Summary
Bir üç boyutlu (3-D) bir ortamda büyüyen hücreler 2-B ortamları (örneğin, şişeler ya da bulaşıklar için) hücre ekimi üzerinde belirgin bir iyileşme göstermektedir. Burada dönen duvar-damar (RWV) Biyoreaktörlerde tarafından sağlanan mikrogravite altında kültüre insan bağırsak mukozasının bir çok hücreli 3-D Organotipik modelinin gelişimini betimler.
Abstract
Üç boyutlu (3-D) bir ortamda büyüyen hücreler çok 2-B ortamlarında hücre yetiştirme boşluklar (örn., Matara veya yemekler) köprü potansiyeline sahip çünkü. Aslında, yaygın şişelerde ya da bulaşıklar için yetiştirilen hücreler de-ayırt ve türetildikleri dokuların özel özellikleri kaybederler kabul edilmektedir. (A) statik model ve biyoreaktörler kullanılarak, (b) modeller: Şu anda, yerli ekstraselüler matriks (ECM) taklit eden hücreler iskelelerinin içine numaralı seribaşı 3-D kültür sistemleri iki tür temelde vardır. İlk atılım statik 3-D modelleri oldu. Böyle dönen duvar-gemi gibi biyoreaktörler kullanılarak 3-D modelleri (RWV) biyoreaktörle daha yeni bir gelişme vardır. RWV Biyoreaktörlerin orijinal konsept 1990'ların başında NASA'nın Johnson Uzay Merkezi'nde geliştirilen ve hipoksik, nekrotik çekirdek geliştirme gibi statik modellerin sınırlamaları aşmak inanılmaktadır. RWV biyoreaktörler th aşmak olabilirbesin ve oksijenin etkili yayılmasına imkan akışkanlar dinamiği sağlayarak sorundur. Bu biyoreaktörler desteklemek ve onların havalandırma kaynak türüne göre farklılık kültür damarlarının iki farklı biçimleri döndürmek için hizmet veren bir döndürücü tabanının oluşur: Bir eş eksenli merkezi oksijenatör, ya da (1) Yavaş Torna Yanal Gemiler (STLVs) (2 düz, silikon kauçuk gaz transferi membranı yoluyla oksijenasyonu ile) Yüksek Boy Oranı gemiler (HARVs). kabarcık oluşumunu ve buna bağlı türbülans kaçınarak Bu gemilerin verimli gaz transferine izin verir. Bu koşullar modeller kültür kabı içinde ağırlık (yerçekimi) azaltılmış laminer akış ve minimal kesme kuvveti ile sonuçlanır. Burada RWV biyoreaktör tarafından sağlanan bir bağırsak epitel hücre hattı ve primer insan lenfositler, mikrogravite altında kültüre endotelyal hücreler ve fibroblastlar oluşan insan bağırsak mukoza çok hücreli 3-D organotipik modelinin geliştirilmesi açıklanmaktadır. </ P>
Introduction
Bilim adamları, farklı iskele türlerini (örneğin., Laminin, kollajen tip I kollajen IV ve fibronektin) ve geliştirmek için büyüme faktörlerinin kokteyller araştırmak başladı 3 boyutlu bir model inşa ilk atılım 1980'lerin başlarında bildirildi hücre-hücre ve "statik" 3-D modelleri 1-7 ECM etkileşimlerinde. O zamandan bu yana, bu modellerin temel sorun orta ve doku yapıları 8 içinde besin transferi ve oksijen sınırlamalar olmuştur. Kan damarlarının ağları çevreleyen sürekli bir besin akışı ve oksijen alır, in vivo ortamda hücrelerin aksine, bu modellerin statik yapısı hücrelerine sınırlı bir şekilde dağılımını engellemektedir. Örneğin, boyutu bir kaç milimetreyi aşan, in vitro statik modellerde üretilen hücre agrega değişmez hipoksik, nekrotik çekirdeği 9 gelişecektir. RWV biyoreaktörler Bu sorunu aşmak olabilirbesin ve oksijen 10-12 verimli yayılmasına imkan akışkanlar dinamiği sağlayarak. Ancak, bugüne kadar, RWV biyoreaktörler kullanarak çalışma bir veya iki hücre tipinin 13-17 dahil sınırlı kalmıştır. Ayrıca yerine doğal dokuların benzer bir mekansal yönlenmelerinin, bu hücreler, hücre agregatları oluşturdu. Bu sınırlamalar başlıca nedeni entegre bir şekilde hücreleri dahil etmek mümkün bir iskele eksikliği olmuştur. Bugüne kadar RWV biyo-reaktörlerde kullanılan iskeleleri esas olarak sentetik mikro-, borulu silindirler veya küçük yaprak 13-15,19-23 arasında birkaç istisna dışında 16-18 ile, oluşur. Bunlar, bir bileşim ve esneklik manipüle edilemez ve hangi hücrelerin yüzeyine bağlı oldukları sert malzemelerdir. Bu nedenle, bu modellerin entegre bir şekilde değerlendirmek için bir sistem sağlamak olası değildir, çeşitli hücre gibi stromal hücreleri gibi bileşenler (örneğin., Fibroblastlar, bağışıklık ve endotelyal hücreler) bu should yakından insan dokusu taklit etmek için iskele içinde dağıtılabilir.
