Summary
Cellen groeien in een driedimensionale (3-D) milieu vormen een duidelijke verbetering ten opzichte celkweek in 2-D omgevingen (bijvoorbeeld kolven of schalen). Hier beschrijven we de ontwikkeling van een meercellige 3-D model van het organotypische menselijke darmslijmvlies gekweekt onder microzwaartekracht door roterende-wall-vat (RWV) bioreactoren.
Abstract
Omdat cellen groeien in een driedimensionale (3-D) omgeving hebben het potentieel om vele gaten van celkweek in 2-D omgevingen (bijv., Kolven of schalen) te overbruggen. In feite wordt algemeen erkend dat cellen gekweekt in kolven of schotels neiging te de-differentiëren en verliest speciale functies van het weefsel waarvan ze zijn afgeleid. Momenteel zijn er in hoofdzaak twee types van 3-D kweeksystemen waarbij de cellen worden gezaaid in steigers nabootsen van de natieve extracellulaire matrix (ECM): (a) statische modellen en (b) modellen met bioreactoren. De eerste doorbraak was de statische 3-D modellen. 3-D-modellen met bioreactoren zoals de draaiende-wall-vat (RWV) bioreactoren zijn een meer recente ontwikkeling. Het originele concept van de RWV bioreactoren ontwikkeld aan NASA Johnson Space Center in de vroege jaren 1990 en wordt beschouwd als de beperkingen van statische modellen overwinnen zoals de ontwikkeling van hypoxische, necrotische kernen. De RWV bioreactoren kunnen omzeilen this probleem op door vloeistofdynamica dat efficiënte diffusie van voedingsstoffen en zuurstof toe. Deze bioreactoren bestaan uit een rotator basis die dient ter ondersteuning en draaien twee verschillende formaten kweekvaten die verschillen door hun beluchting brontype: (1) traagdraaiende Laterale Vessels (STLVs) met een coaxiaal oxygenator in het centrum, of (2 ) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) met zuurstof via een platte, siliconenrubber gas overdracht membraan. Deze schepen toelaten efficiënt gas overdracht terwijl het vermijden van de vorming van bubble en de daaruit voortvloeiende onrust. Deze omstandigheden leiden tot een laminaire stroming en minimale dwarskracht die modellen verminderde zwaartekracht (microzwaartekracht) in het kweekvat. Hier beschrijven we de ontwikkeling van een meercellige 3-D model van het organotypische menselijke darmslijmvlies uit een intestinale epitheliale cellijn en primaire humane lymfocyten, endotheelcellen en fibroblasten gekweekt onder microzwaartekracht door de RWV bioreactor. </ P>
Introduction
De eerste doorbraak in de opbouw van een 3-D model werd gemeld in het begin van 1980 Toen men verschillende types van de steiger (bijv., Laminine, collageen type I, collageen IV, en fibronectine) en cocktails van groeifactoren te verbeteren onderzoeken cel-tot-cel en ECM interacties van "statische" 3-D modellen 1-7. Sindsdien is het grootste probleem van deze modellen zijn beperkingen bij de overdracht van voedingsstoffen en zuurstof in het medium en weefselconstructen 8. In tegenstelling tot cellen in de in vivo omgeving met een constante stroom van voedingsstoffen en zuurstof uit aangrenzende netwerken van bloedvaten ontvangt, de statische aard van deze modellen belemmert doelmatige verwerking ervan aan de cellen. Zo zal celaggregaten gegenereerd in vitro statische modellen die enkele millimeters groot overschrijdt onveranderlijk ontwikkelen hypoxische, necrotische kernen 9. De RWV bioreactoren kan dit probleem te omzeilendoor vloeistofdynamica dat efficiënte diffusie van voedingsstoffen en zuurstof 10-12 laten. Tot op heden, werk met behulp RWV bioreactoren zijn beperkt tot het opnemen van een of twee celtypen 13-17. Bovendien, in plaats van een ruimtelijke oriëntatie Soortgelijke natieve weefsels die cellen gevormd celaggregaten. De belangrijkste reden voor deze beperking is het ontbreken van een scaffold kunnen cellen nemen in een geïntegreerde manier geweest. De steigers worden gebruikt in de RWV bioreactoren tot op heden bestaan, op enkele uitzonderingen na 16-18, voornamelijk van synthetische microbolletjes, buisvormige cilinders of kleine vellen 13-15,19-23. Dit zijn stijve materialen waarvan de samenstelling en flexibiliteit kan worden gemanipuleerd, en welke cellen gehecht aan hun oppervlak. Derhalve is het onwaarschijnlijk dat deze modellen een systeem waarin evalueren dienen met een geïntegreerde wijze de verschillende celcomponenten zoals bindweefselcellen (bijv. Fibroblasten, immuun- en endotheelcellen) die ishould worden verspreid binnen het schavot om menselijk weefsel na te bootsen.
