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Immunology and Infection

कॉर्टेक्स टुकड़े का पता लगाने के बैक्टीरियल बीजाणु अंकुरण के दौरान

doi: 10.3791/54146 Published: June 25, 2016

Introduction

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Endospores पाचन बैक्टीरिया है कि बैक्टीरिया प्रतिकूल वातावरण में जारी रहती है करने की अनुमति के निष्क्रिय रूप हैं। कई बीजाणु के गठन बैक्टीरिया में, बीजाणु गठन पोषक तत्व के अभाव से प्रेरित है, लेकिन इस प्रक्रिया में ऑक्सीजन या अन्य तनाव 1 पीएच, जोखिम में परिवर्तन के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। उनकी पाचन निष्क्रिय बीजाणु रूप में रहते हुए, बैक्टीरिया पराबैंगनी विकिरण, सुखाना, उच्च तापमान, ठंड और 2 का विरोध। Sporulation प्रक्रिया पर ज्ञान के अधिकांश मॉडल जीव में अध्ययन, बेसिलस subtilis से आता है। Sporulation प्रक्रिया डीएनए प्रतिकृति और एक अक्षीय रेशा 3,4 के गठन के साथ शुरू होता है। एक विषम पट फिर दो असमान आकार डिब्बों में सेल बिताते हैं। बड़े डिब्बे, मां सेल, छोटे डिब्बे, forespore समाई है। दोनों मां सेल और forespore जीन अभिव्यक्ति का समन्वय बीजाणु और मां सेल अंततः lyses परिपक्व करने के लिए, Dorman रिहाआसपास के वातावरण में 1 टी बीजाणु।

बीजाणु संरचना और संरचना में कई प्रजातियों के जीवाणु भर में संरक्षित है। बीजाणु कोर वनस्पति सेल की तुलना में कम पानी की सामग्री है और dipicolinic एसिड (डीपीए) 1,2 के साथ समृद्ध है। बीजाणु गठन के दौरान समाचार एजेंसी डीपीए के पानी के बदले में बीजाणु कोर में पंप है। कोर आसपास के एक भीतरी बीजाणु झिल्ली जहां, सबसे बीजाणु के गठन के बैक्टीरिया में, रिसेप्टर्स जो छोटे अणुओं है कि को प्रोत्साहित अंकुरण (germinants) को पहचान 2 स्थित हैं। सिर्फ बीजाणु के भीतर की झिल्ली के बाहर स्थित सेल दीवार पेप्टीडॉग्लीकैन की एक परत है। एक विशेष पेप्टीडॉग्लीकैन परत (कोर्टेक्स) कोशिका दीवार पेप्टीडोग्लायकन चारों ओर से घेरे और कोशिका दीवार पेप्टीडोग्लायकन [बारी एन एसिटाइलग्लूकोसेमाइन (एनएजी) और एन acetylmuramic एसिड (एनएएम)] के रूप में ही घटकों के कई से बना है। हालांकि, कॉर्टेक्स में गुटनिरपेक्ष आंदोलन के अवशेष का लगभग 50% muramic-δ लस्टम 5,6 करने के लिए परिवर्तित कर दिया गया है 2 की कई परतों है।

अंकुरण की प्रक्रिया को नियंत्रित बीजाणु के गठन बैक्टीरिया के लिए महत्वपूर्ण है। अंकुरण शुरू की है जब germinant रिसेप्टर्स उनके संबंधित germinants 2 के साथ बातचीत। कई बीजाणु के गठन बैक्टीरिया में, इन germinants अमीनो एसिड, शर्करा, न्यूक्लियोटाइड, आयनों या 2 उसके संयोजन कर रहे हैं सी। बेलगाम बीजाणु अंकुरण कुछ पित्त अम्ल, [जैसे, पित्त अम्ल (टीए)] और अमीनो एसिड (जैसे, ग्लाइसिन) 7-10 के संयोजन द्वारा शुरू की है। हालांकि वहाँ सेल्सियस के बीच मतभेद रहे हैं बेलगाम अंकुरण मार्ग और रास्ते में अध्ययन अन्य बीजाणु गठनऐसे बी के रूप में बैक्टीरिया, subtilis, सभी के लिए आम बीजाणु कोर्टेक्स नीचा करने के लिए एक वनस्पति सेल अंकुरित बीजाणु 2,8 से विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए परम आवश्यकता है। कॉर्टेक्स गिरावट (के रूप में कई clostridia में पाया जाता है) या SleC (के रूप में बी subtilis में पाया) SCLEs CwlJ / SleB द्वारा पूरा किया जा सकता है। कॉर्टेक्स हाइड्रोलिसिस सेल की दीवार और बीजाणु पर बाधा कम कर देता है। यह पूर्ण कोर पुनर्जलीकरण, सेलुलर चयापचय 2 के लिए आवश्यक प्रोटीन की कई reactivating में एक आवश्यक कदम के लिए अनुमति देता है।

