Um protocolo para a produção de nanopartículas Gliadina-cianoacrilato para hidrofílico Coating

Abstract

Este artigo apresenta um protocolo para a produção de nanopartículas à base de proteína que modifica a superfície hidróf oba para hidrófila por um simples revestimento por pulverização. Estas nanopartículas são produzidos pela reacção de polimerização de cianoacrilato de alquilo na superfície de moléculas de proteína de cereais (gliadina). Alquilo é um monómero de cianoacrilato que instantaneamente polimeriza à TA quando ele é aplicado à superfície dos materiais. A sua reacção de polimerização é iniciada por os vestígios de espécies fracamente básicos ou nucleofílicos na superfície, incluindo humidade. Uma vez polimerizado, os cianoacrilatos de alquilo polimerizados mostram uma forte afinidade com os materiais objecto porque grupos nitrilo estão no esqueleto de poli (cianoacrilato de alquilo). As proteínas também funcionam como iniciador de polimerização para este porque contêm grupos amina que podem iniciar a polimerização de cianoacrilato. Se a proteína agregada é usado como um iniciador, de agregados de proteína é rodeado pelo hidrofóbicopoli (cianoacrilato de alquilo) correntes após a reacção de polimerização de cianoacrilato de alquilo. Ao controlar a condição experimental, as partículas na gama dos nanómetros são produzidos. As nanoparticulas produzidas prontamente adsorver à superfície da maioria dos materiais, incluindo vidro, metais, plásticos, madeira, couro e tecidos. Quando a superfície de um material é pulverizado com a suspensão de nanopartículas produzida e lavada com água, a estrutura micelar de nanopartículas muda a sua conformação, e as proteínas hidrófilas estão expostas ao ar. Como resultado, a superfície revestida de nanopartículas muda para hidrofílico.

Protocol

1. Desengordurante gliadina Commercial

1. Medir 150 ml de acetona com um cilindro graduado e despeje em 250 ml Erlenmeyer.
   1. Enquanto se agitava com uma barra de rotação sobre um agitador magnético, à TA, adicionar 30 g de pó de gliadina comercial. Selar a abertura do balão com folha de alumínio, e continuar mexendo O / N na capa.
2. Filtrado, a solução com um papel de filtro.
   1. Lavar o filtrado com acetona fresca (cerca de 50 ml). Deixar repousar durante 10 min para permitir que a acetona para drenar.
   2. Transferir o filtrado, juntamente com o papel de filtro por debaixo de um prato grande, tal como um prato de cultura de células quadrado. Cobrem todo o prato com um grande papel de filtro para reduzir a evaporação de acetona residual.
   3. Permitir o filtrado para secar completamente na capa O / N. Armazenar a gliadina desengordurada em um recipiente hermético em temperatura ambiente.

2. Preparação de gliadina purificada

1. Medir 150 mL de water com um cilindro graduado e despeje em 1.000 ml Erlenmeyer.
   1. Medir 350 ml de etanol absoluto com um cilindro de confusão e despeje na mesma 1.000 ml erlenmeyer. Mexa vigorosamente (800 - 1.000 rpm) com uma barra de rotação até que nenhuma bolha é gerado a partir da mistura solução.
2. Enquanto mexendo, adicione 20 g de pó de gliadina desengordurada-comercial. Adicionar gliadina em pequenas quantidades de cada vez para evitar a formação de grumos que contém ar no meio. Mantenha-se na agitação O / N.
3. Transferir a solução inteira para uma 1,000 ml cilindro bagunça. Deixe repousar durante dois dias. Durante este tempo, as impurezas serão precipitadas na parte inferior do cilindro.
4. Transferir o sobrenadante para um evaporador rotativo, com uma pipeta, e remover o etanol a partir do sobrenadante, tanto quanto possível. À medida que a percentagem de etanol é reduzida, gliadina aparece na solução como agregado.
5. Congelar a solução contendo agregados gliadina por imersão / rotação em metanol/ Mistura de gelo seco e seco por congelação a -70 ° C sob vácuo. Antes da liofilização, certifique-se toda a solução é congelada sem qualquer líquido.
   NOTA: A gliadina seca por congelação irá formar um sólido poroso.
6. Esmagar a gliadina liofilizado com almofariz e pilão, e moer com um moedor de café para obter um pó fino (<0,5 mm). Transferir o produto para um recipiente hermético e armazenar a RT.

