات من الحمام المائي وتبرد على الجليد.
  10. إضافة 400 ميكرولتر من 6.54٪ K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O لكل أنبوب والدوامة.
  11. احتضان هذه العينات في حمام مائي إعادة تدوير في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق بالضبط.
    ملاحظة: هذه الخطوة وقتا طويلا الأوقات الحساسة وأطول يمكن أن يؤثر على نمو إشارة المصب.
  12. إزالةالعينات ومكان على الجليد لمدة 5 دقائق.

3. اللون الكاشف

  1. بينما العينات على الجليد (الخطوة 2.12)، وإعداد كاشف اللون. حل 0.320 غرام من ص -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB، كاشف إرليخ) في 1.9 مل من حمض الخليك الجليدي.
    ملاحظة: الكاشف الوقت ودرجة الحرارة والضوء حساسة ويجب أن لا يتم مقدما.
  2. بعد DMAB يذوب تماما، إضافة 100 ميكرولتر من 10 N حمض الهيدروكلوريك ودوامة.
  3. إضافة 5 مل من حمض الخليك الجليدي ودوامة.

4. رد الفعل اللونية

  1. نقل 100 ميكرولتر من كل عينة تبرد القشرة إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل جديد.
  2. إضافة 700 ميكرولتر من محلول اللون الطازجة إلى كل عينة.
  3. على الفور نقل العينات إلى 37 درجة مئوية الماء حمام واحتضان لمدة 20 دقيقة بالضبط.
  4. نقل 200 ميكرولتر من كل عينة إلى لوحة 96-جيدا واضحة.
  5. تحديد العينات عند 585 نانومتر على طبق من ذهبقارئ. وينبغي أن تبدأ عينات في اللون الأصفر، وسوف رد فعل إيجابي يتحول إلى اللون الأرجواني. المزيد من القشرة الوقت الحاضر، وعمق اللون الأرجواني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويبين الجدول 1 نتائج نموذجية باستخدام معايير ناج. وتستخدم البيانات لإنشاء منحنى القياسية. ويبين الجدول 2 النتائج نموذجية من فحص الإنبات في المخزن إنبات تستكمل مع 100 الجلايسين ملي و 10 ملي TA (الظروف المعززة للإنبات) أو 100 الجلايسين ملم فقط (شروط عدم الإنبات). في غياب TA، C. جراثيم صعب لا تنبت، وهناك تغيير طفيف في وجود شظايا القشرة في الحل. ومع ذلك، في حضور كل من TA والجلايسين، C. جراثيم صعب تنبت وتطلق شظايا القشرة إلى الحل. لوحظ هذا الأمر زيادة في OD 585 على مر الزمن من العينات كان رد فعل. تم احتساب المبلغ الإجمالي للأجزاء القشرة (نانومول) صدر خلال هذا الاختبار باستخدام المنحنى القياسي مشابهة للشكل 1B. في هذا الاختبار، وتحلل معظم القشرة (أو الإفراج عنهم) من خلال 15 دقيقة مرحلة ما بعدالتعرض germinant، مما يشير إلى أن معظم الجراثيم قد نبتت في هذا الإطار الزمني (الشكل 2، بما يتفق مع القراءات السابقة 7).

بعد وضع العينات في كاشف اللون، معظم العينات قد لا تظهر اللون الأرجواني للعين المجردة. يوضح الشكل 1 عينة تمثيلية الناتجة عن N-اسيتيل. العديد من العينات لا تظهر اللون الأرجواني مرئية. ومع ذلك، فإن 250 نانومول، 500 نانومول و 5،000 نانومول عينات تظهر مختلفة بصريا من السيطرة السلبية (0 نانومول). عند قياسها في OD 585 نانومتر، ولدت إشارة يناسب الانحدار الخطي (R 2 = 0.999).

شكل 1
الشكل 1: كشف N-اسيتيل عينات (A) N-اسيتيل (0 نانومول، 12.5 نانومول،25 نانومول، 50 نانومول، 100 نانومول، 250 نانومول، 500 نانومول، 5000 نانومول) ومجفف بالتجميد وكان رد فعل وفقا للإجراءات وصفها. وأضاف (ب) عينات لوحة 96 جيدا وكمية المواد ردت الكشف على 585 نانومتر. تم استخدام إشارة لتوليد منحنى القياسية. الشكل 2
الشكل 2: التمثيل البياني للنتائج الإنبات قد حيكت القشرة نانومول المحسوبة في الجدول 2 مقابل الوقت. (●) 100 ملي الجلايسين + 10 ملي TA. (■) 100 ملي الجلايسين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

NAG تركيز (نانومول) OD 585
0 0.047
12.5 0.054
25 0.066
50 0.084
100 0.128
250 0.285
500 0.556
5000 4.0
= فارغة 0.046

الجدول 1: ناج قياسي.

