פרוטוקול עבור ההפקה של חלקיקי גליאדין-cyanoacrylate לציפוי הידרופיליות

Abstract

מאמר זה מציג פרוטוקול לייצור חלקיקים מבוססי חלבון שמשנה את פני השטח הידרופובי הידרופילי ידי ציפוי ספריי פשוט. חלקיקים אלה מיוצרים על ידי התגובה פילמור של cyanoacrylate אלקיל על פני השטח של מולקולות חלבון דגנים (גליאדין). cyanoacrylate אלקיל הוא מונומר כי polymerizes מיידי ב RT כאשר הוא מוחל על פני השטח של חומרים. התגובה פילמור שלה היא ביוזמת כמויות זעירות של מינים בסיסיים או nucleophilic חלושות על פני השטח, כולל לחות. לאחר polymerized, את cyanoacrylates אלקיל polymerized להראות זיקה חזקה עם חומרי האובייקט בגלל שקבוצות ניטריל נמצאות עמוד השדרה של פולי (cyanoacrylate אלקיל). חלבונים גם לעבוד בתור יוזם פילמור זה משום שהם מכילים קבוצות אמינות שיכול ליזום פילמור של cyanoacrylate. אם חלבון מצטברים משמש כיזמית, במצטבר חלבון מוקף הידרופוביפולי (cyanoacrylate אלקיל) שרשראות לאחר התגובה פילמור של cyanoacrylate אלקיל. על ידי שליטה על תנאי הניסוי, חלקיקים בטווח ננומטר מיוצרים. החלקיקים היוצר בקלות לספוג אל פני השטח של רוב החומרים כוללים זכוכית, מתכת, פלסטיק, עץ, עור, בדים. כאשר פני השטח של חומר הוא רסס עם השעית nanoparticle פיק שטפו עם מים, מבנה micellar של ננו-חלקיקים משנת קונפורמציה שלה, ואת החלבונים הידרופילי נחשפים לאוויר. כתוצאה מכך, השטח מצופה ננו-החלקיקים משתנה הידרופילי.

Protocol

1. Defatting המסחרי גליאדין

1. מדוד 150 מ"ל של אצטון עם גליל סיימה ויוצקים לתוך 250 מ"ל בבקבוק Erlenmeyer.
   1. תוך ערבוב עם בר ספין על בוחש מגנטי ב RT, להוסיף 30 גרם של גליאדין אבקה מסחרית. חותם את פתיחת הבקבוק עם רדיד אלומיניום, ולשמור על בחישת O / N בשכונה.
2. תסנין הפתרון עם נייר סינון.
   1. שטפו את תסנין עם אצטון טרי (בערך 50 מ"ל). תן להחזיק מעמד 10 דקות, כדי לאפשר אצטון לניקוז.
   2. מעביר את התסנין יחד עם נייר הסינון מתחת לצלחת גדולה כמו צלחת מרובע תרבית תאים. מכסה את הצלחת המלאה עם נייר סינון גדול כדי להאט את האידוי של אצטון שיורית.
   3. אפשר תסנין להתייבש לחלוטין N / ברדס O. אחסן את גליאדין נטול שומן באריזה נגד אוויר חזק ב RT.

2. הכנת המטוהרים גליאדין

1. מדוד 150 מ"ל של ווהter עם גליל סיימה ויוצקים לתוך 1,000 מ"ל בבקבוק Erlenmeyer.
   1. מדוד 350 מ"ל של אתנול אבסולוטי עם גליל בלגן ויוצקים לתוך אותו בקבוק Erlenmeyer 1,000 מ"ל. מערבבים נמרצות (800 - 1,000 סל"ד) עם בר ספין עד אין בועה נוצרת מתערובת פתרון.
2. תוך ערבוב, מוסיפים 20 גרם של אבקת גליאדין נטול שומן-מסחרי. להוסיף גליאדין בכמויות קטנות בכל פעם, כדי למנוע היווצרות של גושים המכיל אוויר באמצע. שמור על ערבוב O / N.
3. מעבירים את הפתרון כולו גליל בלגן 1,000 מ"ל. בואו לעמוד במשך יומיים. במהלך תקופה זו, זיהומים שישקעו בתחתית הצילינדר.
4. מעביר את supernatant מאייד סיבובי עם טפטפת, ולהסיר אתנול מן supernatant ככל האפשר. ככל ששיעור אתנול מצטמצם, גליאדין יופיע הפתרון כמו צבירה.
5. להקפיא את אגרגטים גליאדין המכיל פתרון ידי טבילה / מסתובבת מתנול/ תערובת קרח יבש ולהקפיא יבשים ב -70 ° C תחת ואקום. לפני ייבוש בהקפאה, לוודא הפתרון כולו קפוא ללא כל נוזל.
   הערה: גליאדין מיובש בהקפאה יהווה מוצק נקבובי.
6. קראש גליאדין מיובש בהקפאה עם ובמכתש, וטוחנים עם מטחנת קפה להשיג כוח קנס (<0.5 מ"מ). מעבירים את המוצר לתוך מיכל אטום לאוויר ולאחסן ב RT.