Reação 3. Polimerização da ECA com gliadina

1. Colocar num frasco de cintilação (o volume é cerca de 20 ml) numa balança, e tara. Adicionar 3,2 g de água destilada e 6,8 g de etanol absoluto no frasco scitillation.
2. Mover o frasco de cintilação em um agitador magnético, colocar uma barra magnética de rotação (20 x 3 mm) para dentro do frasco, e agitar vigorosamente (800 - 1.000 rpm) até que nenhuma bolha de ar é gerado a partir da mistura aquosa de etanol.
3. Adicionar 40 ul de ácido clorídrico 4 N para o frasco com agitação. Adicionar 20 mg de gliadina no frasco enquanto sti rring, e manter em agitação até o pó de gliadina é totalmente dissolvido na mistura aquosa de etanol.
4. Depois de se certificar a solução gliadina é claro para os olhos nus, adicione lentamente 80 - 100 l de ECA, enquanto velocidade de agitação é ainda 800 - 1.000 rpm.
   1. Diminuir a velocidade de agitação para 500 rpm, e continuar a agitar durante 1 h. Conforme a reacção prossegue, observar turvação o que indica que a reacção de polimerização está em progresso.
5. Quando a reacção está terminada, transferir a solução para dentro de tubos de centrífuga, e equilibrar o peso dos tubos. Centrifuga-se o produto da reacção a 10.000 xg durante 20 min. Durante este tempo, os precipitados e nanopartículas produtos secundários permanecem no sobrenadante. O principal componente do produto secundário é PACA homopolímero.
6. Após a centrifugação, transferir a suspensão de nanopartículas produzidas (sobrenadante) com uma pipeta para um frasco de cintilação (ou qualquer recipiente hermético), e armazená-lo à temperatura ambiente.

título "> 4. Caracterização do Produto

1. Prepare a 10 g de etanol aquoso a 68% em peso, misturando 3,2 g de água e 6,8 g de etanol absoluto em 20 ml de frasco de cintilação e agita-se até que nenhuma bolha é gerado a partir da mistura solução.
   1. Adicionar 40 ul de ácido clorídrico 4 N à mistura solução enquanto se agitava. Adicionar 50 ul de suspensão de nanopartículas à solução de etanol preparada, enquanto se agitava.
2. Medir o tamanho de nanopartículas com dispersão de luz dinâmica (DLS), utilizando a solução de amostra preparada anteriormente e seguir as instruções do fabricante.
   NOTA: O tamanho do produto final tem de ser menor do que 200 nm. Se for maior do que 200 nm, o produto não será estável por um período de tempo prolongado. nanopartículas maiores são produzidos quando o ECA empregada não é fresco.

5. O exame do produto

1. Prepare uma placa de vidro, como um espelho de mão. Lava-se a superfície da placa de vidro com água de sabão. Rinse a superfície da placa de vidro com água corrente. Seca-se a superfície limpa ou uso sem secagem no passo seguinte.
2. Pulverizar a suspensão de nanopartículas obtida em 3.6) sobre uma parte da placa de vidro, e enxaguar a superfície com a água que flui imediatamente.
3. Pulverize água pura sobre a superfície da placa de vidro. Observe a camada de revestimento (pulverizados com suspensão de nanopartículas) de água de superfície espera enquanto a superfície sem revestimento é clara.

Representative Results

As nanopartículas podem ser preparadas em várias condições de reacção. Formas de gliadina agregar em ampla gama de conteúdo de etanol ^5. No entanto, o tamanho de agregados tem de ser tão pequena quanto possível, porque uma camada adicional (isto é., A CEA polimerizada) vai ser adicionado a este agregado e este processo vai tornar o tamanho final maior. Se o tamanho final da partícula é demasiado grande, a partícula irá ser instável e pode facilmente ser precipitado. Portanto, etanol aquoso a 68% foi escolhido como um meio de reacção ^4. O tamanho das nanopartículas produzido é da ordem de algumas centenas de nanómetros. O mecanismo de trabalho para o revestimento hidrofílico com a nanopartícula produzidos é como se segue.