Hier beschrijven we de ontwikkeling van een meercellige 3-D model van het organotypische menselijke darmslijmvlies uit een intestinale epitheliale cellijn en primaire humane lymfocyten, endotheelcellen en fibroblasten 24. Deze cellen werden gekweekt onder microzwaartekracht te verschaffen door de RWV bioreactor 13,25-30. In het 3-D-model, het ECM bezit vele verschillende eigenschappen, zoals een osmolaliteit vergelijkbaar met het kweekmedium (bijv., Verwaarloosbare diffusie beperkingen in cultuur) en het vermogen om cellen en andere relevante extracellulaire matrixeiwitten nemen, evenals de geschikte stijfheid voor gebruik in bioreactoren 24. Biologische systemen zijn zeer complex, en de afgelopen jaren is er een verschuiving in de focus van mucosale onderzoek naar het onderzoek van de cel interacties met hun omgeving geweest in plaats van ze te bestuderen in isolation. In het bijzonder wordt het belang van cel-cel interacties in het beïnvloeden intestinale celoverleving en differentiatie goed gedocumenteerd 31-34. Met name de communicatie tussen epitheliale cellen en hun niche heeft een grote invloed op de epitheelcellen expansie en differentiatie 35. Inderdaad wordt algemeen aangenomen dat niet alleen de cel-cel maar ook cel-ECM interacties zijn essentieel voor het onderhoud en differentiatie van epitheelcellen in 3-D cultuurmodellen. Eerdere studies hebben aangetoond dat darm ECM eiwitten zoals collageen I 24,36,37, 38 laminine en fibronectine 39 zijn belangrijk bij het beïnvloeden van darmepitheelcellen tot ruimtelijke oriëntatie vergelijkbaar met de natieve verwerven mucosa. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe technologieën, zoals onze 3-D model 24, dat kan nabootsen de fenotypische diversiteit van de darm vereist als onderzoekers gaan de complexe cellulaire en structurele architectuur recreërenen functie van de darm micromilieu. Deze modellen vormen een belangrijk instrument voor de ontwikkeling en evaluatie van nieuwe orale geneesmiddelen en vaccins kandidaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek statement: Alle bloedmonsters werden verzameld uit vrijwilligers die deelnamen aan protocol nummer HP-00.040.025-1. De Universiteit van Maryland Institutional Review Board goedkeuring van dit protocol en toestemming gegeven voor de inzameling van bloedmonsters van gezonde vrijwilligers voor de studies in dit manuscript. Het doel van deze studie werd uitgelegd aan vrijwilligers, en alle vrijwilligers gaven geïnformeerd ondertekende toestemming voor de bloedafname.
Opmerking: Zie tabel 1 voor middelgrote supplement voorbereiding. Zie tabel 2 voor de bereiding van de 3-D kweekmedia.
1. Voorbereiding van Cultuur Schepen
- Schroef de dop van de vulopening van de ml-schip 50 en vul met 50 ml steriel kweekmedium (bijv., RPMI). Voer alle procedures onder steriele omstandigheden in een laminaire kap.
- Plaats de dop en veeg gemorste medium op elk oppervlak met 70% ethanol.
- Laat het vaartuig incubaten minstens 15 min op O / N bij kamertemperatuur.
- Gebruik de vulpoort aan het kweekmedium verwijderen en voeg 30 ml van 3-D kweekmedium.
- Veeg eventueel gemorste medium op elk oppervlak met 70% ethanol.
2. Bereiding van de cellen
- Human epitheliale cellijn (HCT-8) 24,40.
