Summary
Des cellules en croissance dans un (3-D) environnement tridimensionnel représentent une amélioration marquée par rapport à la culture des cellules dans des environnements 2-D (par exemple, des flacons ou des boîtes). Nous décrivons ici le développement d'un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine en culture en microgravité fournies par rotation paroi vasculaire (RWV) bioréacteurs.
Abstract
Étant donné que les cellules en croissance dans un (3-D) environnement tridimensionnel ont le potentiel pour combler de nombreuses lacunes de culture cellulaire dans des milieux 2-D (par ex., Des flacons ou des boîtes). En fait, il est largement reconnu que les cellules cultivées dans des flacons ou des plats ont tendance à dé-différencier et de perdre des fonctions spécialisées des tissus à partir de laquelle ils ont été dérivés. À l'heure actuelle, il existe principalement deux types de systèmes de culture 3-D où les cellules sont ensemencées dans des échafauds mimant la matrice native extracellulaire (ECM): (a) les modèles statiques et (b) les modèles utilisant des bioréacteurs. La première percée a été les modèles statiques 3-D. modèles 3-D en utilisant des bioréacteurs tels que le mur-récipient rotatif (RWV) bioréacteurs sont un développement plus récent. Le concept original des bioréacteurs RWV a été développé au Centre spatial Johnson de la NASA au début des années 1990 et est censé pour surmonter les limitations des modèles statiques tels que le développement des hypoxiques, des noyaux nécrotiques. Les bioréacteurs RWV pourraient contourner thest le problème en fournissant la dynamique des fluides qui permettent la diffusion efficace des nutriments et de l'oxygène. Ces bioréacteurs sont constitués d'une base de la coiffe qui sert à supporter et faire tourner deux formats différents de récipients de culture qui diffèrent par leur type de source d'aération: (1) Lent Turning navires latéraux (STLVs) avec un oxygénateur de co-axiale dans le centre, ou (2 ) rapport d'aspect élevé des navires (Harvs) avec l'oxygénation via une membrane de transfert de gaz en caoutchouc de silicone plat. Ces navires permettent le transfert de gaz efficace tout en évitant la formation de bulles et de la turbulence conséquente. Ces conditions se traduisent par un écoulement laminaire et de la force de cisaillement minimale que les modèles réduits gravité (microgravité) à l'intérieur du récipient de culture. Nous décrivons ici le développement d'un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine composée d'une lignée de cellules épithéliales intestinales et les lymphocytes humains primaires, des cellules endothéliales et des fibroblastes cultivés en microgravité fourni par le bioréacteur RWV. </ P>
Introduction
La première percée dans la construction d' un modèle 3-D a été signalé au début des années 1980 , lorsque les scientifiques ont commencé à étudier les différents types de l'échafaudage (par exemple., La laminine, le collagène de type I, le collagène IV, et la fibronectine) et des cocktails de facteurs de croissance pour améliorer cellule à cellule interactions ECM de modèles 3-D "statique" et 1-7. Depuis lors, le principal problème avec ces modèles a été limitations dans le transfert des nutriments et de l' oxygène dans les moyennes et les tissus des constructions 8. Contrairement aux cellules dans l'environnement in vivo , qui reçoit un flux continu de nutriments et de l' oxygène à partir de réseaux de vaisseaux sanguins environnants, la nature statique de ces modèles entrave la distribution effective d'entre eux aux cellules. Par exemple, des agrégats de cellules générées dans des modèles in vitro statiques qui dépassent de quelques millimètres de taille invariablement développer hypoxiques, des noyaux nécrotiques 9. Les bioréacteurs RWV pourraient contourner ce problèmeen fournissant la dynamique des fluides qui permettent la diffusion efficace des nutriments et de l' oxygène 12/10. Cependant, à ce jour, le travail en utilisant bioréacteurs RWV ont été limités à l'inclusion d'un ou de deux types de cellules 13-17. En outre, au lieu d'une orientation spatiale similaire aux tissus natifs, ces cellules forment des agrégats cellulaires. La principale raison de ces limitations a été l'absence d'un échafaudage en mesure d'intégrer des cellules d'une manière intégrée. Les échafaudages utilisés dans les bioréacteurs RWV à ce jour consistent, à quelques exceptions près 16-18, principalement des microbilles synthétiques, des cylindres tubulaires ou petites feuilles 13-15,19-23. Ce sont des matériaux rigides dont la composition et la flexibilité ne peut être manipulé et auquel les cellules sont attachées à leur surface. Par conséquent, il est peu probable que ces modèles vont fournir un système permettant d'évaluer, de façon intégrée, les différents composants cellulaires tels que des cellules stromales (par ex., Des fibroblastes, des cellules immunitaires et endothéliales) qui should être dispersé dans l'échafaudage pour imiter étroitement le tissu humain.