Burada bir bağırsak epitel hücre hattı ve primer insan endoteliyal hücrelerde oluşan insan bağırsak mukoza çok hücreli 3-D organotipik modelinin geliştirilmesi tarif eder ve fibroblastlar 24. Bu hücreler mikrogravite altında RWV biyoreaktör 13,25-30 tarafından temin kültürlenmiştir. Bizim 3-D modelinde ECM çok belirgin, kültür ortamına benzer bir ozmolalite (örn., Kültür sırasında ihmal difüzyon başlıkları) ve hücrelerden ve diğer ilgili hücre dışı matris proteinleri dahil yeteneği gibi özellikleri, hem de sahip uygun sertlik biyoreaktörler 24 kullanılır. Biyolojik sistemler çok karmaşık ve son birkaç yıldır,, izolasyon onları okuyan ziyade çevreleriyle hücre etkileşimleri incelenmesi yönünde mukozal araştırma odak bir kayma olmuşturn. Özellikle, Bağırsak hücre hayatta kalma ve farklılaşmasını etkileyen hücre-hücre etkileşimleri önemi iyi 31-34 belgelenmiştir. Özellikle, epitel hücreleri ve bunların niş arasındaki iletişim epitel hücre genişlemesi ve farklılaşması 35 üzerinde derin bir etkisi vardır. Gerçekten de, yaygın olarak kabul edilen tek değil, hücre-hücre hem de hücre-ECM etkileşimleri 3-D kültür modellerinde epitelyal hücrelerin bakım ve farklılaşma için kritik öneme sahiptir. Önceki çalışmalar kollajen I 24,36,37, laminin 38 ve fibronektin 39 yerli mukozaya benzer uzaysal oryantasyon elde etmek için bağırsak epitel hücrelerini etkileyen vesile olduğu gibi bu bağırsak ECM proteinleri göstermiştir. Araştırmacılar kompleks hücresel ve yapısal mimari yeniden niyetinde olmadığını Böylece, yeni teknolojilerin gelişmesi, bizim 3-D modeli 24 gibi, bu bağırsak fenotipik çeşitlilik gereklidir taklit edebilirve bağırsak mikro-işlevi. Bu modeller, yeni oral ilaçlar ve aşı adaylarının gelişimi ve değerlendirilmesinde önemli bir araç oluşturmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik deyimi: Tüm kan örnekleri protokol numarası HP-00040025-1 katılan gönüllülerden toplanmıştır. Maryland Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi bu protokolü onayladı ve bu yazıda yer alan çalışmalar için sağlıklı gönüllülerden kan örneklerinin koleksiyonu yetkili. Bu çalışmanın amacı, gönüllülere açıklanmış ve tüm gönüllüler bilgilendirilmiş verdi, kan beraberlik önce rızasını imzaladı.
Not: Orta takviyesi hazırlığı için Tablo 1'e bakınız. 3-D kültür ortamının hazırlanması için Tablo 2'ye bakınız.
Kültür Gemiler hazırlanması 1.
- 50 ml'lik kabın dolum bağlantı kapağını çıkarın ve steril kültür ortamına 50 ml (ör. RPMI) ile doldurun. laminar kaput steril koşullar altında tüm prosedürleri uygulayın.
- Kapağı değiştirin ve% 70 etanol ile herhangi bir yüzeyde herhangi dökülen orta silin.
- gemi inkubasyon izin verOda sıcaklığında O / N, en az 15 dakika boyunca yedi.
- Kültür ortamı atılır ve 3-B kültür ortamında 30 ml ilave dolum kapısının kullanın.
- % 70 etanol ile herhangi bir yüzeyde herhangi dökülen orta silin.
Hücreler 2. Hazırlık
- Insan epitel hücre çizgisi (HCT-8) 24,40.