- Kweekcellen in RPMI gesupplementeerd met 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 50 ug / ml gentamicine, 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 10 mM HEPES buffer en 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS ) (bijlage 1). Bij 70% confluentie, split cellen bij een verhouding van 1: 5.
- Human colon fibroblasten (CCD-18Co cellen) 24,41.
- Kweekcellen in Basal Eagle's medium verrijkt met supplement 1 Bij confluentie splitsen cellen in een verhouding van 1:. 3.
- Menselijke navelstreng endotheel (HUVEC) cellen
- Kweekcellen in Endotheliale Basal Medium (EBM) medium aangevuld met 100 ug / ml heparine, 3 ug / ml endotheliale celgroei Supplement (ECGS), en vullen 1 Bij 70% confluentie, split cellen bij een verhouding van 1:. 2.
- Isoleer Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) uit bloed door dichtheidsgradiënt centrifugering met standaardtechnieken 43.
- Kort samengevat, met een ml-pipet 10, wordt voorzichtig 30 ml verdund bloed (1: 1 bloed fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)) in een 50 ml conische buis met 10 ml dichtheidscentrifugatie media. Na de centrifugatie stap zal lymfocyten en monocyten bevinden zich in de "witte" laag tussen de dichtheid centrifugatie media en plasma lagen.
- Verzamel de witte laag met behulp van een overdracht pipet. Vermijd granulocyten besmetting door het beperken van het verzamelen van de dichtheid centrifugeren media. Na wassen 43, use PBMC zoals is of gecryopreserveerd in vloeibare N2.
Opmerking: Het is van belang te benadrukken dat grotendeels uit PBMC van lymfocyten en monocyten, terwijl een klein deel van dendritische cellen en andere celtypen.
3. Bereiding van collageen ingebedde cellen
- Bepaal het aantal inserts nodig is gebaseerd op het aantal experimentele condities te worden opgezet. Plaats het juiste aantal inserts in de putjes van een 6-wells plaat.
- Maak een suspensie van HUVEC en fibroblasten:
- Was de kolven tweemaal in PBS en los van de cellen met behulp van trypsine, 0,25% (1x) met 0,05% trypsine-tetranatriumethyleendiaminetetraacetaat (trypsine-EDTA). Voeg genoeg trypsine oplossing voor het geheel van de celkweek oppervlak bedekken. Detachement gebeurt meestal binnen 5 tot 15 minuten
- Verzamelenlosgemaakte cellen in een 50 ml-buis met 30 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) -30% FBS medium.
- Centrifugeer de buis bij 500 xg gedurende 10 min.
- Resuspendeer de cellen in 30 ml DMEM-30% FBS medium.
- Tel het aantal levensvatbare cellen door het verdunnen van 20 ul van de geresuspendeerde cellen met 20 pi trypan blauwe kleurstof. Laad de hemocytometer de cel mengsel. Levensvatbare PBMCs wordt wit duidelijk zijn; levensvatbaar PBMC zal de kleurstof verwerven en blauw worden.
- Resuspendeer elk celtype in DMEM-30% FBS medium in een concentratie van 5-8 x 10 7 cellen ml - 1.
- Bereid celbevattende collageengels
Opmerking: Elk vaartuig de bereiding van ~ 5 ml celbevattende collageengel vereisen.- In een 50 ml kegelvormig buisje bereiden collageen mengsel door het toevoegen van 1 x DMEM medium, aangevuld met 50 ug / ml gentamicine, 2 mM L-glutamine en 10% hitte-inactivated FBS plus 3 mg / ml collageen-I, 10 ug / ml laminine, 40 ug / ml collageen IV, 10 ug / ml fibronectine, 2 ug / ml heparine sulfaat proteoglycanen en 15 mM NaOH (tot de fysiologische pH te bereiken).
- Sluit de buis en meng door een paar keer om te keren tot het mengsel volledig is gehomogeniseerd. Vermijd belvorming.
BELANGRIJK: Houd het mengsel op ijs om gelvorming te voorkomen.- Cruciale stap: Indien het mengsel een zuur ontwikkelt uiterlijk (geelachtige kleur), enkele druppels steriel 1 N NaOH om het mengsel te neutraliseren.