जब बीजाणुओं उगना, एक चरण अंधेरे राज्य है और इस प्रक्रिया के लिए एक चरण उज्ज्वल राज्य से निष्क्रिय बीजाणु परिवर्तन 600 पर ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) में एक परिवर्तन से मापा जा सकता है एनएम 11। पिछले एक रिपोर्ट से पता चलता है आयुध डिपो में इस बदलाव के बारे में ज्यादा बीजाणु 12 से डीपीए की रिहाई के लिए कारण है कि। हमारे हाल के एक अध्ययन के दौरान, हम सी के समय की तुलना करने की मांग बेलगाम बीजाणु अंकुरण और निगरानीसमाचार एजेंसी डीपीए और कोर्टेक्स टुकड़े 9 की रिहाई। इस अध्ययन के लिए यह कोर्टेक्स टुकड़े की रिहाई पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण था, क्योंकि वे बीजाणुओं germinating द्वारा जारी किया जाने लगा।

वर्णमिति यहां इस्तेमाल किया परख कम करने के साथ समाप्त होता है शर्करा का पता लगाने के लिए एक विधि पर आधारित था Ghuysen एट अल। 13 विकसित की है। क्योंकि दूसरों शर्करा को कम करने 14 का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया है या उन प्रोटोकॉल 15 को संशोधित किया है, इस विषय पर साहित्य भ्रमित किया जा सकता है। इधर, विस्तार शर्करा को कम करने के वर्णमिति पता लगाने सी germinating से मुक्ति के लिए एक कदम-दर-कदम विधि हम बेलगाम बीजाणुओं। हालांकि इस अध्ययन सी का उपयोग करता है बेलगाम बीजाणुओं को कम करने, शर्करा अन्य बीजाणु के गठन बैक्टीरिया से बीजाणुओं के अंकुरण के दौरान जारी इस प्रोटोकॉल 9,16,17 साथ पता लगाया जा करने में सक्षम हैं।

