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Immunology and Infection

La detección de la corteza Fragmentos Durante la germinación de esporas bacterianas

doi: 10.3791/54146 Published: June 25, 2016

Introduction

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Las endosporas son metabólicamente inactivos formas de bacterias que permiten a las bacterias persisten en ambientes desfavorables. En muchas bacterias formadoras de esporas, la formación de esporas es inducida por la privación de nutrientes, pero este proceso puede ser controlado por los cambios en pH, la exposición a oxígeno o otros factores de estrés 1. Si bien en su forma de esporas metabólicamente inactivos, las bacterias se resisten a la radiación UV, desecación, temperaturas más altas, y la congelación de 2. La mayor parte del conocimiento sobre el proceso de esporulación proviene de estudios en el organismo modelo, Bacillus subtilis. El proceso de esporulación comienza con la replicación del ADN y la formación de un 3,4 filamento axial. Un tabique asimétrico luego se divide la célula en dos compartimientos de tamaño desigual. El compartimiento más grande, la célula madre, envuelve el compartimento más pequeño, el preespora. Tanto la célula madre y preespora coordinar la expresión de genes para madurar la espora y la célula madre, finalmente, lisa, de soltar el Dormant de esporas en el medio ambiente que rodea 1.

La estructura y composición de esporas se conserva en muchas especies bacterianas. El núcleo de esporas tiene un contenido de agua inferior a la célula vegetativa y es rica en ácido dipicolínico (DPA) 1,2. Durante la formación de esporas, DPA se bombea en el núcleo de esporas a cambio de agua. Que rodea el núcleo es una membrana de esporas interior donde, en la mayoría de las bacterias formadoras de esporas, los receptores que reconocen las pequeñas moléculas que estimulan la germinación de semillas en germinación (2) se encuentran. Situado a las afueras de la membrana interior de la espora es una capa de peptidoglicano de la pared celular. Una capa de peptidoglicano especializada (corteza) rodea el peptidoglicano de la pared celular y se compone de muchos de los mismos componentes que el peptidoglicano de la pared celular [alternando N-acetilglucosamina (NAG) y ácido N-acetilmurámico (NAM)]. Sin embargo, aproximadamente 50% de los residuos NAM en la corteza se han convertido a murámico-δ-lactama 5,6 2.

Controlar el proceso de germinación es de importancia crítica para las bacterias formadoras de esporas. La germinación se inicia cuando los receptores germinantes interactúan con sus respectivos semillas en germinación 2. En muchas bacterias formadoras de esporas, estas semillas en germinación son aminoácidos, azúcares, nucleótidos, iones o combinaciones de los mismos 2. C. difficile germinación de las esporas es iniciado por combinaciones de ciertos ácidos biliares, [por ejemplo, ácido taurocólico (TA)] y aminoácidos (por ejemplo, glicina) 7-10. Aunque hay diferencias entre el C. vía la germinación difficile y las vías estudiadas en otra forma esporasbacterias, tales como B. subtilis, común a todos es el requisito absoluto para degradar la corteza de esporas para permitir que una célula vegetativa a crecer a partir de la espora germinada 2,8. La degradación de la corteza se puede lograr por el SCLEs CwlJ / SleB (como se encuentra en B. subtilis) o SLEC (como se encuentra en muchos Clostridia). hidrólisis de la corteza reduce la restricción en la pared celular y la espora. Esto permite una rehidratación completa del núcleo, un paso necesario en la reactivación de muchas de las proteínas necesarias para el metabolismo celular 2.

Cuando las esporas germinan, los cambios de esporas inactivas de un estado de fase-brillante a un estado de fase-oscuro y este proceso se pueden medir por un cambio en la densidad óptica (DO) a 600 11 nm. Un informe anterior sugiere que gran parte de este cambio en OD es debido a la liberación de la DPA de la espora 12. Durante nuestra reciente estudio, hemos tratado de comparar el tiempo de C. difficile germinación de esporas y seguimiento de laliberación de la DPA y la corteza fragmentos 9. Para este estudio era fundamental para controlar la liberación de fragmentos de la corteza, ya que comenzó a ser liberado por la germinación de las esporas.