Para o revestimento de materiais, esta suspensão de nanopartículas (suspenso em 68% de etanol) é pulverizada sobre a superfície do material alvo, seguida por lavagem com água. Quando o nan oparticles suspensos em etanol aquoso é pulverizado sobre a superfície do material do alvo, etanol aquoso espalha-se facilmente a uma área mais ampla porque a tensão superficial do etanol é muito baixa. Esta acção de espalhamento de etanol aquoso proporciona os nanopartículas em suspensão sobre a superfície do material alvo rapidamente e uniformemente. As nanopartículas entregues adsorver o material por causa da forte afinidade de cadeias PECA na superfície das nanopartículas. A adição subsequente de água muda a conformação de nanopartículas. Em outras palavras, a nanopartícula abre sua estrutura para expor as proteínas hidrófilas interiores para o ar. Como um resultado desta alteração conformacional, a superfície do material revestido hidrofílico ⁸ voltas. Para entender isso alteração conformacional de nanopartículas, esta situação é mimetizado por colocar as nanopartículas em diversas soluções de etanol e monitorização do potencial zeta.

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Figura 1. Potencial Zeta e do diâmetro das nanoparticulas produzidas em etanol Soluções Vários A queous. Este gráfico mostra que cada nanopartícula muda a sua conformação e a sua superfície torna-se hidrofílica como o teor de etanol do meio de suspensão diminui. Este é o mecanismo de funcionamento do revestimento hidrófilo com nanopartículas. As barras de erro representam o erro padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 1 mostra que a nanopartícula preparado em etanol aquoso a 68% é desintegrado em partículas mais pequenas como o meio de suspensão circundante contem menos de etanol, a partir de 68% a 50%. Nesta gama de teor em etanol, de barras de erro potencial zeta são grandes, o que significa que o distribuição de carga superficial é bastante amplo e as partículas não são bem estabilizada. À medida que o conteúdo de água aumenta, o valor absoluto do potencial zeta aumenta rapidamente até que o teor de etanol diminui para 30%. Isto significa que a superfície de cada um de nanopartículas é altamente carregada e a hidrofilicidade da superfície da partícula é aumentada significativamente. Depois disso, o potencial zeta não muda muito por causa nanopartículas formar agregados. Esta formação de agregados não acontece quando a suspensão de nanopartículas é usado para o revestimento hidrofílico porque as partículas são adsorvidas sobre a superfície dos materiais. Em suma, o processo para o revestimento hidrofílico envolve a pulverização da suspensão de nanopartículas, de adsorção das nanopartículas sobre a superfície do material do alvo, e a exposição de moléculas de proteínas internas para o ar. Na realidade, todo o processo de revestimento tem lugar em menos de um minuto.

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Figura 2. Imagem SEM de adsorvida nanopartículas. MEV mostra a distribuição de nanopartículas sobre a superfície de uma placa de vidro. Por causa das nanopartículas uniformemente distribuídas, a transmitância da luz visível não é afetado significativamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como resultado do revestimento com nanopartículas, as partículas são adsorvidos sobre a superfície do material do alvo. A Figura 2 mostra as nanopartículas adsorvido na superfície de uma placa de vidro. Esta imagem foi tirada com uma Field Emission-Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV). Esta imagem SEM mostra que todos os tamanhos de partículas parecem menores do que 100 nm. Uma vez que a amostra foi revestida por crepitação antes da imagem SEM, no entanto, não deve haver alguma diminuição do tamanho de partícula duranteEste processo. Esta imagem SEM mostra que as nanopartículas são bem dispersa na superfície de uma placa de vidro e há espaços entre as partículas suficientes para que a luz passe através. Esta distribuição espacial das partículas e o tamanho pequeno das partículas (isto é., De tamanho menor do que o comprimento de onda da luz visível) explicar por que a transparência da placa de vidro não é muito afectado pelo revestimento.

	antes do revestimento	após o revestimento
Vidro	25,5 ° ± 1,5	8,9 ± 0,8 °
Poliestireno	52,7 ± 1,2 °	6,8 ± 0,8 °

Tabela 1: Ângulo de Contato de Substratos Antes e depois do revestimento com nanopartículas.