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Protocol

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1. उत्पन्न नमूने

  1. हीट सी सक्रिय बेलगाम 30 मिनट और बर्फ पर दुकान के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर बीजाणुओं।
    नोट: सी बेलगाम बीजाणुओं का उत्पादन किया जा सकता है और शुद्ध रूप में पहले से 7,9,10 का वर्णन किया।
  2. एक्स + 1 मिलीलीटर जहां एक्स नमूनों की संख्या परख के दौरान लिया जा रहा है पर अंकुरण समाधान तैयार है।
    नोट: करने के लिए बैक्टीरिया की प्रजातियों का अध्ययन किया जा रहा है बीजाणु अंकुरण समाधान विशिष्ट है। सी परख करने की क्रिया के लिए बेलगाम बीजाणु अंकुरण, हम 10 मिमी Tris (7.5 पीएच), 150 मिमी NaCl, 100 मिमी और 10 मिमी ग्लाइसिन विआयनीकृत पानी में पित्त अम्ल का एक समाधान का इस्तेमाल किया।
  3. परख शुरू करने से पहले, बीजाणुओं के बिना अंकुरण समाधान का एक 1.0 मिलीलीटर नमूना आकर्षित कोर्टेक्स टुकड़ा का पता लगाने के लिए एक खाली के रूप में काम करने के लिए।
  4. एक आयुध डिपो ~ जल्दी से 3.0 अंकुरण समाधान और भंवर के 600 बीजाणुओं जोड़ें।
    नोट: बी में हमारे अंकुरण के अध्ययन के लिए subtilis, हम एक ही ओवर ड्राफ्ट का इस्तेमाल किया 6सी के लिए के रूप में 00 बीजाणुओं बेलगाम।
    नोट: बीजाणुओं की यह राशि सी दौरान निगरानी कोर्टेक्स टुकड़ा जारी करने के लिए अच्छी तरह से काम बेलगाम बीजाणु अंकुरण। इस परख में इस्तेमाल बीजाणुओं की राशि प्रत्येक जीवाणु या तनाव के लिए प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए।
  5. तुरंत 14,000 × छ पर 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बीजाणुओं और सेंट्रीफ्यूज जोड़ने के बाद एक 1.2 मिलीलीटर नमूना निकालें। यह शून्य समय बिंदु है।
  6. बाद में कोर्टेक्स टुकड़ा विश्लेषण के लिए एक ताजा ट्यूब centrifuged नमूना से सतह पर तैरनेवाला के 1.0 मिलीलीटर स्थानांतरण।
    नोट: डीपीए नजर रखी जा करने की जरूरत है, समाधान टर्बियम प्रतिदीप्ति 9,18,19 के आधार पर एक परख का उपयोग करने में डीपीए का पता लगाने के लिए एक अलग से 100 μl नमूना हटा दें।
  7. -80 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र नमूना रुक।
  8. हर समय अंक पूरा जब तक दोहराएँ 1.4 और 1.5 कदम नियमित अंतराल पर।
    नोट: समय की centrifugation और नमूने, समय अंक कम वीं के लिए की आवश्यकता है क्योंकिएक 2 मिनट के अलावा हमारे प्रक्रिया के दौरान संभव नहीं थे, इसलिए हमारे नमूना अंतराल में एक बार 14 मिनट के लिए हर 2 मिनट थे।
  9. 0, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500, और 5000: चीनी का पता लगाने और मात्रा का ठहराव कम करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एन -acetylglucosamine (nmol) की निम्न मात्रा में शामिल हैं। कोर्टेक्स नमूने के रूप में एक ही समय में इन नमूनों को तैयार है और कोर्टेक्स नमूने के साथ चलाने के लिए इतना है कि मानक वक्र बीजाणुओं germinating द्वारा उत्पन्न डेटा के लिए प्रासंगिक है।
  10. के बाद सभी समय बिंदु के नमूने एकत्र कर रहे हैं, नमूने lyophilize।
    नोट: हम 2 मिलीलीटर पेंच टोपी ट्यूबों में हमारे नमूने lyophilized।

2. कॉर्टेक्स टुकड़े मापने

  1. 3 एन एचसीएल के 120 μl 1% फिनोल और 0.5% β-mercaptoethanol के साथ पूरक में lyophilized नमूने Resuspend।
  2. 2 मिलीलीटर पेंच टोपी ट्यूबों के लिए resuspended नमूने स्थानांतरण।
    नोट: reproducibility के लिए, सुनिश्चित करें कि सभी lyophilized नमूना resuspended और स्थानांतरित किया है।
  3. <li> 4 घंटे के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक recirculating नहाने के पानी में नमूने सेते हैं।
  4. ऊष्मायन के बाद, जब तक वे अच्छा कर रहे हैं बर्फ पर नमूने रखें।
  5. 3 एम NaOH के 120 μl के साथ नमूने बेअसर।
  6. एक संतृप्त सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान के 80 μl और प्रत्येक नमूना और भंवर के लिए एक 5% एसिटिक एनहाइड्राइड समाधान के 80 μl जोड़ें।
  7. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने सेते हैं।
  8. नमूने बिल्कुल 3 मिनट के लिए वापस 95 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान करने के लिए स्थानांतरण।
    नोट: यह कदम समय संवेदनशील और अब समय नीचे की ओर संकेत विकास को प्रभावित कर सकता है।
  9. नहाने के पानी के नमूनों से निकालें और बर्फ पर शांत।
  10. प्रत्येक ट्यूब और भंवर को 6.54% कश्मीर 2 बी 4 हे 7 · 4H 2 ओ के 400 μl जोड़ें।
  11. वास्तव में 7 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक recirculating नहाने के पानी में नमूने सेते हैं।
    नोट: यह कदम समय संवेदनशील और अब समय नीचे की ओर संकेत विकास को प्रभावित कर सकता है।
  12. हटानानमूने और 5 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है।