El ensayo colorimétrico se utiliza aquí se basa en un método para la detección de azúcares reductores con extremos desarrollaron Ghuysen et al. 13. Debido a que otros han descrito protocolos para la detección de azúcares reductores 14 o han modificado los protocolos 15, la literatura sobre este tema puede ser confuso. Aquí, un método paso a paso que detalle para la detección colorimétrica de azúcares reductores liberados de la germinación de C. esporas difficile. Aunque este estudio utiliza C. esporas difficile, los azúcares reductores liberados durante la germinación de esporas de otras bacterias formadoras de esporas son capaces de ser detectadas con este protocolo 9,16,17.

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Protocol

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1. Las muestras de generación

  1. El calor activa C. difficile esporas a 65 ° C durante 30 minutos y almacenar en hielo.
    Nota: C. esporas difficile pueden ser producidos y purificados como se ha descrito previamente 7,9,10.
  2. Preparar la solución de germinación a X + 1 ml donde X es el número de muestras que deben tomarse durante el ensayo.
    Nota: La solución de la germinación es específico de las especies de bacterias de esporas que se estudian. Para el ensayo de C. difficile germinación de esporas, se utilizó una solución de Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, glicina 100 mM y 10 mM de ácido taurocólico en agua desionizada.
  3. Antes de comenzar el ensayo, extraer una muestra de la solución de germinación 1,0 ml sin esporas para servir como un espacio en blanco para la detección fragmento de corteza.
  4. Añadir esporas a un OD 600 de ~ 3,0 a la solución de la germinación y el vórtice rápidamente.
    Nota: Para nuestros estudios de germinación en B. subtilis, se utilizó la misma OD 600 esporas como para C. difficile.
    Nota: Esta cantidad de esporas funcionó bien para la liberación fragmento de la corteza durante el seguimiento C. germinación de las esporas difficile. La cantidad de esporas utilizada en este ensayo se debe determinar experimentalmente para cada bacteria o cepa.
  5. Extraer una muestra 1,2 ml inmediatamente después de la adición de las esporas y se centrifuga a temperatura ambiente durante 1 min a 14.000 x g. Este es el punto de tiempo cero.
  6. Transferir 1,0 ml del sobrenadante de la muestra centrifugada a un tubo nuevo para el análisis de fragmento de corteza posterior.
    Nota: En caso de DPA deben ser supervisados, retirar una muestra de 100 l separada para la detección de DPA en la solución utilizando un ensayo basado en fluorescencia terbio 9,18,19.
  7. Congelar la muestra recogida a -80 ° C.
  8. Repita los pasos 1.4 y 1.5, a intervalos regulares hasta que todos los puntos de tiempo completadas.
    Nota: Debido al tiempo requerido para la centrifugación y el muestreo, menos puntos de tiempo THun 2 min aparte no fuera posible durante nuestro procedimiento, por lo que nuestros intervalos de muestreo fueron una vez cada 2 min durante 14 min.
  9. Como control positivo para la reducción de la detección de azúcar y la cuantificación, incluyen las siguientes cantidades de N acetilglucosamina (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500, y 5000. Preparar estas muestras al mismo tiempo que las muestras de la corteza y de gestión junto con las muestras de la corteza de manera que la curva estándar es relevante para los datos generados por la germinación de esporas.
  10. Después se recogen todas las muestras puntuales tiempo, liofilizar las muestras.
    Nota: Nos liofilizado nuestras muestras en tubos de 2 ml con tapón de rosca.

2. Medición de la corteza Fragmentos

  1. Resuspender muestras liofilizadas en 120 l de HCl 3 N suplementado con 1% de fenol y 0,5% β-mercaptoetanol.
  2. La transferencia de las muestras resuspendidas a 2 ml tubos con tapa de rosca.
    Nota: Para la reproducibilidad, garantizan toda la muestra liofilizada se suspende de nuevo y se transfiere.
  3. <li> Incubar las muestras en un baño de agua de recirculación a 95 ° C durante 4 horas.
  4. Después de la incubación, colocar las muestras en hielo hasta que se hayan enfriado.
  5. Neutralizar las muestras con 120 l de NaOH 3 M.
  6. Añadir 80 l de una solución saturada de bicarbonato sódico y 80 l de una solución de anhídrido acético al 5% a cada muestra y vórtice.
  7. Se incuban las muestras a temperatura ambiente durante 10 min.
  8. La transferencia de las muestras al baño de agua a 95 ° durante exactamente 3 minutos.
    Nota: Este paso es el tiempo más largos tiempos sensibles y pueden afectar el desarrollo señal descendente.
  9. Extraer muestras del baño de agua y enfriar en hielo.
  10. Añadir 400 l de 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O a cada tubo y vórtice.
  11. Se incuban las muestras en un baño de agua de recirculación a 95 ° C durante exactamente 7 min.
    Nota: Este paso es el tiempo más largos tiempos sensibles y pueden afectar el desarrollo señal descendente.
  12. retirarlas muestras y colocar en hielo durante 5 min.

3. Reactivo de color

  1. Mientras que las muestras están en hielo (paso 2,12), preparar el reactivo de color. Disolver 0,320 g de p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; el reactivo de Ehrlich) en 1,9 ml de ácido acético glacial.
    Nota: El reactivo es el tiempo, la temperatura y la sensible a la luz y no debe hacerse por adelantado.
  2. Después de la DMAB se disuelve completamente, añadir 100 l de HCl y agitar 10 N.
  3. Añadir 5 ml de ácido acético glacial y vórtice.

4. Reacción colorimétrica

  1. Transferir 100 l de cada muestra de corteza se enfrió a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Añadir 700 l de la solución de color recién preparada a cada muestra.
  3. Inmediatamente transferir las muestras a un baño de agua a 37 ° e incubar durante exactamente 20 minutos.
  4. Transferir 200 l de cada muestra a una placa de 96 pocillos clara.
  5. Cuantificar las muestras a 585 nm en un platolector. Las muestras deben comenzar en un color amarillo y una reacción positiva se desplazarán a púrpura. La corteza más presente, más profundo es el color púrpura.

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Representative Results

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La Tabla 1 muestra los resultados típicos que usan las normas de NAG. Los datos se utilizan para generar una curva estándar. Tabla 2 muestra los resultados típicos de un ensayo de germinación en tampón de germinación suplementado con glicina 100 mM y TA 10 mM (condiciones de germinación de promoción) o glicina 100 mM sólo (condiciones no de germinación). En ausencia de TA, C. esporas difficile no germinan y hay poco cambio en la presencia de fragmentos de la corteza en la solución. Sin embargo, en la presencia de ambos TA y glicina, C. esporas germinan difficile y liberan fragmentos de la corteza en la solución. Esto se observa como un aumento en el OD 585 con el tiempo de las muestras reaccionado. La cantidad total de fragmentos de corteza (nmol) liberados durante este ensayo se calculó utilizando una curva estándar similar a la figura 1B. En este ensayo, la mayor parte de la corteza se hidroliza (o liberado) por 15 minutos posterioresexposición germinantes, lo que sugiere que la mayoría de las esporas han germinado en este marco de tiempo (Figura 2; consistente con una publicación anterior 7).

Después de desarrollar las muestras en el reactivo de color, la mayoría de las muestras pueden no mostrar el color púrpura a simple vista. La figura 1 muestra una muestra representativa generado a partir de N-acetilglucosamina. Muchas de las muestras no muestran un color púrpura visible. Sin embargo, los 250 nmol, 500 nmol y 5.000 nmol muestras aparecen visualmente diferente del control negativo (0 nmol). Cuando se mide a una DO de 585 nm, la señal generada mejor se ajuste a una regresión lineal (R2 = 0,999).

Figura 1
Figura 1: Detección. N-acetilglucosamina muestras (A) N-acetilglucosamina (0 nmol, 12,5 nmol,25 nmol, 50 nmol, 100 nmol, 250 nmol, 500 nmol, 5000 nmol) se liofilizaron y reaccionar de acuerdo con el procedimiento descrito. Se añadieron (b) las muestras a una placa de 96 pocillos y la cantidad de material reaccionado detectado en 585 nm. La señal se utiliza para generar una curva estándar. Figura 2
Figura 2:. Representación gráfica de los resultados de la germinación La corteza nmol calculada en la Tabla 2 se representó frente al tiempo. (●) mM glicina + 100 mM TA 10; (■) glicina 100 mM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Concentración NAG (nmol) OD 585
0 0,047
12.5 0,054
25 0,066
50 0,084
100 0,128
250 0,285
500 0,556
5,000 4.0
= blanco 0,046

Tabla 1: NAG Standard.

Clostridium difficile germinación de esporas
Solución de germinación (mM Tris 10 (pH 7,5), NaCl 150 mM)
mM Glicina 100 mM + TA 10 La glicina 100 mM
Tiempo (minutos) OD 585 Calculado (nmol) OD 585 Calculado (nmol)
0 0,046 0.00 0,047 0.00
2 0,048 2.54 0,048 1.27
4 0.05 5.07 0,049 2.54
6 0,055 11.41 0.05 3.80
8 0,059 16.49 0.05 3.80
10 0.06 17.76 0,051 5.07
12 0,061 19.02 0.05 3.80
14 0,063 21.56 0,051 5.07

Tabla 2: Ejemplo de Spore Germinatisobre los resultados.

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Discussion

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Tras la estimulación, las esporas se someten el proceso de germinación pierden sus propiedades de resistencia sin la necesidad de la síntesis macromolecular. Cuando se activa la germinación de esporas, el núcleo de esporas de prensa DPA, a cambio de agua 2. Debido al alto contenido de DPA de la espora latente, el núcleo de esporas está bajo presión osmótica intenso y el peptidoglicano especializada, corteza, ayuda a prevenir el núcleo de la hinchazón actuando, presumiblemente, como una barrera a la expansión 2.

El método descrito anteriormente utiliza el reactivo de Ehrlich (una solución amarilla) para detectar la presencia de azúcares reductores como un cambio medible a un tinte púrpura. Durante la hidrólisis corteza, NAG y NAM azúcares se liberan (dependiendo de la extensión de las enzimas que hidrolizan, los azúcares pueden liberarse como disacáridos o polisacáridos). La hidrólisis de los enlaces glucosídicos por HCl (Paso 2.1) genera monosacáridos con extremos reductores libres 7. después neutralizing del ácido con una cantidad igual de hidróxido de sodio (paso 2.5), los alcoholes que rodean la NAG y monosacáridos NAM están acilados por anhídrido acético (Paso 2.6) 13. Posteriormente, anhídrido acético sin reaccionar se convierte en ácido acético por calentamiento de la muestra (paso 2.8). Como hipótesis por Morgan y Elson 20, el aldehído terminal de convierte espontáneamente a la forma enol. En condiciones alcalinas (paso 2,10), esta forma enol puede reaccionar con la acetil adyacente para generar un derivado de oxazol que reacciona con el reactivo de Ehrlich (Paso 4.3) para generar un color púrpura 15,20.

Este método se ha descrito anteriormente produce resultados consistentes y fiables para la detección de fragmentos de la corteza de la germinación de las esporas, tanto B. subtilis y C. difficile 9,16,17. El ensayo requiere especial atención para asegurar la reacción tiempos, temperaturas y procedimientos se realizan con precisión. Sin la debida atenciónal detalle, es fácil para las condiciones de reacción que fallen o no reproducir entre los experimentos 13. Sin embargo, la inclusión de un NAG ayudas estándar en la aplicación del ensayo entre los entornos de laboratorio. El estándar de control positivo NAG incluido en cada experimento controles para cualquier variabilidad inter-experimental (por ejemplo, ligeras variaciones en los tiempos de reacción o la eficacia del reactivo de color). Las reacciones que utilizan sólo las condiciones del tampón y reacciones con esporas incapaces de hidrolizar tanto corteza dado ningún cambio en el color.

El problema más común con este método es la variabilidad inter-experimental o completa falta de señal. Para el control de la variabilidad, las preparaciones de esporas deben estar libres de cualquier residuo célula vegetativa. Esta restos celulares contendrá fragmentos de peptidoglicano (NAG y NAM) y dará lugar a una alta señal de fondo de las esporas germinan. Para asegurar una preparación de esporas puro (> 99,9% esporas), consulte la Literature para los métodos para preparar suspensiones de esporas puras en el organismo a estudiar 7,9,21-23.