- RPMI kültür hücreler 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 50 mg / ml gentamisin, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM HEPES (tampon ve% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu FBS ile takviye edilmiş ) (ek 1). % 70 ortak akışkanlığa da 1 oranında bölünmüş hücreleri: 5'tir.
- İnsan kolonik fibroblastlar (CCD-18Co hücreleri) 24,41.
- Ek 1 ile zenginleştirilmiş Bazal Eagle ortamı içinde kültür hücreleri Akışların birleştiği yerde hücreler, 1 oranında bölünmüş hücre. 3.
- İnsan Umbilikal Ven Endotelyal (HUVEC) hücreleri
- Endotel Bazal Ortamda (EBM) Kültür hücrelerinin ortamı 100 ug / ml heparin, 3 ug / ml endotel hücre büyüme takviyesi (ECGS) ile zenginleştirilmiş ve 1 ek% 70 ortak akışkanlığa, 1 oranında bölünmüş hücreler de. 2.
- Standart teknikler 43 kullanılarak yoğunluk gradyan santrifüj ile kandan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC) izole edilir.
- Kısaca, 10 ml'lik bir pipet kullanılarak, dikkatli bir şekilde seyreltilmiş kan 30 ml ilave (1: 1, kan: Fosfat tamponlu tuz (PBS)) yoğunluk santrifüj, 10 mL ortam ihtiva eden bir 50 mL konik tüp içine. santrifüj aşamasından sonra, lenfositler ve monositler yoğunluk santrifüj medya ve plazma katmanları arasında "beyaz" katmanında ikamet edecek.
- Bir transfer pipet kullanarak beyaz tabakayı toplayın. yoğunluk santrifüj medya koleksiyonu sınırlayarak granülosit kirlenmesini önlemek. 43 yıkandıktan sonra, Uolarak se PBMC ya da sıvı N 2 kriyoprezerve.
Not: PBMC, büyük ölçüde, dendritik hücreler ve diğer hücre tipleri arasında, küçük bir oranda, lenfositler ve monositler oluşur vurgulamak önemlidir.
Kolajen gömülü hücrelerin 3. hazırlanması
- ekler sayısını belirlemek deneysel koşullar numaraları göre gerektiğinde set-up olmak. 6-çukurlu bir plaka gözlerine insertlerin uygun sayıda yerleştirin.
- HUVEC ve fibroblast bir süspansiyon hazırlamak:
- PBS içinde iki kez şişeler yıkayın ve% 0.05 tripsin-tetrasodyum etilendiamintetraasetat (Tripsin-EDTA) ile tripsin,% 0.25 (1x) kullanarak hücreleri ayırmak. Hücre kültürü yüzey alanının tamamını kapsayacak kadar tripsin solüsyonu ekleyin. Sıyrılma, genellikle 15 dakika ile 5 dakika içinde meydana gelir
- ToplamakDulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM)% 30 FBS ortamı 30 ml içeren 50 ml'lik bir tüp içinde müstakil hücreleri.
- 10 dakika boyunca 500 xg'de tüp santrifüjleyin.
- DMEM% 30 FBS ortamı 30 ml tekrar süspansiyon hücreleri.
- Tripan mavi boya 20 ul ile yeniden süspanse hücre 20 ul seyreltilmesiyle yaşayan hücrelerin sayısı. Hücre karışımı ile hemasitometre yükleyin. Canlı PBMC'ler açık beyaz olacaktır; cansız PBMC boya kazanmak ve mavi olacak.
- 8 x 10 7 hücre ml - - 5 konsantrasyonda DMEM% 30 FBS ortamı içinde her hücre tipi yeniden süspanse 1.
- hücre içeren kollajen jel hazırlanması
Not: Her bir kap hücre içeren kollajen jel ~ 5 ml hazırlanmasını gerektirir.- 50 ml'lik konik bir tüp içinde 50 ug / ml gentamisin, 2 mM L-glutamin ve% 10 ısı ile inactivat ile takviye edilmiş 1 X DMEM ortamı ekleyerek kollajen karışımının hazırlanmasıEd FBS artı 3 mg / ml sığır kollagen-l, 10 ug / ml laminin, 40 ug / ml kolajen IV, 10 ug / ml fibronektin, 2 ug / ml heparin sülfat proteoglikan, 15 mM NaOH (fizyolojik pH değerinin elde edilmesi).
- Tüp kapatılır ve karışım tamamen homojenize kadar birkaç kez ters yüz edilerek karıştırılır. kabarcık oluşumunu önlemek.