3. रंग अभिकर्मक

  1. जबकि नमूने बर्फ (चरण 2.12) पर कर रहे हैं, रंग अभिकर्मक तैयार करते हैं। हिमनदों एसिटिक एसिड के 1.9 मिलीलीटर में, (Ehrlich अभिकर्मक DMAB) पी -dimethylaminobenzaldehyde की 0.320 ग्राम भंग।
    नोट: अभिकर्मक समय, तापमान और प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और अग्रिम में नहीं किया जाना चाहिए।
  2. बाद DMAB पूरी तरह घुल, 10 एन एचसीएल और भंवर के 100 μl जोड़ें।
  3. हिमनदों एसिटिक एसिड और भंवर के 5 मिलीलीटर जोड़ें।

4. Colorimetric रिएक्शन

  1. स्थानांतरण प्रत्येक के 100 μl एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब कोर्टेक्स नमूना ठंडा।
  2. प्रत्येक नमूने के हौसले से तैयार रंग समाधान के 700 μl जोड़ें।
  3. इसके तत्काल बाद एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान के लिए नमूने हस्तांतरण और ठीक 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. एक स्पष्ट 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए प्रत्येक नमूने की 200 μl स्थानांतरण।
  5. एक थाली पर 585 एनएम पर नमूने योंपाठक। नमूने एक पीले रंग से शुरू कर देना चाहिए और एक सकारात्मक प्रतिक्रिया बैंगनी में बदलाव होगा। अधिक कोर्टेक्स मौजूद है, गहरे बैंगनी रंग।

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Representative Results

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तालिका 1 नाग मानकों का प्रयोग ठेठ परिणाम दिखाता है। डेटा एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। तालिका 2 अंकुरण बफर में एक अंकुरण परख 100 मिमी और 10 मिमी ग्लाइसिन प्रादेशिक सेना (अंकुरण को बढ़ावा देने की स्थिति) या 100 मिमी ग्लाइसिन केवल (गैर germinating की स्थिति) के साथ पूरक से ठेठ परिणाम दिखाता है। टीए, सी के अभाव में बेलगाम बीजाणुओं उगना नहीं है और समाधान में कोर्टेक्स टुकड़े की उपस्थिति में थोड़ा परिवर्तन होता है। हालांकि, दोनों टीए और ग्लाइसिन, सी की मौजूदगी में बेलगाम बीजाणुओं उगना और समाधान में कोर्टेक्स टुकड़े जारी। यह प्रतिक्रिया व्यक्त की नमूनों की समय के साथ आयुध डिपो 585 में वृद्धि के रूप में मनाया जाता है। कोर्टेक्स टुकड़े (nmol) इस परख के दौरान जारी की कुल राशि 1 बी चित्रा के समान एक मानक वक्र उपयोग कर की गणना की गई थी। इस परख में, कॉर्टेक्स का सबसे hydrolyzed है (या जारी) 15 मिनट के बाद सेgerminant जोखिम, सुझाव है कि बीजाणुओं का सबसे इस समय सीमा में अंकुरित है (चित्रा 2, एक पिछले प्रकाशन 7 के साथ संगत)।