3. תגובה פילמור של ECA עם גליאדין

1. מניחים בקבוקון הנצנץ (נפח הוא סביב 20 מ"ל) ב במאזניים, וטרה. מוסיפים מים 3.2 גרם מזוקקים ו -6.8 גרם אתנול אבסולוטי בבקבוקון scitillation.
2. הזז את בקבוקון הנצנץ על stirrer מגנטי, לשים בר ספין מגנטי (20 x 3 מ"מ) לתוך הבקבוקון, ומערבבים נמרצות (800 - סל"ד 1,000) עד אין בועת אוויר מופק מתערובת אתנול מימית.
3. הוסף 40 μl של 4 N HCl לתוך בקבוקון תוך ערבוב. הוסף 20 מ"ג של גליאדין לתוך הבקבוקון בעוד Sti ט-ררינג, ולשמור על בחישה עד אבקת גליאדין נמס לגמרי בתערובת אתנול מימית.
4. לאחר שווידא הפתרון גליאדין ברור בעיני עירום, להוסיף לאט 80 - 100 μl של ECA בעוד מהירות ערבוב עדיין 800 - סל"ד 1,000.
   1. מנמיכים את מהירות ערבוב עד 500 סל"ד, וממשיכים לבחוש עבור שעה 1. ככל שמתקדם התגובה, להתבונן עכירות אשר מציינת כי התגובה פילמור מתבצעת.
5. כאשר התגובה מסתיימת, להעביר את הפתרון לתוך צינורות צנטריפוגות, ולאזן את המשקל של החצוצרות. צנטריפוגה מוצר התגובה ב XG 10,000 במשך 20 דקות. במהלך תקופה זו, משקעת חלקיקי מוצר לוואי להישאר supernantant. המרכיב העיקרי של המוצר בצד הוא homopolymer PACA.
6. לאחר צנטריפוגה, להעביר את ההשעיה nanoparticle מיוצר (supernatant) עם טפטפת כדי בקבוקון הנצנץ (או כל מיכל אוויר חזק), ולאחסן אותו ב RT.

אפיון הכותרת "> 4. מהתוצר

1. כן 10 גרם של 68% WT אתנול המימי על ידי ערבוב מי 3.2 גרמו ו אתנול אבסולוטי 6.8 גרם ב בקבוקון נצנץ 20 מ"ל ומערבב עד אין בועה נוצרת מתערובת הפתרון.
   1. הוסף 40 μl של 4 N HCl לתערובת פתרון תוך ערבוב. הוסף 50 μl של ההשעיה nanoparticle לפתרון אתנול מוכן תוך ערבוב.
2. מדוד את גודל ננו-חלקיקים עם פיזור אור דינאמי (DLS) באמצעות פתרון מדגם מוכן לעיל ופעל על פי ההנחיות של היצרן.
   הערה: הגודל של המוצר הסופי צריך להיות קטן מ -200 ננומטר. אם הוא גדול מ -200 ננומטר, המוצר לא יהיה יציב במשך תקופה ארוכה של זמן. חלקיקים גדולים יותר מיוצרים כאשר ECA המועסקת אינה טריה.

בחינת 5. מהתוצר

1. הכינו צלחת זכוכית כגון ראי יד. שטפו את פני השטח של צלחת זכוכית עם מים וסבון. Rinse פני השטח של צלחת זכוכית עם מים זורמים. הקפד לייבש את המשטח לנקות או להשתמש ללא ייבוש עבור לשלב הבא.
2. תרסיס ההשעיה nanoparticle שהושגו 3.6) על חלק צלחת זכוכית, ולשטוף את המשטח עם מים זורמים מיד.
3. תרסיס מים טהורים על פני השטח של צלחת זכוכית. שים לב המצופה (רסס עם השעית nanoparticle) שכבת מים בהמתנת שטח בעוד משטח הציפוי ברור.

Representative Results

חלקיקים יכולים להיות ערוכים תנאי תגובה שונים. צורות גליאדין המצרפי מגוון רחב של אתנול תוכן ^5. עם זאת, הגודל של אגרגטים צריך להיות קטן ככל האפשר, כי שכבה נוספת (כלומר., Polymerized ECA) תתווסף מצרף זה ותהליך זה יהפוך את הגודל הסופי גדול. אם הגודל של החלקיקים הסופי הוא גדול מדי, החלקיק יהיה בלתי יציב שישקע בקלות. לכן, 68% אתנול מימי נבחר כמדיום תגובה ^4. גודלו של הננו-חלקיק המיוצר היא בסדר גודל של כמה מאות ננומטרים. המנגנון עובד לציפוי הידרופילי עם ננו-החלקיקים המיוצרים הוא כדלקמן.