Nous décrivons ici le développement d'un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine composée d'une ligne intestinale des cellules épithéliales et les lymphocytes humains primaires, les cellules endothéliales et les fibroblastes 24. Ces cellules ont été cultivées en microgravité fournir par le bioréacteur RWV 13,25-30. Dans notre modèle 3-D, l'ECM possède plusieurs propriétés distinctes, comme une osmolalité similaire à celle du milieu de culture (par ex., Des contraintes diffusionnelles négligeables au cours de la culture) et la capacité d'incorporer des cellules et d' autres protéines de la matrice extracellulaire concernées, ainsi que de la la rigidité appropriée pour être utilisée dans des bioréacteurs 24. Les systèmes biologiques sont très complexes, et au cours des dernières années, il y a eu un changement d'orientation de la recherche de la muqueuse vers l'examen des interactions cellulaires avec leur environnement plutôt que de les étudier dans isolation. En particulier, l'importance des interactions entre les cellules en influençant la survie des cellules intestinales et la différenciation est bien documentée 31-34. Plus précisément, la communication entre les cellules épithéliales et leur niche a une profonde influence sur l'expansion des cellules épithéliales et la différenciation 35. En effet, il est largement admis que non seulement la cellule à cellule, mais aussi des interactions cellule-ECM sont essentiels pour le maintien et la différenciation des cellules épithéliales dans des modèles de culture 3-D. Des études antérieures ont démontré que les protéines d'ECM intestin telles que le collagène I 24,36,37, 38 laminine et la fibronectine 39 jouent un rôle décisif pour influencer les cellules épithéliales intestinales d'acquérir une orientation spatiale similaire à la muqueuse naturelle. Ainsi, le développement de nouvelles technologies, comme notre modèle 3-D 24, qui peut imiter la diversité phénotypique de l'intestin est nécessaire si les chercheurs ont l' intention de recréer l'architecture cellulaire et structurale complexeet le fonctionnement du micro-environnement intestinal. Ces modèles représentent un outil important dans le développement et l'évaluation des nouveaux médicaments par voie orale et des vaccins candidats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Déclaration éthique: Tous les échantillons de sang ont été prélevés sur des volontaires qui ont participé au numéro de protocole HP-00040025-1. L'Université du Maryland Institutional Review Board a approuvé ce protocole et a autorisé le prélèvement d'échantillons de sang provenant de volontaires sains pour les études incluses dans ce manuscrit. Le but de cette étude a été expliqué aux volontaires, et tous les bénévoles ont informé, signé le consentement avant la prise de sang.
Note: Voir le tableau 1 pour la préparation du supplément de milieu. Voir le tableau 2 pour la préparation des milieux de culture en 3-D.
1. Préparation des navires Culture
- Dévissez le bouchon de l'orifice de remplissage de la cuve 50 ml-et remplir avec 50 ml de milieu de culture stérile (par exemple., RPMI). Effectuer toutes les procédures dans des conditions stériles dans une hotte laminaire.
- Replacer le capuchon et essuyez tout support déversé sur toute surface avec 70% d'éthanol.
- Laisser le navire Incubmangé pendant au moins 15 min à O / N à la température ambiante.
- Utiliser le port de remplissage pour éliminer le milieu de culture et ajouter 30 ml de 3-D du milieu de culture.
- Essuyer tout moyen déversé sur toute surface avec 70% d'éthanol.
2. Préparation des cellules
- Line humaine des cellules épithéliales (HCT-8) 24,40.
- les cellules de la culture dans un milieu RPMI supplémenté avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 50 pg / ml de gentamicine, 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, HEPES 10 mM tampon et du sérum inactivé à la chaleur 10% de fœtus bovin (FBS ) (supplément 1). À 70% de confluence, les cellules divisées en une proportion de 1: 5.