रंग अभिकर्मक में नमूने के विकास के बाद, ज्यादातर नमूने नग्न आंखों के लिए बैंगनी रंग नहीं दिखा सकते हैं। चित्रा 1 एन एसिटाइलग्लूकोसेमाइन से उत्पन्न एक प्रतिनिधि नमूना दिखाता है। नमूनों में से कई एक दृश्य बैंगनी रंग नहीं दिखा है। हालांकि, 250 nmol, 500 nmol और 5000 nmol नमूने नकारात्मक नियंत्रण (0 nmol) से नेत्रहीन अलग दिखाई देते हैं। जब आयुध डिपो 585 एनएम पर मापा जाता है, संकेत उत्पन्न सबसे अच्छा एक रेखीय प्रतिगमन (2 आर = 0.999) फिट बैठता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। पता लगाने एन एसिटाइलग्लूकोसेमाइन (ए) एन-एसिटाइलग्लूकोसेमाइन नमूने (0 nmol, 12.5 nmol,25 nmol, 50 nmol, 100 nmol, 250 nmol, 500 nmol, 5000 nmol) lyophilized और वर्णित प्रक्रिया के अनुसार प्रतिक्रिया व्यक्त कर रहे थे। (बी) नमूने एक 96 अच्छी तरह से थाली और 585 एनएम का पता चला प्रतिक्रिया व्यक्त की सामग्री की राशि के लिए जोड़ा गया था। संकेत एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। चित्र 2
चित्रा 2:। के अंकुरण के लिए परिणाम ग्राफिकल प्रतिनिधित्व तालिका 2 में गणना nmol कोर्टेक्स बनाम समय की साजिश रची गई थी। (●) 100 मिमी ग्लाइसिन + 10 मिमी टीए; (■) 100 मिमी ग्लाइसिन। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

एनएजी एकाग्रता (nmol) आयुध डिपो के 585
0 0.047
12.5 0.054
25 0.066
50 0.084
100 0.128
250 0.285
500 0.556
5000 4.0
खाली = 0.046

तालिका 1: नाग मानक।

क्लोस्ट्रीडियम बेलगाम बीजाणु अंकुरण
अंकुरण समाधान (10 मिमी Tris (पीएच 7.5), 150 मिमी NaCl)
100 मिमी ग्लाइसिन + 10 मिमी टीए 100 मिमी ग्लाइसिन
समय (मिनट) आयुध डिपो के 585 परिकलित (nmol) आयुध डिपो के 585 परिकलित (nmol)
0 0.046 0.00 0.047 0.00
2 0.048 2.54 0.048 1.27
4 0.05 5.07 0.049 2.54
6 0.055 11.41 0.05 3.80
8 0.059 16.49 0.05 3.80
10 0.06 17.76 0.051 5.07
12 0.061 19.02 0.05 3.80
14 0.063 21.56 0.051 5.07

तालिका 2: नमूना बीजाणु Germinatiपरिणाम पर।

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Discussion

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उत्तेजना पर, अंकुरण की प्रक्रिया के दौर से गुजर बीजाणुओं macromolecular संश्लेषण के लिए आवश्यकता के बिना उनके प्रतिरोध गुण खो देते हैं। जब बीजाणु अंकुरण शुरू हो रहा है, बीजाणु कोर पानी 2 के लिए विदेशी मुद्रा में डीपीए विज्ञप्ति। निष्क्रिय बीजाणु के उच्च डीपीए सामग्री के कारण, बीजाणु कोर तीव्र आसमाटिक दबाव और विशेष पेप्टीडॉग्लीकैन, कोर्टेक्स के अधीन है, अभिनय, मुमकिन है, विस्तार 2 के लिए एक बाधा के रूप में सूजन से कोर को रोकने में मदद करता है।

ऊपर वर्णित विधि एक बैंगनी रंग के लिए एक औसत दर्जे का बदलाव के रूप में शर्करा को कम करने की मौजूदगी का पता लगाने के लिए Ehrlich के अभिकर्मक (एक पीला समाधान) का उपयोग करता है। कोर्टेक्स हाइड्रोलिसिस के दौरान, नाग और गुटनिरपेक्ष आंदोलन शक्कर मुक्त कर रहे हैं (hydrolyzing एंजाइमों की हद पर निर्भर करता है, शर्करा डिसैक्राइड या polysaccharides के रूप में मुक्त कराया जा सकता है)। एचसीएल (2.1 कदम) द्वारा glycosidic लिंकेज की hydrolysis मुक्त कम करने के सिरों 7 के साथ monosaccharides उत्पन्न करता है। neutraliz के बादसोडियम हाइड्रॉक्साइड के बराबर राशि (2.5 कदम) के साथ एसिड हैैं, नाग आसपास एल्कोहल और गुटनिरपेक्ष आंदोलन monosaccharides एसिटिक एनहाइड्राइड द्वारा acylated कर रहे हैं (2.6 चरण) 13। बाद में, unreacted एसिटिक एनहाइड्राइड नमूना (चरण 2.8) हीटिंग द्वारा एसिटिक एसिड में बदल जाती है। मॉर्गन और Elson 20 से धारणा के रूप में, टर्मिनल एल्डिहाइड अनायास Enol प्रपत्र को बदल देता है। क्षारीय शर्तों (2.10 कदम) के तहत, इस Enol प्रपत्र आसन्न एसिटाइल के साथ प्रतिक्रिया एक oxazole व्युत्पन्न जो Ehrlich के अभिकर्मक (4.3 चरण) एक बैंगनी रंग 15,20 उत्पन्न करने के साथ प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए कर सकते हैं।