לקבלת ציפוי של חומרים, ננו-חלקיקים השעיה זו (מושעה באתנול 68%) הוא ריסס על פני השטח של החומר היעד ואחריו שטיפה עם מים. כאשר נאן oparticles מושעה באתנול המימי הוא רסס על פני השטח של חומר היעד, אתנול מימי מתפשט בקלות לאזור רחב יותר בגלל מתח הפנים של אתנול הוא נמוך מאוד. פעולה בהפצה זה של אתנול מימי מספקת את החלקיקים מושעה על פני השטח של חומר היעד במהירות שווה. החלקיקים נמסרו לספוג על החומר בגלל הזיקה החזקה של רשתות PECA על פני השטח של חלקיקים. בנוסף עוקב של מים משנה את הקונפורמציה של חלקיקים. במילים אחרות, ננו-חלקיקים נפתח המבנה שלה כדי לחשוף את החלבונים הידרופילי הפנימי לאוויר. כתוצאת שינוי קונפורמציה זה, פני השטח של החומר המצופה פונים הידרופילי ^8. כדי להבין שינוי קונפורמציה זו של חלקיקים, המצב הזה הוא חיקה ידי הצבת חלקיקים לתוך פתרונות אתנול שונים וניטור פוטנציאל זטה.

1 "src =" / files / ftp_upload / 54,147 / 54147fig1.jpg "/>
איור 1. זיטה פוטנציאלי קוטר של החלקיקים הופקו פתרונות אתנול queous אמנים שונים. גרף זה מראה כי כל nanoparticle משנה קונפורמציה שלה ופני השטח שלו הופך הידרופילי כתוכן אתנול של מדיום השעיה פוחת. זהו מנגנון העבודה של ציפוי הידרופילי עם חלקיקים. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1 מראה כי ננו-החלקיקים שהוכנו 68% אתנול מימי ומפורר לחלקיקים קטנים כמדיום השעיה שמסביב מכיל אתנול פחות, מ -68% ל -50%. בטווח תוכן אתנול זה, ברי שגיאה של פוטנציאל זטה גדולים, כלומר חלוקת תשלום שטח היא רחבה למדי וחלקיקים אינם התייצבו גם. היות והתוכן במים עולה, הערך המוחלט של פוטנציאל זטה מגדיל במהירות עד שתוכן אתנול יורד ל -30%. משמעות הדבר היא כי פני השטח של כל ננו-חלקיק טעון מאוד ואת hydrophilicity של פני החלקיקים הוא גדל באופן משמעותי. לאחר מכן, פוטנציאל זטה אינו משנה הרבה כי חלקיקים בצורה אגרגטים. היווצרות מצרפים זה לא קורה כאשר השעית nanoparticle משמשת לציפוי הידרופילי כי החלקיקים הם adsorbed על פני השטח של חומרים. בקיצור, התהליך לציפוי הידרופילי כרוך ריסוס השעית nanoparticle, הספיחה של חלקיקים על פני השטח של חומר היעד, וחשיפה של מולקולות חלבון פנימיות לאוויר. במציאות, תהליך הציפוי כולו מתרחש בתוך פחות מדקה.

להעלות / 54,147 / 54147fig2.jpg "/>
תמונת איור 2. SEM של חלקיקים אשר נספח. SEM מציגה את התפלגות חלקיקים על פני השטח של צלחת זכוכית. בגלל החלקיקים המופצים באופן שווה, את ההעברה של אור הנראה אינה מושפעת באופן משמעותי. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כתוצאה הציפוי עם חלקיקים, חלקיקים הם adsorbed על פני השטח של החומר היעד. איור 2 מראה חלקיקים adsorbed על פני השטח של צלחת זכוכית. תמונה זו צולמה עם מיקרוסקופ אלקטרונים שדה פליטה סורק (SEM). תמונת SEM זה מראה כי כל גדלי החלקיקים נראים קטן מ -100 ננומטר. מאז המדגם היה מצופה גמגום לפני הדמית SEM, עם זאת, לא אמור להיות כמה הצטמקות של גודל חלקיקים במהלך תהליך זה. תמונת SEM זה מראה כי חלקיקים גם מפוזרים על פני השטח של צלחת זכוכית ויש מספיק רווחים בין חלקיקים עבור לאור לעבור. הפריסה המרחבית זה של חלקיקים בגודל קטן של חלקיקים (כלומר., גודל קטן יותר מאורך הגל של האור הנראה) להסביר מדוע השקיפות של צלחת זכוכית הוא לא מתרגשים יתר על המידה הציפוי.