A Tabela 1 apresenta os dados experimentais medidos por um ângulo de contacto dinâmico (DCA) instrumento. Neste teste, o método de placa de Wilhelmy foi utilizado para determinar o efeito de revestimento de nanopartículas na molhabilidade da superfície ^9. Para a medição do ângulo de contacto, as amostras foram preparadas por meio de imersão de placas feitas de material a ser testado para a suspensão de nanopartículas e lavagem com uma corrente de água destilada durante alguns segundos. A placa preparada foi consecutivamente imersos em e removido de água destilada. Curvas relativas a tensão interfacial para a profundidade de imersão foram representados graficamente e usadas para calcular o ângulo de contacto retrocedente ^{de 10.} Na tabela, é mostrado que a tensão superficial de dois exemplos, vidro e plástico (poliestireno), caide forma significativa após o revestimento.

Figura 3. Demonstração de Hidrofílico de revestimento (1). A metade direita da superfície de plástico de policarbonato foi revestido com nanopartículas, enquanto que a metade esquerda foi não revestido. Quando toda a superfície era aspergido com um pulverizador de água, superfície revestida não formar gotas de água. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O efeito de revestimento pode ser facilmente visualizado através da comparação do efeito molhante, antes e após o revestimento. A Figura 3 demonstra o efeito de revestimento hidrofílico sobre a superfície de um plástico, de policarbonato. Enquanto a metade direita da superfície superior foi revestida, a metade esquerda estava intacto. Aspersão sobre as surface destas superfícies demonstra claramente o efeito de revestimento. As formas metade direita de uma muito fina película de água, enquanto que a metade esquerda formam gotículas de água que mostram que a água não molhar a superfície.

Figura 4. Demonstração de hidrófilo Coating (2). Janela do banco do motorista de um automóvel foi revestido com nanopartículas enquanto a janela do passageiro traseiro era sem revestimento. Quando ambas as janelas foram aspergidos com um pulverizador de água, superfície revestida não formar gotas de água. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para demonstração adicional, a nanopartícula produzido foi pulverizado sobre a superfície de vidro automático (Figura 4). janela banco do motorista foi revestido comnanopartículas, enquanto a janela do passageiro traseiro não foi revestida. Quando a água foi pulverizada sobre ambas as janelas de vidro, a água pulverizada formada uma camada fina de água sobre o vidro revestido, enquanto as gotas de água são formadas sobre o vidro não revestido. Esta foto demonstra claramente que o vidro revestido oferece muito melhor visibilidade do que um não revestido.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethyl cyanoacrylate (ECA) monomer	K&R International (Laguna Niguel, CA)	I-1605	Any pure ECA can be used.
Gliadin	MGP Ingredients, Inc (Atchison, KS)	Gift from the company	Gliadin can be purchased from Sigma-Aldrich (cat #: G3375-25G). Instead of gliadin, any commercial  gluten can be used.
HCl	Any		Any reagent grade chemical can be used.
Acetone	Any		Any reagent grade chemical can be used.
Methanol	Any		Any reagent grade chemical can be used.
Ethanol (100%)	Any		Any reagent grade chemical can be used.
Filter paper	Any		Any grade filter paper larger than 10 cm can be used.
Cell culture square dish	Any		Any dish larger than 20 x 20 cm can be used.
Coffee grinder	Any		Any coffee grinder can be used.
Rotary evaporator	Any		Any rotary evaporator can be used.
Freeze Dryer	Any		Any freeze dryer that can reach -70 °C can be used.
Centrifuge	Any		Any centrifuge that can apply 1,000 x g can be used.
Magnetic stirrer	Any		Any magnetic stirrer that can turn spin bar to 1,000 rpm can be used.
Dynamic Light Scattering (DLS)	Brookhaven Instruments Corporation	NanoBrook Omni Zeta Potential Analyzer	DLS from any company can be used.
Scanning Electron Microscope (SEM)	Carl Zeiss Inc.		Any SEM can be used.
Dynamic Contact Angle (DCA)	Thermo Cahn Instruments		Any DCA can be used.