- Voeg geconcentreerd HUVEC en fibroblasten bij een dichtheid van 1,0-1,2 en 1,5-2,0 x 10 6 cellen / ml van het verrijkt collageen-mengsel (hierboven beschreven). Sluit de buizen en meng door een paar keer om te keren tot het mengsel volledig is gehomogeniseerd. Vermijd belvorming. BELANGRIJK: Houd het mengsel op ijs om gelvorming te voorkomen.
- Voeg 4-5 ml van de celbevattende collageengel om elke insert, vooraf geladen in een 6 wells plaat en men liet gelify in de kap met weinig of geen beweging 1 uur.
- Na 1 uur en spoel de 6-well plaat een 37 ° C, 5% CO2 incubator 1 - 2 extra uren.
- Zet de 6-well plaat aan de kap, en met behulp van een steriele pincet en scalpel aseptisch afgesneden het membraan van het inzetstuk losmaken van de celbevattende gel van het membraan. Snijd de vrijstaande gel in kleine vierkantjes (~ 5 x 5 mm).
- Voeg de kleine-cel met vierkanten in een 50-ml HARV via de vulpoort.
- Maak een suspensie van HCT-8 epitheelcellen:
- Was de kolven tweemaal in PBS en los de cellen met behulp van trypsine, 0,25% (1x) met trypsine-EDTA behandeling. Voeg genoeg trypsine oplossing voor het geheel van de celkweek oppervlak bedekken. Detachement gebeurt meestal binnen 10 tot 15 minuten.
- Verzamel losgemaakte cellen in 30 ml DMEM-30% FBS medium.
- CENTRIFUGE DMEM-30% FBS medium bevattende buis bij 500 xg gedurende 10 min.
- Resuspendeer de cellen in 30 ml DMEM-30% FBS medium.
- Tel het aantal levensvatbare cellen zoals beschreven in 3.2.5.
- Resuspendeer de HCT-8 epitheelcellen in DMEM-30% FBS medium in een concentratie van 10 7 cellen ml - 1.
- Voeg 1 ml van de geconcentreerde HCT-8 epitheelcellen in de 50 ml HARV via de vulpoort.
- Via de vulpoort, voeg extra 3-D kweekmedium tot het vaartuig bijna vol (~ 20 ml).
- Plaats de dop en veeg de lip van de vulling haven met 70% ethanol.
- Plaats een spuit in elke spuit haven van de RWV: plaats een 5 ml-spuit met 3-4 ml 3-D kweekmedium in een poort en een 5 ml-lege spuit in de andere poort.
- Verwijder alle zichtbare luchtbellen door trekken in de lege injectiespuit terwijl ongeveer hetzelfde volume medium wordt geïnjecteerd door de andere spuit poort.
- Plaats de vessel in de bioreactor, zet de kracht en de snelheid tot ongeveer 13 tot 14 omwentelingen per minuut.
Let op: Kritische stap: Rotatie snelheid kan het nodig zijn een paar keer aan te passen tijdens een experiment om de cellen een baan in het vat, waardoor het contact met de vaatwanden te voorkomen te behouden. - Kweekcellen bij 37 ° C, 5% CO 2 onder microzwaartekracht, door de RWV bioreactor.
- Change kweekmedium elke 3-4 dagen door het vervangen van ongeveer 30 ml met verse 3-D kweekmedium.
- Na 4 dagen (± 1 dag), verwijder de schepen uit de bioreactor en voeg lymfocyten / monocyten naar de vaten (2 x 10 7 / vat).
- Plaats de vaten opnieuw in de bioreactor bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende nog eens 5 dagen (± 1 dag).
- Na nog 5 dagen (dag 9 van de cultuur), voeg lymfocyten / monocyten aan de vaten (2 x 10 7 / vat) en verder de kweken tot 12 extra dagen. Change kweekmedium elke 3-4 dagen door het vervangen van ongeveer 30 ml met verse 3-D kweekmedium.
4. Oogsten 3-D Cultures for histologie
- Met behulp van een transferpipet oogst elke kleine gelfragment, nu "construeren" in een zes-well plaat met 10 ml 10% formaline buffer. Laat gedurende 3 uur bij kamertemperatuur of gedurende 12-16 uur bij 4 ° C.