	לפני הציפוי	לאחר ציפוי
זכוכית	25.5 ± 1.5 °	8.9 ± 0.8 °
פוליסטירן	52.7 ± 1.2 °	6.8 ± 0.8 °

טבלה 1: לתקשר זווית של מצעים לפני ואחרי ציפוי עם חלקיקים.

FO: keep-together.within-page = "1"> ננו-חלקיקים המיוצר adsorbs על פני השטח של חומרים שונים. לאחר חומר היעד מצופה חלקיקים, זווית המגע של המשטח המצופה יורדת באופן משמעותי. לוח 1 מציג את נתוני הניסוי נמדדו על ידי זווית מגע דינמית מכשיר (DCA). בבדיקה זו, שיטת צלחת Wilhelmy שמשה כדי לקבוע את ההשפעה של ציפוי ננו-חלקיקים על יכולת רטיבות משטח ^9. באשר לאופן מדיד זווית מגע, דגימות נערכו על ידי טבילת הצלחות העשויות מאותו החומר להיבדק לתוך השעית nanoparticle והשטיפה עם זרם של מים מזוקקים למשך מספר שניות. הצלחת המוכנה ברציפות הייתה שקועה וסיר ממים מזוקקים. Curves הנוגע מתח interfacial לעומק הטבילה היה זמם והשתמש לחשב את זווית המגע הנסוגה ^10. בטבלה, הוא הראה כי מתח הפנים של שתי דוגמאות, זכוכית פלסטיק (קלקר), טיפותמשמעותי לאחר הציפוי.

הפגנה איור 3. של הידרופיליות לציפוי (1). החצי הימני של פני השטח של פלסטיק פוליקרבונט היה מצופה חלקיקים, בעוד החצי השמאלי היה ללא ציפוי. כאשר פני השטח כולו היה זרוע מרסס מים, משטח מצופה לא ליצור טיפות מים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

השפעת ציפוי ניתן דמיינו בקלות על ידי השוואת אפקט הרטבה לפני ואחרי ציפוי. איור 3 מדגים את ההשפעה ציפוי הידרופילי על פני השטח של פלסטיק, פוליקרבונט. בעוד החצי הימני של המשטח העליון היה מצופה, החצי השמאלי היה שלם. לזרות על היםurface של משטחים אלה מדגים את השפעת הציפוי בבירור. המחצית הימנית צורות סרט דק מאוד של מים, ואילו החצי השמאלי יוצר טיפות מים מראות מים שאינו להרטיב את פני השטח.

הפגנת איור 4. הידרופיליות לציפוי (2). חלון מושב הנהג של מכונית הייתה מצופית חלקיקים תוך חלון נוסע אחורי היה ללא ציפוי. כאשר שני החלונות היו זרועים מרסס מים, משטח מצופה לא ליצור מים טיפות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

להדגמה נוספת, ננו-החלקיקים המיוצרים רוססו על משטח זכוכית אוטומטית (איור 4). חלון מושב הנהג היה מצופהחלקיקים, כאשר חלון הנוסע האחורי לא היה מצופה. כאשר מים הותזו על שתי חלון הזכוכית, המים רססו יצרו שכבת מים דקה על הזכוכית המצופית בעוד טיפות מים נוצרות על זכוכית הציפוי. תמונה זו מראה בבירור כי הזכוכית המצופית מציעה הרבה ראות טובה יותר מאשר ציפוי אחד.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethyl cyanoacrylate (ECA) monomer	K&R International (Laguna Niguel, CA)	I-1605	Any pure ECA can be used.
Gliadin	MGP Ingredients, Inc (Atchison, KS)	Gift from the company	Gliadin can be purchased from Sigma-Aldrich (cat #: G3375-25G). Instead of gliadin, any commercial  gluten can be used.
HCl	Any		Any reagent grade chemical can be used.
Acetone	Any		Any reagent grade chemical can be used.
Methanol	Any		Any reagent grade chemical can be used.
Ethanol (100%)	Any		Any reagent grade chemical can be used.
Filter paper	Any		Any grade filter paper larger than 10 cm can be used.
Cell culture square dish	Any		Any dish larger than 20 x 20 cm can be used.
Coffee grinder	Any		Any coffee grinder can be used.
Rotary evaporator	Any		Any rotary evaporator can be used.
Freeze Dryer	Any		Any freeze dryer that can reach -70 °C can be used.
Centrifuge	Any		Any centrifuge that can apply 1,000 x g can be used.
Magnetic stirrer	Any		Any magnetic stirrer that can turn spin bar to 1,000 rpm can be used.
Dynamic Light Scattering (DLS)	Brookhaven Instruments Corporation	NanoBrook Omni Zeta Potential Analyzer	DLS from any company can be used.
Scanning Electron Microscope (SEM)	Carl Zeiss Inc.		Any SEM can be used.
Dynamic Contact Angle (DCA)	Thermo Cahn Instruments		Any DCA can be used.