ÖNEMLİ: jelleşme önlemek için buz karışımı tutun.- Kritik adım: Karışım bir asidik görünüm (sarı renkli) oluşursa, karışımın nötralize edilmesi için, steril 1 N NaOH ve bir kaç damla ekleyin.
- Sırası ile zenginleştirilmiş-kollajen karışımı (yukarıda tarif edilmiştir) ile, 2.0 x 10 6 hücre / ml - 1.2 ve 1,5-1,0 yoğunluğunda konsantre HUVEC ve fibroblastlar ekleyin. tüpleri kapatın ve karışım tamamen homojenize kadar birkaç kez ters yüz edilerek karıştırılır. kabarcık oluşumunu önlemek. ÖNEMLİ: jelleşme önlemek için buz karışımı tutun.
- hücre içeren kollajen 5 ml - 4 eklemeher ekleme jel, önce bir 6 kuyu-plakasının içine yerleştirilir ve 1 saat boyunca çok az veya hiç hareket kaputu gelify bırakıldı.
- 2 saat daha - 1 saat sonra, 1 için bir 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör 6 oyuklu plaka aktarın.
- başlık 6 oyuklu plaka dönün ve steril bir forseps yardımıyla ve aseptik kesme neşter bir membran hücre ihtiva eden jel ayırma elemanından. küçük kareler halinde müstakil jel (~ 5 x 5 mm) kesin.
- dolum bağlantı noktasını kullanarak 50 ml HARV olarak küçük hücreli içeren kareler ekleyin.
- HCT-8 epitel hücrelerinin bir süspansiyonu hazırlanması:
- PBS içinde iki kez şişeler yıkayın ve Tripsin-EDTA tedavisi ile tripsin,% 0.25 (1x) kullanarak hücreleri ayırmak. Hücre kültürü yüzey alanının tamamını kapsayacak kadar tripsin solüsyonu ekleyin. Sıyrılma, genellikle 10 ila 15 dakika içinde meydana gelir.
- DMEM% 30 FBS ortamı 30 ml müstakil hücreleri toplamak.
- Santrifüj10 dakika boyunca 500 xg'de tüp ihtiva Uge DMEM% 30 FBS ortamı.
- DMEM% 30 FBS ortamı 30 ml tekrar süspansiyon hücreleri.
- 3.2.5 tarif edildiği gibi canlı hücre sayısı.
- 10 7 hücre ml'lik bir konsantrasyonda DMEM% 30 FBS ortamı içinde HCT-8 epitel hücreleri tekrar - 1.
- dolum bağlantı noktasını kullanarak 50 ml HARV halinde konsantre HCT-8 epitel hücrelerinin 1 ml ilave edilir.
- gemi neredeyse dolana kadar doldurma bağlantı noktasını kullanarak, (~ 20 ml) ilave 3-D kültür ortamı ekleyin.
- Kapağı değiştirin ve% 70 etanol ile dolgu liman dudağını silin.
- RWV her şırınga limanında bir şırınga yerleştirin: yer 3 içeren 5 ml'lik şırınga - 4 tek limanda 3-D kültür ortamı ml ve diğer limanda 5 ml boş şırınga.
- orta yaklaşık aynı hacimde başka şırınga bağlantı noktası üzerinden enjekte edilir iken boş şırınga içine çekerek herhangi bir görünür kabarcıklarını çıkarın.
- ves yerleştirindamarları biyoreaktör, gücü açın ve dakikada yaklaşık 13 ila 14 rotasyonlar için hızını ayarlayabilirsiniz.
Not: Kritik adım: Rotasyon hızı böylece damar duvarları ile temas kaçınarak, damar içinde yörüngedeki hücreleri korumak için bir deney sırasında birkaç kez ayarlanması gerekebilir. - RWV biyoreaktör tarafından sağlanan 37 ° C, mikrogravite altında,% 5 CO2, kültür hücreleri.
- Taze 3-D kültür ortamı ile yaklaşık 30 ml değiştirerek 4 gün - her 3 değiştirin kültür ortamı.
- 4 gün sonra (± 1 gün) sonra, biyoreaktörden damarları çıkarın ve kaplar (x 10 7 / kabı 2) ila lenfositler / monositlerin ekleyin.
- Ek bir 5 gün (± 1 gün) boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 geri biyoreaktör kapları.
- Ek 5 gün (kültürün gün 9) sonra, damarların (2 x 10 7 / damar) ile lenfositler / monositler eklemek ve 12 adede kadar ek gün için kültürleri devam ediyor. Taze 3-D kültür ortamı ile yaklaşık 30 ml değiştirerek 4 gün - her 3 değiştirin kültür ortamı.