المطثية العسيرة سبور الإنبات
الحل إنبات (10 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، 150 مم كلوريد الصوديوم)
100 ملي جليكاين + 10 ملي TA 100 ملي جليكاين
الوقت (دقيقة) OD 585 حساب (نانومول) OD 585 حساب (نانومول)
0 0.046 0.00 0.047 0.00
2 0.048 2.54 0.048 1.27
4 0.05 5.07 0.049 2.54
6 0.055 11.41 0.05 3.80
8 0.059 16.49 0.05 3.80
10 0.06 17.76 0.051 5.07
12 0.061 19.02 0.05 3.80
14 0.063 21.56 0.051 5.07

الجدول 2: نموذج سبور Germinatiعلى النتائج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

على التحفيز، الجراثيم التي تمر بعملية الإنبات تفقد خصائص مقاومة من دون الحاجة إلى تركيب الجزيئات. عندما يتم تشغيل إنبات الجراثيم، جوهر بوغ النشرات DPA مقابل الماء 2. نظرا لما يحتويه DPA عالية من الجراثيم نائمة، جوهر بوغ تحت الضغط الاسموزي الشديد وببتيدوغليكان المتخصصة، والقشرة، يساعد على منع الأساسية من تورم من خلال العمل، ويفترض، كحاجز للتوسع 2.

الطريقة المذكورة أعلاه يستخدم كاشف إرليخ (حل الأصفر) للكشف عن وجود السكريات المختزلة تحولا للقياس إلى لون بنفسجي. خلال التحلل القشرة، تتحرر NAG وحركة عدم الانحياز السكريات (اعتمادا على مدى الانزيمات hydrolyzing، والسكريات يمكن أن تتحرر كما السكرية الثنائية أو السكريات). التحلل من الروابط غليكوزيدية بواسطة حمض الهيدروكلوريك (الخطوة 2.1) يولد السكريات الأحادية مع خدمة غايات الحد من 7. بعد neutralizجي الحامض مع مبلغ مساو من هيدروكسيد الصوديوم (الخطوة 2.5)، وacylated كحول المحيطة NAG والسكريات الأحادية حركة عدم الانحياز التي كتبها أنهيدريد الخليك (الخطوة 2.6) 13. بعد ذلك، يتم تحويل أنهيدريد الخليك غير المتفاعل إلى حامض الخليك عن طريق تسخين العينة (الخطوة 2.8). كما افترض مورغان والسون 20، ألدهيد محطة تحويل تلقائيا إلى شكل إنول. تحت الظروف القلوية (الخطوة 2.10)، وهذا يمكن شكل إنول تتفاعل مع الاسيتيل المجاور لتوليد مشتق oxazole الذي يتفاعل مع كاشف إرليخ (الخطوة 4.3) لإنشاء اللون الأرجواني 15،20.

هذه الطريقة المذكورة أعلاه غلة، نتائج متسقة موثوقة للكشف عن أجزاء القشرة من الإنبات جراثيم، سواء B. الرقيقة وC. صعب 9،16،17. يتطلب فحص اهتمام خاص لضمان رد فعل يتم تنفيذ مرات، ودرجات الحرارة والإجراءات بدقة. دون الاهتمام المناسببالتفاصيل، فمن السهل لظروف التفاعل فشل أو عدم إعادة إنتاج بين التجارب 13. ومع ذلك، فإن إدراج NAG الوسائل القياسية في تطبيق الفحص بين بيئات المختبرات. نجع معيار السيطرة الإيجابية التي تضمنها كل الضوابط التجربة لأي التباين بين التجريبي (على سبيل المثال، هناك اختلافات طفيفة في أوقات رد الفعل أو فعالية كاشف اللون). ردود الفعل باستخدام الظروف عازلة فقط، وردود الفعل مع جراثيم قادرة على hydrolyzing القشرة على حد سواء لم تسفر عن أي تغيير في اللون.

المشكلة الأكثر شيوعا مع هذا الأسلوب هو التباين بين التجريبي أو انعدام تام للإشارة. للسيطرة على التغير، يجب أن تكون الاستعدادات بوغ خالية من أي حطام خلية الخضري. وسيتضمن هذا الحطام الخلية شظايا ببتيدوغليكان (NAG وحركة عدم الانحياز)، وسوف يؤدي في إشارة خلفية عالية للجراثيم الإنبات. لضمان إعداد بوغ النقي (> 99.9٪ الجراثيم)، تشير إلى literatuإعادة لطرق لإعداد تعليق بوغ نقية في الكائن الحي لدراستها 7،9،21-23.