इस विधि ऊपर वर्णित है, बीजाणुओं germinating से कोर्टेक्स टुकड़े का पता लगाने के लिए लगातार, विश्वसनीय परिणाम पैदावार दोनों बी subtilis और सी बेलगाम 9,16,17। परख प्रतिक्रिया समय, तापमान और प्रक्रियाओं परिशुद्धता के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है। उचित ध्यान के बिनाविस्तार करने के लिए, यह प्रतिक्रिया की स्थिति असफल या नहीं करने के लिए प्रयोगों 13 के बीच पुन: पेश आसान है। हालांकि, प्रयोगशाला वातावरण के बीच परख के आवेदन में एक नाग मानक एड्स का समावेश है। एनएजी सकारात्मक नियंत्रण मानक किसी भी अंतर-प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता (जैसे, प्रतिक्रिया समय में मामूली बदलाव या रंग अभिकर्मक की प्रभावशीलता) के लिए हर प्रयोग नियंत्रण में शामिल थे। केवल बफर की स्थिति और कोर्टेक्स दोनों hydrolyzing के काबिल नहीं बीजाणुओं के साथ प्रतिक्रियाओं का उपयोग कर प्रतिक्रियाओं रंग में कोई परिवर्तन नहीं झुकेंगे।

इस विधि के साथ सबसे आम समस्या अंतर-प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता या संकेत के पूर्ण अभाव है। परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रित करने के लिए, बीजाणु तैयारियों किसी भी वनस्पति सेल मलबे से मुक्त होना चाहिए। यह सेल मलबे पेप्टीडॉग्लीकैन टुकड़े (नाग और गुटनिरपेक्ष आंदोलन) में शामिल होंगे और germinating बीजाणुओं के लिए एक उच्च पृष्ठभूमि संकेत में परिणाम होगा। एक शुद्ध बीजाणु तैयारी (> 99.9% बीजाणुओं) यह सुनिश्चित करने के लिए, literatu करने के लिए देखेंतरीकों जीव में शुद्ध बीजाणु निलंबन को तैयार करने के लिए फिर से 7,9,21-23 अध्ययन किया जा सके।

परख किसी भी detectable संकेत उपज नहीं है, तो हम ने कहा कि lyophilizing कदम परिवर्तनशीलता मिलवा सकता है। बल के साथ जो निर्वात जारी की है के कारण, हम ने कहा कि सूखे नमूना पाउडर नमूना ट्यूब से बाहर उड़ा दिया जा सकता है। को कम करने के लिए / होने से रोकने, नमूना ट्यूबों के सबसे ऊपर में छेद प्रहार करने के लिए एक छोटी सी सुई सिरिंज का उपयोग करें। शुरू की छेद के छोटे से क्षेत्र से परेशान किया जा रहा है (अब पाउडर के रूप में) lyophilized नमूने की संभावना कम हो जाएगा। अंत में, जैसा कि ऊपर तरीकों में उल्लेख किया, कई ऊष्मायन कदम बहुत समय के प्रति संवेदनशील हैं। सुनिश्चित करें कि सभी समय पर कदम सावधानी से निगरानी कर रहे हैं। इस परख के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है कि कोर्टेक्स के टुकड़े का पता लगाया जा क्रम में germinating बीजाणु से रिहा किया जाना चाहिए। कोर्टेक्स बड़े टुकड़ों में hydrolyzed है, तो इन टुकड़ों भी rele होने के लिए बड़ा हो सकता हैबीजाणु कोट के माध्यम से ased। हालांकि एक महत्वपूर्ण विचार जब एक प्रयोग है कि एक संकेत उपज नहीं है समस्या निवारण, हम इस बात की पुष्टि करने से पहले में एक संभावित समस्या के रूप में कोर्टेक्स टुकड़ा आकार पर विचार करने के लिए है कि परिस्थितियों के समाधान में बीजाणुओं और यहाँ सूचीबद्ध अन्य समस्या निवारण विकल्पों में से सबसे उगना करने के लिए इस्तेमाल की सिफारिश परख।