Histoloji 4. Hasat 3-D Kültürler
- % 10 formalin 10 ml tampon içeren altı oyuklu plaka Bir transfer pipeti hasat yardımıyla artık olarak adlandırılan her küçük jel fragmanı "yapı" ile. Oda sıcaklığında 3 saat bekleme veya 12 - 4 ° C'de 16 saat.
- etiketleme ve her kaset içine biyopsi köpük pedler iki adet ekleyerek doku işleme ve gömme kasetleri hazırlayın.
- % 10 formalin tamponda kasetleri daldırın.
- Forseps yardımıyla iki köpük ped arasındaki sabit yapıları yerleştirin.
- % 10 formalin tamponda kasetleri daldırın.
- , Gömme kesit ve 44 boyanması için standart prosedürler ile devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Daha önce, bir bağırsak epitel hücre hattı ve primer insan lenfositler, yerçekimi koşulları 24 (Şekil 1) altında kültür endotelyal hücreler ve fibroblastlar oluşan insan bağırsak mukoza çok hücreli 3-D Organotipik bir model oluşturduk. Fibroblastlar ve endoteliyal hücreler ben ek bağırsak bazal membran proteinleri 45 (yani., Laminin, kolajen IV, fibronektin ve heparin sülfat proteoglikan) zenginleştirilmiş matris, kolajen gömülü olan ve biyoreaktörler RWV ilave edildi. 10 Sonra - 15 gün, histolojik boyama analizi yapılarında villus benzeri yapıların varlığını göstermiştir. Yaklaşık 60 - Bu epitel hücrelerinin% 80'i iyi farklılaşmış hücrelerin (Şekil 2) önemli bir özelliğidir ECM, yakın bir bazal konumda bulunan kendi çekirdekleri polarize hücrelerin tek tabaka olarak düzenlenmiştir.
1 ">:" keep-together.within sayfa = fo "ent
Şekil 1: 3-D Modeli İnşaatı diyagramı. Dört adım 3-D sistemi kurmak için gereklidir. İlk olarak, 3-boyutlu modeli, bir insan bağırsak enterosit epitel hücre çizgisi (HCT-8) ve primer insan endotel hücrelerinde ve fibroblastlarda 2-B konfluent tek katmanlar olarak yetiştirilen oluşturmak için hücrelerin gerekli sayısı elde edildi. İkinci olarak, oluşan ECM kolajen I, ek bağırsak bazal membran proteinleri ile zenginleştirilmiş matrisi (örn., Laminin, kolajen IV, fibronektin ve heparin sülfat proteoglikan) hazırlanır. Üçüncü olarak, fibroblastlar ve endotelial hücreler, bir kollajen-I karışımı içinde gömülü ve buna ek olarak HCT-8 epitel hücreleri, ardından biyoreaktörler RWV eklenir. Dördüncü olarak, primer lenfositler gün 4 ve 9 (± 1 gün) kültüre ilave edilmiştir."> Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Normal İnsan Bağırsak ve Organotipik Modelleri Arasında Karşılaştırılması. Hematoksilin ve 3-B yerçekimi modelinde kültürlenmiş hücrelerin eozin boyaması: dokular Mor lekeli ve iskele pembe lekeli. 3-D modeli hücreler kültürlendi 14 ( "A" ve "B") ve 20 gün boyunca (° C). Yirmi gün tohumlama sonra, toplam hücre sayıları korunur ve hücreler de farklılaşmış gösteren villus benzeri özellikleri vardı. Görüntüler 100X de ( "a" ve "b") ve 40X ( "c") büyütme. Görüntülenen bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Ürün adı | Pkg. Boyut | Sulandırma | çalışma Konsantrasyon | Depolama |
| Fibroblast Büyüme Faktörü-Basic (bFGF) | 25 mg | 25 ug / ml'lik bir stok çözelti hazırlamak için; steril bir ortamda 1 ml (RPMI artı% 1 FCS), girdap, çözülür, 100 ul / kısım ilave içine FGF 25 ug ekleme | 5 ng / ml | Toz -20 o C, çalışma alikotları -20 o C, tekrar donma önlemek / çözülme |