إذا كان الفحص لا يحقق أي إشارة يمكن كشفها، لاحظنا أن الخطوة lyophilizing يمكن إدخال التغير. ويرجع ذلك إلى القوة التي يتم تحريرها من فراغ، لاحظنا أن مسحوق العينة المجففة يمكن تخرج من أنبوب العينة. للحد من / منع هذا من الحدوث، واستخدام إبرة حقنة صغيرة لكزة ثقوب في قمم أنابيب العينات. فإن منطقة صغيرة من الثقوب قدم يقلل من احتمالات العينة مجفف بالتجميد (الآن في شكل مسحوق) من يجري بالانزعاج. وأخيرا، كما لوحظ في أساليب أعلاه، فإن العديد من الخطوات حضانة وقتا طويلا جدا حساسة. التأكد من أن جميع الخطوات توقيت تتم مراقبتها بعناية. أحد الاعتبارات الهامة لهذا الاختبار هو أن شظايا القشرة يجب الإفراج عن بوغ الإنبات من أجل الكشف عنها. إذا تحلل القشرة إلى شظايا كبيرة، قد تكون هذه الشظايا كبير جدا ليكون releASED من خلال معطف بوغ. وعلى الرغم من اعتبار مهم عند استكشاف التجربة التي لا تسفر عن إشارة، فإننا نوصي للتأكد من أن الظروف المستخدمة لتنبت معظم الجراثيم في حل وغيرها من الخيارات استكشاف الأخطاء وإصلاحها المذكورة هنا قبل النظر في حجم القشرة جزء باعتباره مشكلة محتملة في الفحص.

ليس كل مخازن إنبات / الشروط هي مناسبة لهذا الاختبار. لأن هذا الفحص بالكشف عن وجود السكريات المختزلة تتحرر أثناء عملية الإنبات 13، أي عازلة إنبات التي تحتوي على السكريات المختزلة أو أي germinant التي هي، في حد ذاته، والسكر المختزل (على سبيل المثال، الجلوكوز) سيؤدي في إشارة قوية في هذا الاختبار. إذا كان هذا هو الحال، وارتفاع ضغط اللوني السائل (HPLC) يمكن استخدامها للكشف عن وجود شظايا القشرة 24-26. ومع ذلك، لأنه لم يتم تجهيز جميع المختبرات مع هذه الأجهزة، والطريقة الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم من قبل معظممختبرات، ويقدم نتائج بسيطة وقابلة للقياس بسهولة.

وإلى حد كبير درس الإنبات بواسطة الجراثيم البكتيرية في العصوية وعدد قليل من الأنواع المطثية 2،8. يتم حفظها عملية عموما، ومع ذلك توجد اختلافات. الأهم من ذلك، ليس كل الكائنات الحية تنبت باستخدام آليات إنبات الجراثيم كما لوحظ في نموذج بوغ المتألق 9،27. لأن إنبات أصبحت تدرس في الكائنات أكثر تنوعا، ويمكن تطبيق الفحص المذكورة أعلاه لهذه الكائنات للكشف عن أجزاء القشرة خلال إنبات الجراثيم. من خلال تطبيق هذا الأسلوب لهذه الكائنات درس حديثا، يمكن للباحثين تحديد دور البروتينات المختلفة إنبات تلعب في التحلل القشرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ويدعم المشروع التي وصفها جائزة عدد 5R01AI116895 من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية أو المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 ml screw cap tube USA scientific 1420-3700
p1000 Eppendorf pipet Eppendorf
p200 Eppendorf pipet Eppendorf
p20 Eppendorf pipet Eppendorf
100 - 1,250 μl pipet tips VWR 89079-486
1 - 200 μll pipet tips VWR 89079-458
N-acetyl-D-glucosamine Sigma A3286-25G
Hydrochloric Acid - 10 N BDH-Aristar BDH3032-3.8LP
Acetic Anhydride Alfa Aesar L04295
Sodium Bicarbonate BDH BDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrate Alfa Aesar 39435
Sodium Hydroxide BDH BDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehyde Sigma 156477-100G
Saturated Phenol Fisher BP1750-400
2-Mercaptoethanol Aldrich M6250-100ML
SpectraMax M3 Molecular Devices
Acetic Acid, Glacial BDH BDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water Bath VWR Scientific Model 1136
Microtest 96 Falcon 353072 96 well clear tissue culture plates
Culture tubes VWR 89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
  2. Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
  3. Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
  4. Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
  5. Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
  6. Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
  7. Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
  8. Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22, (7), (2014).
  9. Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197, (14), (2015).
  10. Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).
  11. Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
  12. Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).
  13. Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
  14. Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
  15. Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
  16. Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
  17. Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
  18. Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
  19. Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
  20. Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
  21. Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
  22. Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
  23. Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
  24. Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
  25. Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
  26. Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
  27. Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).
كشف اللحاء شظايا خلال البكتيرية سبور الإنبات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Francis, M. B., Sorg, J. A. Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination. J. Vis. Exp. (112), e54146, doi:10.3791/54146 (2016).More

Francis, M. B., Sorg, J. A. Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination. J. Vis. Exp. (112), e54146, doi:10.3791/54146 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter