Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bakteriyel Spor Filizlenmesinin sırasında Cortex Fragments algılama

doi: 10.3791/54146 Published: June 25, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Endosporlar metabolik bakteriler olumsuz ortamlarda devam izin bakterilerin uyuyan biçimleridir. Birçok spor oluşturan Bakterilerde Spor Oluşumu besin maddesinde yoksun kalma ile indüklenen, ancak bu işlem, oksijen ve diğer streslere 1 pH, maruz değişiklikleri ile kontrol edilebilir. Onların metabolik dormant spor formunda iken, bakteri, UV radyasyonu, kuruma, yüksek sıcaklıklarda ve 2 dondurma karşı. Sporlanma sürecine bilginin çoğu model organizma çalışmalarda, Bacillus geliyor. Sporlanma süreci DNA replikasyonu ve eksenel flamanlı 3,4 oluşumu ile başlar. Asimetrik septum daha sonra iki eşitsiz boyutlu bölmeye hücreyi böler. Daha büyük bölme, ana hücresi, küçük bölmesini, forespore engulfs. anne hücresi ve Dorman bırakmadan, sporu ve sonunda lyses anne hücreyi olgun gen ifadesini koordine forespore Hemçevreye 1 içine t spor.

spor yapısı ve bileşimi birçok bakteri türleri boyunca muhafaza edilir. Spor çekirdek vejetatif hücrenin daha düşük bir su içeriğine sahiptir ve dipikolinik asit (DPA) 1,2 ile zengindir. spor oluşumu sırasında, DPA su karşılığında spor iç kısım içine pompalanır. Çekirdeği çevreleyen en sporlu bakterilerin, çimlenme (germinants) uyaran küçük moleküller tanıyan reseptörleri 2 bulunduğu, bir iç spor bir zardır. Sadece spor iç zarının dışında bulunan hücre duvarı peptidoglikan bir tabakadır. Bir uzman peptidoglikan tabakanın (korteks) hücre duvarı peptidoglikan çevreleyen ve [N-asetilglukosamin (NAG) ve N-asetilmuramik asit (NAM) alternatif] hücre duvarı peptidoglikan aynı bileşenlerin çoğu oluşmaktadır. Bununla birlikte, korteks NAM tortularının yaklaşık olarak% 50 muramic-δ-laktam 5,6 dönüştürülmüş 2 birkaç kat olduğunu.

çimlenme sürecini kontrol sporlu bakteriler için büyük önem taşımaktadır. Filizlenen reseptörler kendi germinants 2 etkileşimde bulunduğunuzda Çimlenme başlatılır. Birçok spor oluşturan bakteri, bu germinants 2 olan amino asitler, şekerler, nükleotid, iyon ya da bunların kombinasyonları bulunmaktadır. C difficile spor çimlenmesi bazı safra asitleri [örneğin, taurokolik asit (TA)] ve amino asitler (örneğin, glisin) 7-10 kombinasyonları ile başlatılır. C arasında farklılıklar olmasına rağmen difficile çimlenme yolu ve okudu yolların diğer sporluörneğin B. bakteriler, subtilis, tüm ortak bir vejetatif hücre çimlenmiş sporun 2,8 büyümeye izin spor korteksi düşmesine mutlak bir gerekliliktir. Ya SLEC (B. subtilis içinde bulunduğu gibi) (birçok Clostridia bulunduğu gibi) Korteks bozunma SCLEs CwlJ / SleB ile gerçekleştirilebilir. Korteks hidroliz hücre duvarı ve sporun üzerinde kısıtlama azaltır. Bu, tam çekirdek rehidrasyon, hücre metabolizması 2 için gerekli olan proteinlerin birçok yeniden aktive gerekli bir adım için izin verir.

Sporların filiz olduğunda, bir faz-karanlık durumu ve bu işlem için bir faz parlak durumundan atıl spor değişiklikleri 600 optik yoğunluk (OD) bir değişiklik ile ölçülebilir nm 11. Bir önceki raporda OD bu değişimin çok sporla 12 DPA salınımına bağlı olduğunu göstermektedir. Bizim son çalışma sırasında, biz C. zamanlamasını karşılaştırmak için çalıştı difficile spor çimlenmesi ve izlenenDPA ve korteks parçalarının 9 sürümü. Onlar sporlar çimlenme tarafından piyasaya sürülecek başladı bu çalışma için korteks parçalarının serbest bırakılmasını izlemek için önemliydi.

Burada kullanılan kolorimetrik deney indirgeyici uçları olan şekerleri tespit etmek için bir yöntem dayanmaktaydı Ghuysen ve ark., 13 geliştirilmiştir. Diğerleri indirgen şekerlerin 14 tespiti için protokoller tarif etmişlerdir ya da bu protokolleri 15 modifiye Çünkü, bu konuda literatür kafa karıştırıcı olabilir. Burada, C çimlenme kurtuldu indirgeyici şekerlerin kolorimetrik tespiti için detay bir adım-adım yöntemi biz difficile sporlarının. Bu çalışmada C kullanır rağmen difficile sporları, diğer sporlu bakterilerden sporların çimlenmesi sırasında salınan indirgeyici şekerler bu protokol 9,16,17 ile tespit edebiliyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Yaratma Örnekleri

  1. Isı C etkinleştirmek difficile buz üzerinde 30 dakika ve mağaza 65 ° C sıcaklıkta sporlar.
    Not: C Daha önce tarif edildiği gibi 7,9,10 difficile sporlarının üretilir ve saflaştırılabilir.
  2. X, numune sayısı deneyi sırasında alınması gereken x + 1 ml çimlenme çözeltisi hazırlayın.
    Not: bakteri türlerinin çalışılan spor için çimlenme çözüm özgüdür. C içlin difficile spor çimlenmesi biz, 10 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCI, deiyonize su içinde 100 mM glisin, 10 mM taurokolik asidin bir çözeltisi kullanılır.
  3. tahlili başlamadan önce, korteks fragmanı tespiti için bir boş olarak hizmet etmek için sporların filizlenmeyi çözeltisi bir 1.0 mi bir numune alın.
  4. Bir OD hızla çimlenme çözüm ve vorteks ~ 3,0 600 sporlar ekleyin.
    Not: B bizim çimlenme araştırmalar için subtilis aynı OD kullanılan 6C gibi 00 sporlar difficile.
    Not: sporların Bu miktar C sırasında izleme korteks fragmanı serbest bırakılması için çalıştı difficile spor çimlenmesi. Bu tahlilde kullanılan sporların miktarı, her bir bakteri ya da bir suş için deneysel olarak tespit edilmelidir.
  5. Hemen 14,000 x g'de 1 dakika için oda sıcaklığında sporlar ve santrifüj ilave edildikten sonra 1.2 ml lik bir numuneyi çıkarın. Bu sıfır zaman noktasıdır.
  6. daha sonra korteks fragmanı analizleri için yeni bir tüpe için santrifüj numuneden süpernatan 1.0 mL aktarın.
    Not:, terbium floresan 9,18,19 dayanan bir deney kullanılarak çözelti içinde DPA tespiti için ayrı bir 100 ul numuneyi çıkar DPA izlenecek gerekirse.
  7. -80 ° C'de toplanan örnek dondurun.
  8. Tüm zaman noktalarında tamamlanana kadar tekrarlayın düzenli aralıklarla 1.4 ve 1.5 adımları tekrarlayın.
    Not: Zaman santrifüj ve örnekleme, zaman noktaları daha az inci için gerekli olduğundanBir 2 dk dışında bizim işlem sırasında mümkün değildi, bu yüzden bizim örnekleme aralıkları kez 14 dakika boyunca her 2 dk.
  9. 0, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500 ve 5000: Şeker saptanması ve nicelenmesi azaltmak için pozitif bir kontrol olarak, N -acetylglucosamine (nmol) aşağıdaki miktarlarda bulunur. korteks örneklerinde olduğu gibi aynı zamanda bu örnekleri hazırlamak ve standart eğri sporlarını çimlenme tarafından oluşturulan verilere uygun olacak şekilde korteks örnekleri ile birlikte çalışacak.
  10. her zaman nokta örnekleri toplandıktan sonra, numune liyofilize.
    Not: 2 ml vidalı kapaklı tüplerde bizim örnekleri dondurularak.

2. Cortex Fragments Ölçme

  1. % 1 fenol ve% 0.5 β-merkaptoetanol ile takviye edilmiş, 3 N HCI, 120 ul Liyofilize edilen numuneler, yeniden süspanse edin.
  2. 2 ml'lik vidalı kapaklı tüplere yeniden süspanse örnekleri aktarın.
    Not: tekrarlanabilirlik için, tüm liyofilize numune yeniden süspanse ve transfer edildiğinden emin olun.
  3. <li> 4 saat 95 ° C de bir devri daim su banyosu içinde inkübe edin.
  4. serin kadar inkübasyondan sonra, buz üzerinde örnekleri yerleştirin.
  5. 3 M NaOH 120 ul örnekleri nötralize eder.
  6. doymuş sodyum bikarbonat çözeltisi 80 ul her bir örnek ve vorteks bir% 5 asetik anhidrid çözeltisi 80 ul ekle.
  7. 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
  8. TAM 3 dakika boyunca geri 95 ° C su banyosunda örnekleri aktarın.
    Not: Bu adım hassas ve daha uzun süreler aşağı sinyal gelişimini etkileyebilir zamanıdır.
  9. su banyosu örnekleri çıkarın ve buz üzerinde soğutun.
  10. Her bir tüp ve vorteks 6.54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O 400 ul ekleyin.
  11. Tam olarak, 7 dakika boyunca 95 ° C de bir devri daim su banyosu içinde inkübe edin.
    Not: Bu adım hassas ve daha uzun süreler aşağı sinyal gelişimini etkileyebilir zamanıdır.
  12. Kaldır5 dakika boyunca buz üzerinde örnekleri ve yer.

3. Renk reaktifi

  1. Numuneler buz (Adım 2.12) üzerinde iken, renk reaktifi hazırlamak. (; Ehrlich reaktifi DMAB) buzlu asetik asit, 1.9 ml p -dimethylaminobenzaldehyde 0.320 gr eritin.
    Not: reaktif zaman, sıcaklık ve ışığa karşı hassastır ve önceden yapılmamalıdır.
  2. DMAB tamamen erir sonra, 10 N HCI ve vorteks 100 ul ekleyin.
  3. buzlu asetik asit ve girdap 5 ml.

4. kolorimetrik reaksiyon

  1. Aktarım, her 100 ul yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne korteks numunenin soğutuldu.
  2. Her bir numune için taze hazırlanmış renk çözeltisi 700 ul ekleyin.
  3. Derhal bir 37 ° C su banyosuna örnekleri transferi ve tam olarak 20 dakika süreyle inkübe edin.
  4. berrak bir 96 oyuklu plakaya her bir numune 200 ul aktarın.
  5. bir plaka üzerinde 585 nm'de numune sayısal olarakokuyucu. Numuneler bir sarı renk başlamalıdır ve pozitif bir reaksiyon mor kayacak. Daha fazla korteks mevcut, derin mor renk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tablo 1 NAG standartlarını kullanarak tipik sonuçları göstermektedir. Veriler, standart bir eğri oluşturmak için kullanılmaktadır. Tablo 2, 100 mM glisin, 10 mM TA (çimlenme arttıran koşullarda) ya da 100 mM glisin, sadece (non-çimlenen koşullar) ile takviye edilmiş tampon çimlenme bir çimlenme deneyinde tipik sonuçlan göstermektedir. Ta, C. yokluğunda difficile sporlar çimlenir yoktur ve çözeltide korteks parçalarının varlığında küçük bir değişiklik olmamıştır. Ancak, her iki TA ve glisin, C varlığında difficile sporlar çimlenir ve çözüm içine korteks parçaları bırakın. Bu reaksiyona numunelerin zaman üzerinden olan OD 585 bir artış olarak gözlenir. Bu deneyde sırasında serbest korteks parçalarının (nmol) toplam miktarı, 1B, Şekil benzer bir standart eğri kullanılarak hesaplandı. Bu tahlilde, korteks en hidroliz edilir (ya da serbest) 15 dakika sonrası göre(a önceki yayının 7 ile uyumlu Şekil 2) sporların çoğu bu zaman dilimi içinde çimlenmiş olduğunu düşündüren filizlenen pozlama.

Renk reaktifi örnekleri geliştirdikten sonra, çoğu örnekleri. Çıplak gözle mor renk göstermek 1 N-asetilglukozamin oluşturulan temsili bir örneği göstermektedir olmayabilir. Bir çok numune, görünür bir mor bir renk göstermezler. Ancak, 250 nmol, 500 nmol ve 5.000 nmol örnekleri negatif kontrol (0 nmol) görsel olarak farklı görünebilir. OD 585 nm'de ölçülen, sinyal iyi bir lineer regresyon (= 0.999 R2) uyar oluşturdu.

Şekil 1
Şekil 1:. Algılama N-asetilglukosamin (A) N-asetilglukosamin örnekleri (0 nmol, 12.5 nmol,25 nmol, 50 nmol, 100 nmol, 250 nmol, 500 nmol, 5000 nmol) tarif edilen prosedüre göre liyofilize edildi ve reaksiyona sokuldu. (B) Örnekler 96 oyuklu bir plaka ve 585 nm 'de tespit edilen reaksiyona materyal miktarı ilave edilmiştir. Sinyal bir standart eğri oluşturmak için kullanılmıştır. şekil 2
Şekil 2:. Çimlendirme Sonuçlarının Grafiksel Gösterimi Tablo 2'de hesaplanan nmol korteks zaman karşı çizilmiştir. (●) 100 mM glisin, 10 mM TA; (■), 100 mM glisin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

NAG Konsantrasyon (nmol) OD 585
0 0.047
12.5 0.054
25 0.066
50 0.084
100 0.128
250 0.285
500 0.556
5000 4.0
boş = 0.046

Tablo 1: NAG Standardı.

Clostridium difficile Spore Çimlenme
Çimlenme çözeltisi (10 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCI)
100 mM glisin, 10 mM TA 100 mM glisin
Süre (dakika) OD 585 Hesaplanan (nmol) OD 585 Hesaplanan (nmol)
0 0.046 0.00 0.047 0.00
2 0.048 2.54 0.048 1.27
4 0.05 5.07 0.049 2.54
6 0.055 11.41 0.05 3.80
8 0.059 16.49 0.05 3.80
10 0.06 17.76 0.051 5.07
12 0.061 19.02 0.05 3.80
14 0.063 21.56 0.051 5.07

Tablo 2: Spore Germinati ÖrnekSonuçlar üzerinde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

stimülasyon üzerine çimlenme süreci geçiren sporları makromoleküler sentez için gerek kalmadan kendi direnç özelliklerini kaybederler. Spor çimlenmesi tetiklendiğinde, spor çekirdek su 2 karşılığında DPA serbest bırakır. Nedeniyle atıl sporun yüksek DPA içeriğine, spor çekirdek genişleme 2 önünde bir engel olarak, muhtemelen, hareket ederek şişme çekirdek engeller yoğun olarak ozmotik basınç ile özel bir peptidoglikan, korteks altındadır.