| Hücre Faktörü Kök (SCF) | 10 mg | 10 ug / ml'lik bir stok çözelti hazırlamak için; steril bir ortamda 1 ml (RPMI artı% 1 FCS), girdap, çözülür 250 ul / kısım ekleme olarak SCF 10 ug ekleme | 5 ng / ml | Toz -20 o C, çalışma alikotları -20 o C, tekrar donma önlemek / çözülme |
| Hepatosit büyüme faktörü (HGF) | 5 mg | 5 ug / ml stok çözelti hazırlamak için; steril bir ortamda 1 ml (RPMI artı% 1 FCS), girdap, çözülür 200 ul / kısım ilave içine HGF 5 ug ekleme | 2 ng / ml | Toz -20 o C, çalışma alikotları -20 o C, tekrar donma önlemek / çözülme |
| endotelin 3 | 50 mg | 50 ug / ml'lik bir stok çözelti hazırlamak için; steril bir ortamda 1 ml (RPMI artı% 1 FCS), girdap, çözülür, 100 ul / kısım ilave içine endotel 50 ug ekleme | 10 ng / ml | Toz -20 o C, çalışma alikotları -20 o C, tekrar donma önlemek / çözülme |
| laminin | 1 mg | 2 yavaş yavaş çözülme - 8 o C, girdap ve 100 ul / kısım eklemek | 10 mg / ml | Sıvı -20 o C, alikotları -20 o C çalışma, tekrar FRE önlemekeze / çözülme |
| Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF), | 10 mg | 5 ug / ml stok çözelti hazırlamak için; steril su 2 ml VEGF, 10 ug ekleyin, girdap, çözülür, 100 ul / kısım ekleme | 1 ng / ml | Toz -20 o C, çalışma alikotları -20 o C, tekrar donma önlemek / çözülme |
| Lösemi önleyici faktörü (LİF) | 50 mg | 20 ug / ml'lik bir stok çözelti hazırlamak için; steril su 2.5 ml LIF 50 ug ekleyin, girdap, çözülür, 100 ul / kısım ekleme | 4 ng / ml | Toz -20 o C, çalışma alikotları -20 o C, tekrar donma önlemek / çözülme |
| adenin | 25 g | 0.18 M'lik bir stok çözelti hazırlamak için; 0.05 M HCI 50 ml) su (50 ml% 37.1 HCI 250 ul) halinde 121.5 mg og adedine ekleme girdap çözünmesi için filtre sterilize ve1 ml ekleyin / kısım | 1.8 x 10 3 M | Toz 4 o C, çalışma alikotları -20 o C, tekrar donma önlemek / çözülme |
| ensülin | 50 mg | 5 mg / ml stok çözelti hazırlamak için; ), Girdap, çözülür filtre sterilize ve 0.5 ml ekleme (10 ml su içine 5 ul% 37,1 HCI) 0.005 M HCI 10 ml insülin, 50 mg / ekleme kısım | 5 mg / ml | Toz -20 o C, çalışma alikotları -20 o C, tekrar donma önlemek / çözülme |
| T3 | 100 mg | 2 x 10 -8 M stok çözelti hazırlamak için; 1 M NaOH 25 ml T3 3.4 mg ekleyin PBS 9.9 ml Bu çözeltiye 0.1 ml seyreltik steril, girdap çözünmesi için PBS 9.9 ml yine bu çözeltinin 0.1 mL seyreltik filtresi ve 0.5 ml ilave / alikosu | 2 x 10 -11 M | Toz -20 o C, çalışma alikotları -20 <sup> o C, tekrar donma önlemek / çözülme |
| kolera toksin | 5 mg | 10 -7 M stok solüsyonu hazırlamak için; 5 ml Kolera toksini 5 mg eklemek steril GKD 2 O (mağaza -20 o C'de); 5 mi GKD 2 O içine bu çözeltinin 50 ul seyreltik girdap homojenleştirme, filitre ile steril edilmiş ve 0.5 ml / kısım ekleme | 10 -10 M | Toz 4-8 o C, çalışma alikotları -20 o C, tekrar donma önlemek / çözülme |
| fibronektin | 1 mg | 1 mg / ml stok çözelti hazırlamak için; Steril saf su, 1 ml fibronektin, 1 mg ekleyin. 30 dakika bekleyin. malzeme için solüsyon içine gitmek için. ÇALKALAYIN VEYA SWIRL ETMEYİN. 100 ul / kısım ekleyin | 10 mg / ml | Toz 4-8 o C, çalışma alikotları -20 o C, tekrar donma önlemek / çözülme |
| apo-transferin | 100 mg (1,000x), 5 mg / ml stok çözelti hazırlamak için; eritmek için PBS girdap 20 ml transferin 100 mg ilave filtre sterilize ve 0.5 ml / kısım ekleyin | 5 mg / ml | Toz -20 o C, çalışma alikotları -20 o C, tekrar donma önlemek / çözülme | |
| heparin | 50 KU | (1,000x), 50 mg / ml stok çözelti hazırlamak için; çözünmesi için su girdap 1 ml heparin, 50 mg ilave filtre sterilize ve 1 mi / kısım ekleyin | 0.1 mg / ml | Toz -20 o C, çalışma alikotları -20 o C, tekrar donma önlemek / çözülme |
| Heparan sülfat proteoglikan | 1 mg | 0.1 mg / ml stok çözelti hazırlamak için; çözünmesi için steril su girdap 10 ml heparan sülfat 1 mg ekleyin ve 0.2 ml ilave / alikosu | 2 mg / ml | Toz -20 o C, çalışma alikotları -20 o C, önlemektekrar donma / çözülme |
| Kollajen IV | 5 mg | 2 mg / ml stok solutin hazırlamak için: steril% 0.25 asetik asit, 2.5 ml içinde kolajen V 2 mg. Solüsyon içine gitmek için malzeme için 2 saat daha iyi seyrelme için Girdap - 1 izin verin.. 400 ul / kısım ekleyin | 80 mg / ml | Toz -20 o C, çalışma alikotları -20 o C, tekrar donma önlemek / çözülme |
Tablo 1: Tanımlı Orta Ek hazırlanması.
| F-12 Orta ile desteklenmiş | |||
| reaktif | Ana çözelti | Son çözüm | miktar |
| Fetal buzağı serumu | % 10 | 50 mi | |
| sodyum piruvat | 100 mM | 1 mM | 5 mi |
| L-Glutamin | 200 mM | 2 mM | 5 mi |
| Hepes | 1M | 10 mM | 5 mi |
| gentamisin | 50 mg / ml | 50 ug / ml | 500 ul |
| Penisilin / streptomisin | 10.000 U / ml / 10 mg / ml | 100 U / ml / 100 ug / ml | 5 mi |
| ensülin | 5 mg / ml | 5 ug / ml | 500 ul |
| T3 | 2 x 10-8 M | 2 x 10 -11 M | 500 ul |
| adenin | 1.8 x 10-1 M | 1.8 x 10-3 M | 5 mi |
| transferrin | 5 ug / ml | 500 ul | |
| heparin | 50 mg / ml | 0.1 mg / ml | 1 mi |
| ECGS | 3 mg / ml | 3 mg / ml | 5 mi |
| bFGF | 25 ug / ml | 5 ng / ml | 100 ul |
| SCF | 10 ug / ml | 5 ng / ml | 250 ul |
| HGF | 5 ug / ml | 2 ng / ml | 200 ul |
| endotelin 3 | 50 ug / ml | 10 ng / ml | 200 ul |
| LIF | 20 ug / ml | 4 ng / ml | 100 ul |
| VEGF | 5 ug / ml | 1 ng / ml | 100 ul |
| Choleran toksini | 10 7 M | 10 -10 M | 500 ul </ Td> |
| Not: Yukarıda belirtilen miktarda 3-D kültür ortamı 500 ml hazırlanır. Ortam fazla 2 hafta boyunca 4 ° C'de saklanmalıdır | |||
Tablo 2: 3-D Kültür Medya hazırlanması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, primer insan lenfositleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri, hem de intestinal epitelyal hücre hatları 24 de dahil olmak üzere katları hücre tiplerinin oluşan insan bağırsak mukozasının bulasıcı modelinin oluşturulmasını tarif eder. Bu 3 boyutlu modeli, hücreler mikrogravite koşulları 24 altında kollajen zengin hücre dışı matris içinde kültüre edilir.
Daha önce açıklandığı gibi, bu modelin en önemli özellikleri şunlardır: (i) epitel doku tek tabakalı organizasyonu taklit yeteneği, epitel hücreleri, sıkı kavşaklar, dezmozomların ve mikrovilluslar uygun polarite (ii) indüksiyon, (iii) uzun yüksek birincil hücre canlılığı (yani., fibroblastlar ve endotel hücreleri) ile uzun süreli bir kültür (20 güne kadar), (IV) ifade villin sitokeratin, E-kadherin ve mu içeren doku gibi farklılaşma markerlericin, (v) yeteneği sitokinlerin önemli miktarlarda üretilmesi için (örn., IL-8) ve alkalin antijenik uyarımı üzerine fosfataz, (vi) glikoz gibi besin (ör., disakkarit ifade taşıma ve şeker varlığı taşıyıcılar), ve (vii) bağırsak epitel hücreleri (örn., emme enterosit, Globet ve M, hücre) 24 çok soyundan farklılaşması.