Si el ensayo no está dando ninguna señal detectable, se observó que la etapa de liofilización puede introducir variabilidad. Debido a la fuerza con la que se libera el vacío, se observó que el polvo de la muestra seca puede ser soplado hacia fuera del tubo de muestra. Para reducir / evitar que esto ocurra, utilice una pequeña aguja de la jeringa para hacer agujeros en la parte superior de los tubos de muestra. La pequeña área de los agujeros introducidos reducirá la probabilidad de la muestra liofilizada (ahora en forma de polvo) de ser molestado. Por último, como se indica en los métodos anteriores, los varios pasos de incubación son muy sensibles al tiempo. Asegúrese de que todos los pasos cronometrados son monitoreados cuidadosamente. Una consideración importante para este ensayo es que los fragmentos de la corteza debe ser liberado de la espora de germinación a fin de ser detectado. Si la corteza se hidroliza en grandes fragmentos, estos fragmentos pueden ser demasiado grandes para ser releobre la base a través de la capa de la espora. Aunque una consideración importante para solucionar problemas de un experimento que no produce una señal, se recomienda confirmar que las condiciones utilizadas para germinar la mayor parte de las esporas en la solución y las otras opciones de solución de problemas enumerados aquí antes de considerar el tamaño del fragmento corteza como un problema potencial en el ensayo.

No todos los buffers de germinación / condiciones son adecuadas para este ensayo. Debido a que este ensayo detecta la presencia de azúcares reductores liberados durante el proceso de germinación 13, cualquier tampón germinación que contiene azúcares reductores o cualquier germinantes que es, en sí, un azúcar reductor (por ejemplo, glucosa) dará lugar a una fuerte señal en este ensayo. Si este es el caso, la cromatografía líquida de alta presión (HPLC) se puede utilizar para detectar la presencia de fragmentos de la corteza 24-26. Sin embargo, porque no todos los laboratorios están equipados con tales instrumentación, el método descrito en este documento puede ser utilizado por la mayoríalaboratorios y ofrece resultados simples y fácilmente cuantificables.

La germinación de las esporas bacterianas en gran medida se ha estudiado en Bacillus y unas pocas especies de Clostridium 2,8. El proceso generalmente se conserva, sin embargo, existen diferencias. Es importante destacar que no todos los organismos germinan utilizando los mecanismos de la germinación de esporas como se observa en el modelo de formadores de esporas 9,27. Debido a la germinación se está estudió en más diversos organismos, el ensayo descrito anteriormente se puede aplicar a estos organismos para detectar fragmentos de la corteza durante la germinación de esporas. Mediante la aplicación de este método para estos organismos estudiados recientemente, los investigadores pueden determinar el papel de las proteínas juegan varios de germinación en la hidrólisis de la corteza.

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Acknowledgments

El proyecto descrito es apoyado por el premio número 5R01AI116895 del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas o los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 ml screw cap tube USA scientific 1420-3700
p1000 Eppendorf pipet Eppendorf
p200 Eppendorf pipet Eppendorf
p20 Eppendorf pipet Eppendorf
100 - 1,250 μl pipet tips VWR 89079-486
1 - 200 μll pipet tips VWR 89079-458
N-acetyl-D-glucosamine Sigma A3286-25G
Hydrochloric Acid - 10 N BDH-Aristar BDH3032-3.8LP
Acetic Anhydride Alfa Aesar L04295
Sodium Bicarbonate BDH BDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrate Alfa Aesar 39435
Sodium Hydroxide BDH BDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehyde Sigma 156477-100G
Saturated Phenol Fisher BP1750-400
2-Mercaptoethanol Aldrich M6250-100ML
SpectraMax M3 Molecular Devices
Acetic Acid, Glacial BDH BDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water Bath VWR Scientific Model 1136
Microtest 96 Falcon 353072 96 well clear tissue culture plates
Culture tubes VWR 89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine

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References

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La detección de la corteza Fragmentos Durante la germinación de esporas bacterianas
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Francis, M. B., Sorg, J. A. Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination. J. Vis. Exp. (112), e54146, doi:10.3791/54146 (2016).More

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