नहीं सभी अंकुरण बफ़र्स / शर्तें इस परख के लिए उपयुक्त हैं। क्योंकि इस परख अंकुरण प्रक्रिया 13, किसी भी अंकुरण बफर शक्कर या किसी germinant कि है, अपने आप में एक कम करने शुगर को कम करने में शामिल है कि के दौरान मुक्त कराया शर्करा को कम करने की उपस्थिति का पता लगाता है (जैसे, ग्लूकोज) इस परख में एक मजबूत संकेत में परिणाम होगा। यदि यह मामला है, उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) कोर्टेक्स टुकड़े 24-26 की उपस्थिति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, क्योंकि सभी प्रयोगशालाओं में इस तरह के उपकरण के साथ लैस कर रहे हैं, साथ साथ वर्णित विधि सबसे द्वारा इस्तेमाल किया जा सकताप्रयोगशालाओं और सरल और आसानी से मात्रात्मक परिणाम प्रदान करता है।

बैक्टीरियल बीजाणुओं से अंकुरण काफी हद तक बेसिलस और कुछ क्लोस्ट्रीडियम प्रजातियों 2,8 में अध्ययन किया गया है। प्रक्रिया आम तौर पर संरक्षित है हालांकि मतभेद मौजूद हैं। महत्वपूर्ण बात है, नहीं सभी जीवों के रूप में मॉडल बीजाणु-formers 9,27 में मनाया बीजाणु अंकुरण के तंत्र का उपयोग कर उगना। क्योंकि अंकुरण और अधिक विविध जीवों में अध्ययन किया जा रहा है, परख ऊपर वर्णित बीजाणु अंकुरण के दौरान कोर्टेक्स के टुकड़े का पता लगाने के लिए इन जीवों के लिए लागू किया जा सकता है। इन नव अध्ययन जीवों के लिए इस पद्धति को लागू करके, शोधकर्ताओं भूमिका कोर्टेक्स हाइड्रोलिसिस में विभिन्न अंकुरण प्रोटीन खेलने का निर्धारण कर सकते हैं।

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Acknowledgments

परियोजना वर्णित एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान से पुरस्कार संख्या 5R01AI116895 द्वारा समर्थित है। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी और संक्रामक रोगों या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 ml screw cap tube USA scientific 1420-3700
p1000 Eppendorf pipet Eppendorf
p200 Eppendorf pipet Eppendorf
p20 Eppendorf pipet Eppendorf
100 - 1,250 μl pipet tips VWR 89079-486
1 - 200 μll pipet tips VWR 89079-458
N-acetyl-D-glucosamine Sigma A3286-25G
Hydrochloric Acid - 10 N BDH-Aristar BDH3032-3.8LP
Acetic Anhydride Alfa Aesar L04295
Sodium Bicarbonate BDH BDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrate Alfa Aesar 39435
Sodium Hydroxide BDH BDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehyde Sigma 156477-100G
Saturated Phenol Fisher BP1750-400
2-Mercaptoethanol Aldrich M6250-100ML
SpectraMax M3 Molecular Devices
Acetic Acid, Glacial BDH BDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water Bath VWR Scientific Model 1136
Microtest 96 Falcon 353072 96 well clear tissue culture plates
Culture tubes VWR 89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine

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References

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Francis, M. B., Sorg, J. A. Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination. J. Vis. Exp. (112), e54146, doi:10.3791/54146 (2016).More

Francis, M. B., Sorg, J. A. Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination. J. Vis. Exp. (112), e54146, doi:10.3791/54146 (2016).

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