- Bereid het weefsel verwerking en inbedding cassettes door het merken en het toevoegen van twee stukken van biopsie foam pads in elke cassette.
- Dompel de cassettes in 10% formaline buffer.
- Met behulp van forceps plaats de vaste-constructen tussen de beide vullingen.
- Dompel de cassettes in 10% formaline buffer.
- Ga verder met de standaard procedures voor het inbedden, snijden en vlekken 44.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eerder hebben we een meercellige 3-D model van het organotypische menselijke darmslijmvlies bestaat uit een intestinale epitheliale cellijn en primaire humane lymfocyten, endotheelcellen en fibroblasten gekweekt onder microzwaartekracht 24 (figuur 1) ontworpen. Fibroblasten en endotheelcellen werden ingebed in een matrix collageen I verrijkt met extra darm kelder membraaneiwitten 45 (bijv., Laminine, collageen IV, fibronectine en heparine sulfaat proteoglycanen) en toegevoegd aan bioreactoren RWV. Na 10-15 dagen, histologische kleuring analyse toonde de aanwezigheid van villus-achtige structuren in de constructen. Ongeveer 60-80% van deze epitheelcellen georganiseerd als een monolaag van gepolariseerde cellen met hun kernen in basaal locatie nabij het ECM, hetgeen een belangrijk kenmerk van goed-gedifferentieerde cellen (figuur 2).
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 1: Schema van de bouw van de 3-D model. Vier stappen nodig om de 3-D te bouwen. Ten eerste, het vereiste aantal cellen te verkrijgen tot het 3-D model, een humane intestinale epitheliale cellijn enterocyt (HCT-8) en primaire humane endotheelcellen en fibroblasten worden gekweekt als 2-D confluente monolagen genereren. Ten tweede, de ECM uit collageen I matrix verrijkt met extra darm basaalmembraan eiwitten (bijv., Laminine, collageen IV, fibronectine en heparine sulfaat proteoglycan) bereid. Ten derde, fibroblasten en endotheliale cellen zijn ingebed in een collageen-I mengsel en toegevoegd aan bioreactoren waarna de toevoeging HCT-8 epitheelcellen RWV. Ten vierde zijn primaire lymfocyten toegevoegd aan de kweek op dag 4 en 9 (± 1 dag)."> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking tussen de normale menselijke darm en de organotypische Models. Hematoxyline en eosine kleuring van cellen gekweekt in de 3-D microzwaartekracht model: weefsels werden paars gekleurd en steiger gekleurd roze. Cellen van de 3-D model werden gedurende 14 ( "a" en "b") en 20 dagen (c). Twintig dagen na het zaaien, zijn totale aantal cellen onderhouden, en cellen waren goed gedifferentieerd showing villus-achtige functies. De beelden worden getoond bij 100X ( "a" en "b") en 40X ( "c") vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| productnaam | Pkg. Grootte | reconstitutie | werkconcentratie | opslagruimte |
| Fibroblast groeifactor-Basic (bFGF) | 25 mg | Tot 25 ug / ml voorraad oplossing voor te bereiden; Voeg 25 ug FGF in 1 ml steriel medium (RPMI plus 1% FCS), werveling op te lossen, voeg 100 ul / monster | 5 ng / ml | poeder -20 o C, werken porties -20 o C, vermijd herhaalde vries / dooi |
| Stem Cell Factor (SCF) | 10 mg | Tot 10 ug / ml voorraad oplossing voor te bereiden; voeg 10 ug van SCF in 1 ml steriel medium (RPMI plus 1% FCS), werveling op te lossen, voeg 250 ul / monster | 5 ng / ml | poeder -20 o C, werken porties -20 o C, vermijd herhaalde vries / dooi |
| Hepatocytgroeifactor (HGF) | 5 mg | Tot 5 ug / ml voorraad oplossing voor te bereiden; voeg 5 ug van HGF in 1 ml steriel medium (RPMI plus 1% FCS), werveling op te lossen, voeg 200 ul / monster | 2 ng / ml | poeder -20 o C, werken porties -20 o C, vermijd herhaalde vries / dooi |
| endotheline 3 | 50 mg | Tot 50 ug / ml voorraad oplossing voor te bereiden; voeg 50 ug van endotheline in 1 ml steriel medium (RPMI plus 1% FCS), werveling op te lossen, voeg 100 ul / monster | 10 ng / ml | poeder -20 o C, werken porties -20 o C, vermijd herhaalde vries / dooi |
| laminine | 1 mg | Ontdooien langzaam bij 2-8 o C, kolken en voeg 100 ul / monster | 10 mg / ml | vloeibare -20 o C, werken porties -20 o C, vermijd herhaling freeze / dooi |
| Vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) | 10 mg | Tot 5 ug / ml voorraad oplossing voor te bereiden; voeg 10 pg VEGF in 2 ml steriel water, werveling te lossen, voeg 100 ul / monster | 1 ng / ml | poeder -20 o C, werken porties -20 o C, vermijd herhaalde vries / dooi |
| Leukemie Remmende Factor (LIF) | 50 mg | Ter voorbereiding van 20 ug / ml voorraad oplossing; voeg 50 ug van LIF in 2,5 ml steriel water, werveling op te lossen, voeg 100 ul / monster | 4 ng / ml | poeder -20 o C, werken porties -20 o C, vermijd herhaalde vries / dooi |
| adenine | 25 g | Tot 0,18 M voorraadoplossing te bereiden; voeg 121,5 mg og adedine in 50 ml 0,05 M HCl (250 ul van 37,1% HCl in 50 ml water)), werveling op te lossen, filter steriliseren envoeg 1 ml / monster | 1,8 x 10 -3 M | poeder 4 o C, werken porties -20 o C, vermijd herhaalde vries / dooi |
| Insuline | 50 mg | Tot 5 mg / ml voorraad oplossing voor te bereiden; voeg 50 mg insuline in 10 ml 0,005 M HCl (5 gl 37,1% HCl in 10 ml water)), werveling te lossen, filter gesteriliseerd en voeg 0,5 ml / monster | 5 mg / ml | poeder -20 o C, werken porties -20 o C, vermijd herhaalde vries / dooi |
| T3 | 100 mg | Tot 2 x 10 -8 M voorraad oplossing voor te bereiden; voeg 3,4 mg T3 in 25 ml 1 M NaOH Verdun 0,1 ml van deze oplossing in 9,9 ml PBS verdund nogmaals 0,1 ml van deze oplossing in 9,9 ml PBS, werveling te lossen, filter gesteriliseerd en voeg 0,5 ml / monster | 2 x 10 -11 M | poeder -20 o C, werken porties -20 <sup> o C, vermijd herhaalde vries / dooi |
| cholera toxine | 5 mg | Om 10 -7 M voorraad oplossing voor te bereiden; voeg 5 mg van cholera toxine in 5 ml steriele DDH 2 O (bewaar bij -20 ° C); Verdun 50 ul van deze oplossing in 5 ml DDH 2 O, werveling te homogeniseren, filter steriliseren en voeg 0,5 ml / monster | 10 -10 M | poeder 4-8 o C, werken porties -20 o C, vermijd herhaalde vries / dooi |
| fibronectine | 1 mg | Tot 1 mg / ml voorraad oplossing voor te bereiden; voeg 1 mg van fibronectine in 1 ml steriel distiled water. Laat 30 min. voor het materiaal om te gaan in de oplossing. NIET roeren of over SWIRL. Voeg 100 ul / monster | 10 mg / ml | poeder 4-8 o C, werken porties -20 o C, vermijd herhaalde vries / dooi |
| apo-transferrine | 100 mg Ter voorbereiding van 5 mg / ml voorraad oplossing (1000x); voeg 100 mg transferrine in 20 ml PBS werveling te lossen, filter gesteriliseerd en voeg 0,5 ml / monster | 5 mg / ml | poeder -20 o C, werken porties -20 o C, vermijd herhaalde vries / dooi | |
| heparine | 50 KU | Ter voorbereiding van 50 mg / ml voorraad oplossing (1000x); voeg 50 mg van heparine in 1 ml water werveling op te lossen, filter steriliseren en voeg 1 ml / monster | 0,1 mg / ml | poeder -20 o C, werken porties -20 o C, vermijd herhaalde vries / dooi |
| Heparansulfaatproteoglycan | 1 mg | Tot 0,1 mg / ml voorraad oplossing voor te bereiden; voeg 1 mg van heparansulfaat in 10 ml steriel water werveling op te lossen, en voeg 0,2 ml / monster | 2 mg / ml | poeder -20 o C, werken porties -20 o C, vermijdrepeat vries / dooi |
| collageen IV | 5 mg | Ter voorbereiding 2 mg / ml voorraad solutin: voeg 2 mg collageen V in 2,5 ml steriel 0,25% azijnzuur. Laat 1-2 uur voor het materiaal in oplossing te gaan Werveling voor een betere verdunning.. Voeg 400 ul / monster | 80 mg / ml | poeder -20 o C, werken porties -20 o C, vermijd herhaalde vries / dooi |
Tabel 1: Defined Medium Supplement Voorbereiding.
| F-12 medium aangevuld met | |||
| Reagens | voorraadoplossing | Uiteindelijke oplossing | Bedrag |
| Foetaal kalfsserum | 10% | 50 ml | |
| natriumpyruvaat | 100 mM | 1 mM | 5 ml |
| L-Glutamine | 200 mM | 2 mM | 5 ml |
| Hepes | 1 M | 10 mM | 5 ml |
| gentamicine | 50 mg / ml | 50 ug / ml | 500 gl |
| Penicilline / streptomycine | 10.000 U / ml / 10 mg / ml | 100 U / ml / 100 ug / ml | 5 ml |
| Insuline | 5 mg / ml | 5 ug / ml | 500 gl |
| T3 | 2 x 10-8 M | 2 x 10 -11 M | 500 gl |
| adenine | 1.8 x 10-1 M | 1.8 x 10-3 M | 5 ml |
| transferrine | 5 ug / ml | 500 gl | |
| heparine | 50 mg / ml | 0,1 mg / ml | 1 ml |
| ECGS | 3 mg / ml | 3 ug / ml | 5 ml |
| bFGF | 25 ug / ml | 5 ng / ml | 100 gl |
| SCF | 10 ug / ml | 5 ng / ml | 250 gl |
| HGF | 5 ug / ml | 2 ng / ml | 200 gl |
| endotheline 3 | 50 ug / ml | 10 ng / ml | 200 gl |
| LIF | 20 ug / ml | 4 ng / ml | 100 gl |
| VEGF | 5 ug / ml | 1 ng / ml | 100 gl |
| Choleran toxine | 10 -7 M | 10 -10 M | 500 gl </ Td> |
| Opmerking: Bij de genoemde hoeveelheid voor de bereiding van 500 ml van 3-D kweekmedia. Media moeten worden bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken | |||
Tabel 2: Bereiding van 3-D Culture Media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript beschrijven we de ontwikkeling van een bioengineered model van het menselijke darmslijmvlies omvat veelvouden celtypen waaronder primaire humane lymfocyten, fibroblasten en endotheelcellen, alsook intestinale epitheliale cellijnen 24. In deze 3-D-model, worden de cellen gekweekt in een collageen-rijke extracellulaire matrix onder microzwaartekracht omstandigheden 24.
Zoals eerder beschreven, de belangrijkste kenmerken van dit model zijn: (i) het vermogen om de epitheelweefsel monolaag organisatie nabootsen, (ii) de inductie van geschikte polariteit van epitheelcellen, tight junctions, desmosomen en microvilli, (iii) een lange- termijnkweek (tot 20 dagen) met een hoge levensvatbaarheid van de primaire cellen (bijv. fibroblasten en endotheliale cellen), (iv) de expressie het weefselachtige differentiatiekenmerken waaronder villin, cytokeratine, E-cadherine en mucin, (v) het vermogen om aanzienlijke hoeveelheden van cytokinen (bijv. IL-8) en alkalische fosfatase na antigene stimulatie, (vi) het transport van voedingsstoffen zoals glucose (bijv. expressie van disaccharidasen en aanwezigheid van suiker transporters), en (vii) de multi-lijn differentiatie van intestinale epitheelcellen (bijv., absorptieve enterocyten, globet en M cellen) 24.
Het is belangrijk te benadrukken dat reproduceerbare resultaten te bereiken met behulp van onze 3-D model van de onderzoeker moet zich houden aan goede celkweek richtlijnen 46-48. Het is cruciaal om systematisch te controleren cellen voor levensvatbaarheid, mycoplasma vervuiling en veranderingen in de celgroei gedrag. Als er een probleem is geïdentificeerd, er eerst voor zorgen dat er geen ongeautoriseerde wijzigingen zijn aangebracht aan het protocol. Als het probleem aanhoudt, over te schakelen naar een nieuwe batch van de verschillende medium componenten (met inbegrip van serum) en /of cellen. Een beperking van onze 3-D model is het gebruik van tumorigene HCT-8 epitheliale cellijn. Het is echter belangrijk om te overwegen dat de aanwezigheid van HCT-8 lijn biedt het voordeel dat in de handel verkrijgbaar. Bovendien hebben deze epitheelcellen evenmin klassieke of niet-klassieke humane leukocyten antigeen (HLA) uiten-klasse I moleculen 49,50. Zo laten ze de cultuur van epitheelcellen met PBMC van verschillende HLA-klasse I haplotypen bij afwezigheid van epitheelcel-PBMC alloreactiviteit. Bovendien, bij het vergelijken van dit systeem met systemen zoals de darm stamcel organoids 51-53, dit model biedt vele voordelen. Hoewel gut stamcel organoids leveren waardevolle informatie over celbiologie en intestinale differentiatie 51-53, dit model maakt het mogelijk direct apicale blootstelling aan voedingsstoffen, drugs en ziekteverwekkers. Dit model biedt ook gemakkelijk toegang tot luminale inhoud van dergelijke antimicrobiële peptiden en cytokines. In tegenstelling organoids zijn compact unhaar met een luminale oppervlak naar binnen. Bijgevolg is er een beperkte hoeveelheid product die in de organoïde kan worden ingebracht lumen 54.
Wij geloven dat onze meercellige 3-D organotypische model van het menselijk darmslijmvlies heeft brede potentieel als een instrument voor ontdekking in zowel de gezondheid en ziekte, met inbegrip van de interactie met pathogenen, antigen mensenhandel, en inflammatoire en metabolische processen 24. Tenslotte vanwege de aard van meercellige onze 3-D-model, ons model kon gain en verlies-studies inschakelen behulp immuunceltypen die waarschijnlijk epitheelcellen te beïnvloeden in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor | Synthecon | RCCs-4DQ | For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available. |
| Disposable 50 ml-vessel | Synthecon | D-405 | Box with 4 vessels |
| HCT-8 epithelial cells | ATCC | CCL-244 | |
| CCD-18Co Fibroblasts | ATCC | CRL-1459 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | CRL-1730 | HUVEC |
| Fibroblast Growth Factor-Basic | Sigma | F0291 | bFGF |
| Stem Cell Factor | Sigma | S7901 | SCF |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | HGF |
| Endothelin 3 | Sigma | E9137 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Vascular Endothelial Growth Factor | Sigma | V7259 | VEGF |
| Leukemia Inhibitory Factor | Santa Cruz | sc-4377 | (LIF |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Insulin | Sigma | I-6634 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T-6397 | T3 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Fibronectin | BD | 354008 | Isolated from human plasma |
| apo-Transferrin | Sigma | T-1147 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Heparan sulfate proteoglycan | Sigma | H4777 | Isolated from basement membrane of mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | Isolated from human placenta |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| D-MEM, powder | Invitrogen | 12800-017 | |
| 10% formalin–PBS | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Bovine type I collagen | Invitrogen | A1064401 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | MT25-052-CI | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
| Penicillin/streptomincin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Ham's F-12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010-046 | BME |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM-2 |
| Endothelial cell growth supplement | Millipore | 02-102 | ECGS |
References
- Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
- Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
- Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
- Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
- Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
- Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
- Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
- Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
- Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
- Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
- He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. , (2015).
- Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
- Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
- Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
- Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
- Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
- Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
- Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
- Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
- Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
- Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
- Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. , (2010).
- Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651 (2014).
- Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
- Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
- Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
- Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
- Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
- Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
- Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. , e51064 (2014).
- Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
- Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
- Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
- Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
- Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. , (2014).