Yukarıda tarif edilen yöntem, mor bir renk tonu ölçülebilir kayması olarak indirgeyici şekerlerin varlığını tespit etmek için Ehrlich reaktifi (sarı solüsyon) kullanır. korteks hidroliz sırasında, NAG ve NAM şekerler serbest bırakılır (hidrolize enzimler ölçüde bağlı, şekerler disakkarit ve polisakkaritler olarak serbest bırakılabilir). HCI (Adım 2.1) ile glikozidik bağların hidrolizi ücretsiz indirgeyici uçları 7 ile monosakaritler üretir. neutraliz sonrasodyum hidroksit, eşit miktarda (2.5 Aşama) ile asit ing, dır Çevre alkoller ve NAM monosakaridler, asetik anhidrit ile asile edilir 13 (2.6 aşaması). Daha sonra, reaksiyona girmeyen, asetik anhidrid örneği (adım 2.8) ısıtma sureti ile asetik asite dönüştürülür. Morgan ve Elson 20 varsaydığı gibi terminal aldehit kendiliğinden enol haline dönüşür. Alkali koşullar (2.10 Step) altında, bu enol biçimi mor renkli 15,20 oluşturmak için Ehrlich reaktifi (adım 4.3) ile reaksiyona giren bir oksazol türevi oluşturmak için bitişik asetil ile reaksiyona girebilir.

Yukarıda tarif edilen bu yöntem, sporlar çimlenme B. hem korteks parçalarının tespiti için tutarlı, güvenilir sonuçlar verir subtilis ve C difficile 9,16,17. tahlil süreleri, sıcaklıklar ve prosedürler hassasiyetle yapılmaktadır reaksiyonu sağlamak için özel dikkat gerektirir. Uygun dikkat etmedenReaksiyon koşulları deneyler 13 arasında yeniden başarısız ya da olmamak için detaylara, bu kolaydır. Ancak, laboratuvar ortamları arasında testinin uygulanmasında bir NAG standart yardımcıları dahil. NAG pozitif kontrol standart herhangi arası deneysel değişkenliği (örneğin reaksiyon zamanlarında, küçük farklılıklar veya renk reaktifi etkinliği) her deney kontrollerde dahil. Sadece tampon koşulları ve korteks hem hidrolize aciz sporlarla reaksiyonları kullanılarak reaksiyonlar renk hiçbir değişiklik vermiştir.

Bu yöntem ile en sık görülen problem arası deneysel değişkenlik ya da sinyal tam olmaması. değişkenliği kontrol etmek için, spor hazırlıkları herhangi vejetatif hücre enkaz arındırılmış olmalıdır. Bu hücre yıkıntıları peptidoglikan parçalar (NAG ve NAM) içerecektir ve çimlenme sporlar için, yüksek bir zemin sinyali ile sonuçlanacaktır. saf spor preparasyonu (>% 99.9 spor) sağlamak için, Literatu bakınızyöntemler organizma saf spor süspansiyonları hazırlamak için yeniden 7,9,21-23 çalışılacak.

Deney, saptanabilir bir sinyal veren değildir edilirse, liyofilizasyon aşaması değişkenlikler eklemek gözlemlenmiştir. Nedeniyle elektrikli salındığı yürürlüğe için, kuru numune toz örneği, tüpün dışarı üflenir gözlemlenmiştir. azaltmak için / numune tüpleri üstleri delik aç, küçük bir şırınga iğnesi kullanın oluşmasını engellemek. kişiye deliklerin küçük bir alanda rahatsız (şimdi toz formunda) liyofilize örnek olasılığını azaltacaktır. Yukarıdaki yöntemlerin de belirtildiği gibi, son olarak, bir kaç inkübasyon adımları çok zaman duyarlıdır. tüm zamanlanmış adımlar dikkatle takip emin olun. Bu deney için önemli bir nokta, korteks fragmanları tespit etmek için çimlenme spore salınabilir olmasıdır. korteks büyük parçalar halinde hidrolize edilir, bu fragmanlar rele olmak için çok büyük olabilirspor kaplama arasından ased. bir sinyal vermezse bir deney giderirken önemli bir göz olsa, biz önce potansiyel bir sorun olarak korteks fragmanı büyüklüğü göz önüne alındığında için koşullar burada listelenen çözeltide sporlar ve diğer sorun giderme seçeneklerinin çoğunu çimlenme için kullanılan onaylamak için tavsiye deneyi.