- Fibroblastes colique humaines (cellules CCD-18Co) 24,41.
- Les cellules de la culture dans le milieu de Basal Aigle enrichi avec supplément 1 à confluence, les cellules fractionnées à un rapport de 1: 3..
- Human Umbilical Vein Endothelial (HUVEC) cellules
- Les cellules de culture en Endothelial Basal Medium (EBM) milieu enrichi avec 100 pg / ml d' héparine, 3 pg / ml Endothelial Cell Growth Supplément (ECGS), et de compléter 1 à 70% de confluence, les cellules fractionnées à un rapport de 1: 2..
- Isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) à partir du sang par centrifugation en gradient de densité en utilisant des techniques standard 43.
- En bref, en utilisant une pipette de 10 ml, ajouter avec précaution 30 ml de sang dilué (1: 1 de sang: tampon phosphate salin (PBS)) dans un tube de 50 ml conique contenant 10 ml de milieu de centrifugation de densité. Après l'étape de centrifugation, les lymphocytes et les monocytes résident dans la couche de "blanc" entre le milieu de centrifugation de densité et des couches de plasma.
- Recueillir la couche blanche en utilisant une pipette de transfert. Éviter la contamination des granulocytes en limitant la collecte des supports de centrifugation de densité. Après le lavage de 43, use PBMC cryoconservées tel quel ou dans N2 liquide.
Note: Il est important de souligner que les PBMC se compose essentiellement de lymphocytes et de monocytes, avec une petite proportion de cellules dendritiques et d'autres types de cellules.
3. Préparation des cellules de collagène embarqués
- Déterminer le nombre d'insertions besoin en fonction du nombre de conditions expérimentales pour être mis en place. Placez le nombre approprié d'inserts dans les puits d'une plaque à 6 puits.
- Préparer une suspension de HUVEC et des fibroblastes:
- Laver les flacons deux fois dans du PBS et détacher les cellules en utilisant la trypsine, 0,25% (1x) avec 0,05% de trypsine-tétrasodique éthylènediaminetétraacétate (trypsine-EDTA). Ajouter une solution de trypsine suffisante pour couvrir la totalité de la surface de culture cellulaire. Le détachement se produit généralement dans les 5 à 15 minutes,
- Collecteles cellules individuelles dans un tube de 50 ml contenant 30 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) -30% de FBS moyenne.
- Centrifuger le tube à 500 g pendant 10 min.
- Remettre en suspension les cellules dans 30 ml de DMEM-30% FBS.
- Compter le nombre total de cellules viables en diluant 20 ul de cellules remises en suspension avec 20 pi de bleu trypan colorant. Charger le hémocytomètre avec le mélange de cellules. CMSP Viable sera blanche claire; inviable PBMC va acquérir le colorant et devenir bleu.
- Resuspendre chaque type de cellule dans un milieu DMEM-30% de FBS à une concentration de 5 - 8 x 10 7 cellules ml - 1.
- Préparer des gels de collagène contenant des cellules
Note: Chaque navire nécessite la préparation de ~ 5 ml de gel de collagène contenant des cellules.- Dans un tube de 50 ml conique préparer le mélange de collagène par addition de 1 x support DMEM, supplémenté avec 50 pg / ml de gentamicine, 2 mM de L-glutamine et 10% de la chaleur inactivated FBS plus 3 mg / ml de collagène bovin I, 10 pg / ml de laminine, 40 pg / ml de collagène IV, 10 pg / ml de fibronectine, 2 pg / ml de protéoglycanes de sulfate d'héparine et du NaOH 15 mM (pour atteindre le pH physiologique).
- Fermer le tube et mélanger en retournant plusieurs fois jusqu'à ce que le mélange soit complètement homogénéisé. Eviter la formation de bulles.
IMPORTANT: Gardez le mélange sur la glace pour empêcher la gélification.- Étape critique: Si le mélange développe une apparence acide (couleur jaunâtre), ajouter quelques gouttes de NaOH stérile 1 pour neutraliser le mélange.
- Ajouter HUVEC et de fibroblastes concentré à une densité de 1,0 - 1,2 et 1,5 - 2,0 x 10 6 cellules / ml, respectivement au collagène enrichi en mélange (décrit ci - dessus). Fermer les tubes et mélanger en retournant plusieurs fois jusqu'à ce que le mélange soit complètement homogénéisé. Eviter la formation de bulles. IMPORTANT: Gardez le mélange sur la glace pour empêcher la gélification.
- Ajouter 4 - 5 ml de collagène contenant des cellulesgel pour chaque insert, préalablement chargé dans un puits de plaque 6, et on laisse gélifier dans la hotte, avec peu ou pas de mouvement pendant 1 heure.
- Après 1 h, transférer la plaque de 6 puits à une 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pour 1 - 2 heures additionnelles.
- Remettre la plaque de 6 puits à la hotte, et avec l'aide d'une pince stérile et aseptique scalpel de coupure de la membrane de l'insert de détacher le gel contenant des cellules de la membrane. Couper le gel détaché en petits carrés (~ 5 x 5 mm).
- Ajouter les petits carrés contenant des cellules dans un HARV de 50 ml en utilisant l'orifice de remplissage.
- Préparer une suspension de 8-HCT cellules épithéliales:
- Laver les flacons deux fois dans du PBS et détacher les cellules en utilisant la trypsine, 0,25% (1x) avec le traitement trypsine-EDTA. Ajouter une solution de trypsine suffisante pour couvrir la totalité de la surface de culture cellulaire. Le détachement se produit habituellement dans les 10 à 15 min.
- Collecter des cellules individuelles dans 30 ml de DMEM-30% FBS.
- centrifuge DMEM-30% FBS contenant le tube à 500 xg pendant 10 min.
- Remettre en suspension les cellules dans 30 ml de DMEM-30% FBS.
- Compter le nombre total de cellules viables comme décrit dans 3.2.5.
- Remettre en suspension les cellules HCT-8 dans l' épithélium DMEM-30% de FBS à une concentration de 10 7 cellules ml - 1.
- Ajouter 1 ml de HCT-8 cellules épithéliales concentrées dans le 50-ml HARV en utilisant l'orifice de remplissage.
- En utilisant l'orifice de remplissage, ajouter d'autres milieu de culture 3-D jusqu'à ce que le navire est presque plein (~ 20 ml).
- Replacer le capuchon et essuyez la lèvre de l'orifice de remplissage avec 70% d'éthanol.
- Placer une seringue dans chaque orifice de seringue de la RWV: placer un 5 ml seringue contenant 3 - 4 ml de 3-D dans le milieu de culture, un port et une seringue de 5 ml de vide dans l'autre port.
- Éliminer les bulles visibles en tirant dans la seringue vide pendant approximativement le même volume de milieu est injecté à travers l'autre orifice de la seringue.
- Placez les VesSels dans le bioréacteur, mettre sous tension et régler la vitesse d'environ 13 à 14 rotations par minute.
Remarque: l' étape critique: taux de rotation peut être nécessaire d'ajuster quelques fois au cours d' une expérience visant à maintenir les cellules en orbite autour de l' intérieur du récipient, ce qui évite le contact avec les parois des vaisseaux. - Les cellules de la culture à 37 ° C, 5% de CO 2 sous microgravité, fourni par le bioréacteur RWV.
- Changement milieu de culture tous les 3 - 4 jours en remplaçant environ 30 ml avec du milieu frais de culture 3-D.
- Après 4 jours (± 1 jour), retirez les navires du bioréacteur et ajouter des lymphocytes / monocytes aux vaisseaux (2 x 10 7 / navire).
- Placez les vaisseaux de retour dans le bioréacteur à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 5 jours (± 1 jour).
- Après les 5 jours supplémentaires (jour 9 de la culture), ajouter des lymphocytes / monocytes aux vaisseaux (2 x 10 7 / navire) et continuer les cultures pour un maximum de 12 jours supplémentaires. Changement milieu de culture tous les 3 - 4 jours en remplaçant environ 30 ml avec du milieu frais de culture 3-D.
4. Récolte Cultures 3-D pour histologie
- À l'aide d'une récolte de pipette de transfert de chaque fragment de gel petit, maintenant appelé «construire» dans une plaque à six puits contenant 10 ml de tampon de formol à 10%. Laisser pendant 3 heures à la température ambiante ou pour les 12 - 16 heures à 4 ° C.
- Préparer le traitement des tissus et des cassettes d'enrobage par marquage et en ajoutant deux morceaux de blocs de mousse de biopsie dans chaque cassette.
- Immerger les cassettes dans 10% de tampon formol.
- À l'aide d'une pince placer les constructions-fixes entre les deux tampons de mousse.
- Immerger les cassettes dans 10% de tampon formol.
- Procéder à des procédures standard pour l' intégration, sectionner et coloration 44.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Précédemment , nous avons conçu un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine constituée d'une lignée de cellules épithéliales intestinales et les lymphocytes humains primaires, des cellules endothéliales et des fibroblastes en culture en conditions de microgravité 24 (figure 1). Les fibroblastes et les cellules endothéliales ont été noyées dans une matrice de collagène I enrichi avec intestin supplémentaire sous - sol protéines membranaires 45 (ie., La laminine, le collagène IV, la fibronectine et du sulfate d'héparine protéoglycanes) et ajoutés à RWV bioréacteurs. Après 10 - 15 jours, l'analyse de coloration histologique a démontré la présence de structures de villosités comme dans les constructions. Environ 60 - 80% de ces cellules épithéliales ont été organisées comme une monocouche de cellules polarisées avec leurs noyaux situés dans une position basale près de l'ECM, ce qui est une caractéristique majeure de cellules bien différenciées (Figure 2).
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figure 1: Schéma de la construction du modèle 3-D. Quatre étapes sont nécessaires pour construire le système 3-D. Tout d'abord, afin d'obtenir le nombre requis de cellules pour générer le modèle 3-D, une lignée cellulaire humaine intestinale épithéliale entérocytes (HCT-8) et des cellules endotheliales primaires humaines et les fibroblastes sont cultivés en monocouches confluentes 2-D. Deuxièmement, l'ECM composé de collagène I matrice enrichie en protéines de la membrane intestinale supplémentaire du sous - sol (ie., La laminine, le collagène IV, la fibronectine et de l' héparine sulfate protéoglycanes) est préparé. En troisième lieu, les fibroblastes et les cellules endothéliales sont noyés dans un mélange de collagène I et ajouté à RWV bioréacteurs suivi par l'addition HCT-8 cellules épithéliales. Quatrièmement, les lymphocytes primaires sont ajoutés à la culture au jour 4 et 9 (± 1 jour)."> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Comparaison entre l'intestin humain normal et les modèles organotypiques. Hématoxyline et éosine de cellules cultivées dans le modèle de microgravité 3-D: les tissus ont été colorés violet et rose échafaudage colorées. Les cellules du modèle 3-D ont été cultivées pendant 14 ( «a» et «b») et 20 jours (c). Vingt jours après le semis, le nombre total de cellules sont maintenues, et les cellules étaient montrant des caractéristiques des villosités comme bien différenciés. Les images sont affichées à 100X ( "a" et "b") et 40X ( "c") grossissement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Nom du produit | Emb. Taille | Reconstitution | Concentration de travail | Stockage |
| Fibroblast Growth Factor-Basic (bFGF) | 25 mg | Pour préparer / ml de solution de 25 pg; ajouter 25 pg de FGF dans 1 ml de milieu stérile (RPMI plus 1% FCS), agiter pour dissoudre, ajouter 100 pl / aliquote | 5 ng / ml | poudre -20 o C, aliquotes de travail -20 o C, éviter le gel de répétition / dégel |
| Stem Cell Factor (SCF) | 10 mg | Pour préparer / ml de solution de 10 pg; ajouter 10 pg de SCF dans 1 ml de milieu stérile (RPMI plus 1% FCS), agiter pour dissoudre, ajouter 250 ul / aliquote | 5 ng / ml | poudre -20 o C, aliquotes de travail -20 o C, éviter le gel de répétition / dégel |
| Hépatocytes Facteur croissance (HGF) | 5 mg | Pour préparer / ml de solution 5 ug; ajouter 5 ug de HGF dans 1 ml de milieu stérile (RPMI plus 1% FCS), agiter pour dissoudre, ajouter 200 pl / aliquote | 2 ng / ml | poudre -20 o C, aliquotes de travail -20 o C, éviter le gel de répétition / dégel |
| endothéline 3 | 50 mg | Pour préparer / ml de solution de 50 pg; ajouter 50 pg d'endothéline dans 1 ml de milieu stérile (RPMI plus 1% FCS), agiter pour dissoudre, ajouter 100 pl / aliquote | 10 ng / ml | poudre -20 o C, aliquotes de travail -20 o C, éviter le gel de répétition / dégel |
| laminine | 1 mg | Décongeler lentement à 2-8 o C, tourbillon et ajouter 100 pl / aliquote | 10 mg / ml | liquide à -20 ° C, travaillant aliquotes -20 o C, éviter la répétition freeze / dégel |
| Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF de) | 10 mg | Pour préparer / ml de solution 5 ug; ajouter 10 pg de VEGF dans 2 ml d'eau stérile, agiter pour dissoudre, ajouter 100 pl / aliquote | 1 ng / ml | poudre -20 o C, aliquotes de travail -20 o C, éviter le gel de répétition / dégel |
| Leucémie facteur inhibiteur (FRV) | 50 mg | Pour préparer / ml de solution de 20 pg; ajouter 50 pg de FRV dans 2,5 ml d'eau stérile, agiter pour dissoudre, ajouter 100 pl / aliquote | 4 ng / ml | poudre -20 o C, aliquotes de travail -20 o C, éviter le gel de répétition / dégel |
| adénine | 25 g | Pour préparer 0,18 M solution mère; ajouter 121,5 mg og adedine dans 50 ml de HCl 0,05 M (250 pi de 37,1% HCl dans 50 ml d'eau)), agiter pour dissoudre, filtrer et stériliserajouter 1 ml / aliquote | 1,8 x 10 -3 M | poudre 4 o C, des aliquotes de travail -20 o C, éviter le gel de répétition / dégel |
| Insuline | 50 mg | Pour préparer 5 mg / ml solution mère; ajouter 50 mg d'insuline dans 10 ml de HCl 0,005 M (5 pi de 37,1% de HCl dans 10 ml d'eau)), agiter pour dissoudre, filtrer et stériliser ajouter 0,5 ml / aliquote | 5 mg / ml | poudre -20 o C, aliquotes de travail -20 o C, éviter le gel de répétition / dégel |
| T3 | 100 mg | Pour préparer 2 x 10 -8 M solution mère; ajouter 3,4 mg de T3 dans 25 ml de NaOH 1 M, on dilue 0,1 ml de cette solution dans 9,9 ml de PBS, on dilue à nouveau 0,1 ml de cette solution dans 9,9 ml de PBS, agiter pour dissoudre, stériliser par filtration et ajouter 0,5 ml / aliquote | 2 x 10 -11 M | poudre -20 o C, aliquotes de travail -20 <sup> o C, éviter le gel de répétition / dégel |
| Cholera Toxin | 5 mg | Pour préparer 10 -7 M solution mère; ajouter 5 mg de toxine cholérique dans 5 ml ddH stérile 2 O (conserver à -20 ° C); diluer 50 pi de cette solution dans 5 ml ddH 2 O, agiter pour homogénéiser, stériliser par filtration et ajouter 0,5 ml / aliquote | 10 -10 M | poudre de 4 - 8 o C, aliquotes de travail -20 o C, éviter le gel de répétition / dégel |
| fibronectine | 1 mg | Pour préparer 1 mg / ml solution mère; ajouter 1 mg de fibronectine dans 1 ml d'eau distiled stérile. Autoriser 30 min. pour le matériel pour aller dans la solution. NE PAS AGITER OU SWIRL. Ajouter 100 pl / aliquote | 10 mg / ml | poudre de 4 - 8 o C, aliquotes de travail -20 o C, éviter le gel de répétition / dégel |
| apo-transferrine | 100 mg Pour préparer 5 mg / ml solution mère (1,000x); ajouter 100 mg de transferrine dans 20 ml de PBS tourbillonnement pour dissoudre, stériliser par filtration et ajouter 0,5 ml / aliquote | 5 mg / ml | poudre -20 o C, aliquotes de travail -20 o C, éviter le gel de répétition / dégel | |
| héparine | 50 KU | Pour préparer 50 mg / ml solution mère (1,000x); ajouter 50 mg d'héparine dans 1 ml de tourbillonnement de l'eau pour dissoudre, stériliser par filtration et ajouter 1 ml / aliquote | 0,1 mg / ml | poudre -20 o C, aliquotes de travail -20 o C, éviter le gel de répétition / dégel |
| héparane sulfate protéoglycanes | 1 mg | Pour préparer 0,1 mg / ml solution mère; ajouter 1 mg de sulfate d'héparane dans 10 ml de tourbillonnement de l'eau stérile pour dissoudre et ajouter 0,2 ml / aliquote | 2 mg / ml | poudre -20 o C, aliquotes de travail -20 o C, évitergel répétition / dégel |
| le collagène IV | 5 mg | Pour préparer 2 mg / ml Stock solutin: ajouter 2 mg de collagène V dans 2,5 ml d'acide stérile à 0,25% d'acide acétique. Laisser 1 - 2 h pour le matériel pour aller dans une solution Agiter pour une meilleure dillution.. Ajouter 400 ul / aliquote | 80 mg / ml | poudre -20 o C, aliquotes de travail -20 o C, éviter le gel de répétition / dégel |
Tableau 1: Défini Medium Supplement Préparation.
| F-12 supplémenté avec | |||
| Réactif | Stock Solution | Solution finale | Montant |
| sérum de veau foetal | dix% | 50 ml | |
| Le pyruvate de sodium | 100 mM | 1 mM | 5 ml |
| L-Glutamine | 200 mM | 2 mM | 5 ml |
| Hepes | 1 H | 10 mM, | 5 ml |
| gentamicine | 50 mg / ml | 50 pg / ml | 500 ul |
| Pénicilline / streptomycine | 10 000 UI / ml / 10 mg / ml | 100 U / ml / 100 pg / ml | 5 ml |
| Insuline | 5 mg / ml | 5 ug / ml | 500 ul |
| T3 | 2 x 10-8 M | 2 x 10 -11 M | 500 ul |
| adénine | 1,8 x 10-1 M | 1,8 x 10-3 M | 5 ml |
| transferrine | 5 ug / ml | 500 ul | |
| héparine | 50 mg / ml | 0,1 mg / ml | 1 ml |
| ECGS | 3 mg / ml | 3 pg / ml | 5 ml |
| bFGF | 25 pg / ml | 5 ng / ml | 100 ul |
| SCF | 10 pg / ml | 5 ng / ml | 250 ul |
| HGF | 5 ug / ml | 2 ng / ml | 200 ul |
| endothéline 3 | 50 pg / ml | 10 ng / ml | 200 ul |
| FRV | 20 pg / ml | 4 ng / ml | 100 ul |
| VEGF | 5 ug / ml | 1 ng / ml | 100 ul |
| toxine Choleran | 10 -7 M | 10 -10 M | <500 ul/ Td> |
| Remarque: Le montant cité ci-dessus est pour la préparation de 500 ml de 3-D des milieux de culture. Les médias doivent être conservés à 4 ° C pendant pas plus de 2 semaines | |||
Tableau 2: Préparation de la 3-D Milieux de culture.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans ce manuscrit, nous décrivons le développement d'un modèle transgénique de la muqueuse intestinale humaine composée de multiples types cellulaires incluant les lymphocytes humains primaires, des fibroblastes et des cellules endotheliales, ainsi que des lignées de cellules épithéliales intestinales 24. Dans ce modèle 3-D, les cellules sont cultivées dans une matrice extracellulaire riche en collagène dans des conditions de microgravité 24.
Comme précédemment décrit, les principales caractéristiques de ce modèle sont: (i) la capacité d'imiter l'organisme monocouche de tissu épithélial, (ii) l'induction d' une polarité appropriée des cellules épithéliales, des jonctions serrées, des desmosomes et des microvillosités, (iii) une longue la culture à long terme (jusqu'à 20 jours) avec une grande viabilité des cellules primaires (ie., les fibroblastes et les cellules endothéliales), (iv) l'expression des marqueurs de différenciation des tissus comme incluant villine, cytokératine, E-cadhérine et mucin, (v) la capacité de produire des quantités considérables de cytokines (par exemple., IL-8) et la phosphatase alcaline lors de la stimulation antigénique, (vi) le transport des nutriments tels que le glucose (ie., l' expression de disaccharidases, et la présence de sucre transporteurs), et (vii) la différenciation multi-lignée de cellules épithéliales intestinales (ie., entérocytes absorption, globet et des cellules M) 24.
Il est important de souligner que pour obtenir des résultats reproductibles en utilisant notre modèle 3-D l'enquêteur doit se conformer aux directives de bonne culture cellulaire 46-48. Il est essentiel de contrôler systématiquement les cellules pour la viabilité, la contamination par des mycoplasmes et des changements dans le comportement de la croissance cellulaire. Si un problème est identifié, vérifiez d'abord qu'aucune modification non autorisée ont été introduites dans le protocole. Si le problème persiste, passer à un nouveau lot des différents composants du milieu (y compris le sérum) et /ou les cellules. Une limitation du modèle 3-D est l'utilisation de la lignée de cellules de l'épithélium HCT-8 tumorigènes. Cependant, il est important de considérer que la présence de HCT-8 ligne offre l'avantage d'être disponible dans le commerce. De plus, ces cellules épithéliales n'expriment l' antigène leucocytaire humain soit classique ou non classique (HLA) -class I molécules 49,50. Ainsi, ils permettent la culture de cellules épithéliales avec des PBMC de différentes HLA de classe I haplotypes en l'absence de l'épithélium alloréactivité cellules PBMC. En outre, lorsque l'on compare ce système avec des systèmes tels que la cellule intestinale de la tige organites 51-53, ce modèle offre de nombreux avantages. Bien que organites des cellules souches de l' intestin fournissent de précieuses informations sur la biologie cellulaire et la différenciation intestinale 51-53, ce modèle permet une exposition directe aux apical nutriments, des médicaments et des agents pathogènes. Ce modèle offre également un accès facile au contenu luminal ces peptides et des cytokines anti-microbiens. En revanche, les organites sont compacts nonson avec une surface luminale tournée vers l'intérieur. Par conséquent, il existe une quantité limitée de produit qui peut être introduit dans la lumière 54 organoïde.
Nous croyons que notre modèle multicellulaire organotypique 3-D de la muqueuse intestinale humaine a un potentiel large comme un outil pour la découverte à la fois la santé et la maladie, y compris l' interaction avec des agents pathogènes, l' antigène traite et inflammatoire et métabolique processus 24. Enfin, en raison de la nature multicellulaire de notre modèle 3-D, notre modèle pourrait permettre à pertes et intensité forte études utilisant des types de cellules immunitaires qui sont susceptibles d'influer sur le comportement des cellules épithéliales in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor | Synthecon | RCCs-4DQ | For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available. |
| Disposable 50 ml-vessel | Synthecon | D-405 | Box with 4 vessels |
| HCT-8 epithelial cells | ATCC | CCL-244 | |
| CCD-18Co Fibroblasts | ATCC | CRL-1459 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | CRL-1730 | HUVEC |
| Fibroblast Growth Factor-Basic | Sigma | F0291 | bFGF |
| Stem Cell Factor | Sigma | S7901 | SCF |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | HGF |
| Endothelin 3 | Sigma | E9137 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Vascular Endothelial Growth Factor | Sigma | V7259 | VEGF |
| Leukemia Inhibitory Factor | Santa Cruz | sc-4377 | (LIF |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Insulin | Sigma | I-6634 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T-6397 | T3 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Fibronectin | BD | 354008 | Isolated from human plasma |
| apo-Transferrin | Sigma | T-1147 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Heparan sulfate proteoglycan | Sigma | H4777 | Isolated from basement membrane of mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | Isolated from human placenta |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| D-MEM, powder | Invitrogen | 12800-017 | |
| 10% formalin–PBS | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Bovine type I collagen | Invitrogen | A1064401 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | MT25-052-CI | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
| Penicillin/streptomincin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Ham's F-12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010-046 | BME |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM-2 |
| Endothelial cell growth supplement | Millipore | 02-102 | ECGS |
References
- Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
- Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
- Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
- Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
- Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
- Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
- Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
- Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
- Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
- Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
- He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. , (2015).
- Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
- Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
- Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
- Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
- Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
- Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
- Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
- Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
- Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
- Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
- Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. , (2010).
- Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651 (2014).
- Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
- Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
- Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
- Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
- Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
- Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
- Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. , e51064 (2014).
- Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
- Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
- Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
- Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
- Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. , (2014).