O iyi bir hücre kültürü yönergelerine 46-48 uymak zorundadır bizim 3-D modeli araştırmacı kullanarak tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için vurgulamak önemlidir. Sistematik canlılığı, mikoplazma kontaminasyonu ve hücre büyüme davranış değişiklikleri hücreleri kontrol etmek çok önemlidir. Bir sorun tespit edilirse, ilk yetkisiz değişiklik protokole tanıtıldı emin olun. Sorun devam ederse, çeşitli orta bileşenlerin (dahil serumu) ve / yeni bir toplu geçişveya hücreler. Bizim 3D modeli bir sınırlaması tümörijenik HCT-8 epitel hücre dizisinin kullanılmasıdır. Bununla birlikte, HCT-8 çizgisinin varlığı, ticari olarak temin edilebilir olma avantajı sunmaktadır dikkate alınması önemlidir. Ayrıca, bu epitel hücreleri, klasik ya da klasik olmayan ya da insan lökosit antijeni (HLA) eksprese etmeyen -class I 49,50 molekülleri. Böylece, bir epitelyal hücre PBMC alo-tepkiselliği yokluğunda haplotipleri farklı HLA sınıf PBMC epitel hücrelerinin kültürü sağlar. Böyle bağırsak kök hücre organoids 51-53 olarak sistemleriyle bu sistemi karşılaştırırken Dahası, bu model pek çok avantaj sunuyor. Bağırsak kök hücre organoids hücre biyolojisi ve bağırsak farklılaşma 51-53 hakkında çok değerli bilgiler sağlamakla birlikte, bu model besinler, ilaçlar ve patojenlere karşı direkt apikal poz verir. Bu model aynı zamanda lümen içeriği örneğin anti-mikrobiyal peptitler ve sitokinler kolay erişim sağlar. Bunun aksine, organoids un kompaktonun içe dönük bir lümen yüzeyi ile. Sonuç olarak, 54 lümeni organoid sokulabilir ürünün sınırlı bir miktarda mevcuttur.
İnsan bağırsak mukozasının bizim çok hücreli 3-D Organotipik modeli patojenler ile etkileşim, antijen kaçakçılığı ve enflamatuar ve metabolik 24 süreçleri de dahil olmak üzere, sağlık ve hastalık hem de keşif için bir araç olarak geniş çaplı bir potansiyele sahip olduğuna inanıyoruz. Nihayet, bizim 3-D modeli çok hücreli doğası gereği, bizim modeli in vivo epitel hücre davranışını etkilemek için muhtemeldir bağışıklık hücre türlerini kullanarak gain- ve zarar çalışmalarını sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor | Synthecon | RCCs-4DQ | For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available. |
| Disposable 50 ml-vessel | Synthecon | D-405 | Box with 4 vessels |
| HCT-8 epithelial cells | ATCC | CCL-244 | |
| CCD-18Co Fibroblasts | ATCC | CRL-1459 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | CRL-1730 | HUVEC |
| Fibroblast Growth Factor-Basic | Sigma | F0291 | bFGF |
| Stem Cell Factor | Sigma | S7901 | SCF |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | HGF |
| Endothelin 3 | Sigma | E9137 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Vascular Endothelial Growth Factor | Sigma | V7259 | VEGF |
| Leukemia Inhibitory Factor | Santa Cruz | sc-4377 | (LIF |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Insulin | Sigma | I-6634 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T-6397 | T3 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Fibronectin | BD | 354008 | Isolated from human plasma |
| apo-Transferrin | Sigma | T-1147 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Heparan sulfate proteoglycan | Sigma | H4777 | Isolated from basement membrane of mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | Isolated from human placenta |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| D-MEM, powder | Invitrogen | 12800-017 | |
| 10% formalin–PBS | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Bovine type I collagen | Invitrogen | A1064401 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | MT25-052-CI | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
| Penicillin/streptomincin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Ham's F-12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010-046 | BME |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM-2 |
| Endothelial cell growth supplement | Millipore | 02-102 | ECGS |
References
- Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
- Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
- Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
- Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
- Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
- Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
- Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
- Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
- Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
- Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
- He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. , (2015).
- Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
- Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
- Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
- Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
- Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
- Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
- Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
- Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
- Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
- Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
- Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. , (2010).
- Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651 (2014).
- Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
- Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
- Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
- Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
- Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
- Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
- Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. , e51064 (2014).
- Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
- Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
- Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
- Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
- Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. , (2014).