Tüm çimlenme tamponlar / koşullar, bu deney için uygundur. Bu deney, çimlenme sürecinin 13, şekerler ya da kendisi bir filizlenen, bir indirgeyici şeker azaltıcı içeren herhangi bir çimlenme tamponu sırasında serbest indirgeyici şekerlerin varlığı tespit için (örneğin, glikoz) bu deneyde güçlü bir sinyal ile sonuçlanır. Bu durumda, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) korteks parçalarının 24-26 varlığını tespit etmek için kullanılabilir. Tüm laboratuarlar, enstrümantasyon ile donatılmıştır değildir Ancak, burada tarif edilen yöntem, çoğu tarafından kullanılabilirlaboratuarlar ve basit ve kolay ölçülebilir sonuçlar sunuyor.

Bakteriyel sporlar çimlenme ölçüde Bacillus ve birkaç Clostridium türleri 2,8 incelenmiştir. farklılıklar var ancak süreç genellikle korunur. Önemlisi, tüm organizmalar modeli spor-oluşturucu 9,27 görüldüğü gibi spor çimlenme mekanizmaları kullanarak filizlenmeye. Çimlenme daha çeşitli organizmalarda incelenmiştir hale gelmektedir, çünkü, yukarıda tarif edilen deney, spor çimlenmesi esnasında korteks fragmanları tespit etmek için, bu organizmalar için uygulanabilir. Bu yeni çalışılan organizmalar için bu yöntemi uygulayarak, araştırmacılar korteks hidroliz çeşitli çimlenme proteinleri oynadıkları rolü belirleyebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

açıklanan Proje Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü Ödülü Numarası 5R01AI116895 tarafından desteklenmektedir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 ml screw cap tube USA scientific 1420-3700
p1000 Eppendorf pipet Eppendorf
p200 Eppendorf pipet Eppendorf
p20 Eppendorf pipet Eppendorf
100 - 1,250 μl pipet tips VWR 89079-486
1 - 200 μll pipet tips VWR 89079-458
N-acetyl-D-glucosamine Sigma A3286-25G
Hydrochloric Acid - 10 N BDH-Aristar BDH3032-3.8LP
Acetic Anhydride Alfa Aesar L04295
Sodium Bicarbonate BDH BDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrate Alfa Aesar 39435
Sodium Hydroxide BDH BDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehyde Sigma 156477-100G
Saturated Phenol Fisher BP1750-400
2-Mercaptoethanol Aldrich M6250-100ML
SpectraMax M3 Molecular Devices
Acetic Acid, Glacial BDH BDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water Bath VWR Scientific Model 1136
Microtest 96 Falcon 353072 96 well clear tissue culture plates
Culture tubes VWR 89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
  2. Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
  3. Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
  4. Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
  5. Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
  6. Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
  7. Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
  8. Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22, (7), (2014).
  9. Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197, (14), (2015).
  10. Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).
  11. Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
  12. Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).
  13. Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
  14. Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
  15. Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
  16. Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
  17. Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
  18. Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
  19. Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
  20. Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
  21. Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
  22. Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
  23. Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
  24. Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
  25. Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
  26. Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
  27. Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).
Bakteriyel Spor Filizlenmesinin sırasında Cortex Fragments algılama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Francis, M. B., Sorg, J. A. Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination. J. Vis. Exp. (112), e54146, doi:10.3791/54146 (2016).More

Francis, M. B., Sorg, J. A. Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination. J. Vis. Exp. (112), e54146, doi:10.3791/54146 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter