Introduction
O estudo dos órgãos isolados permite o controle das condições fisiológicas além do que é possível in vivo. Ex vivo preparações de coração foram descritos pela primeira vez por Otto Langendorff, 1, que descreveu um modelo isolado com perfusão retrógrada. Posteriormente, outros descreveram o modelo "working heart", em que o miocárdio executa tanto o trabalho de pressão e volume. 2 Estas preparações têm sido fundamentais para elucidar os mecanismos de ação do miocárdio, 3 metabolismo miocárdico, 4-6 e efeitos de medicamentos cardiotônicos. 7- 9
O uso de medicamentos que melhoram a contratilidade miocárdica é comum em pacientes criticamente enfermos. No entanto, poucos dados disponíveis comparando os efeitos relativos desses medicamentos na contratilidade e do consumo de oxigênio pelo miocárdio, os dados que podem ser úteis no tratamento de pacientes com sinais clínicos de insuficiência cardíaca de no cenário pós-operatória. 10 No entanto, porque a maioria dos medicamentos cardiotônicos afectam não só o miocárdio, mas também a resistência arteriolar, capacitância venosa 11, e da taxa metabólica de um paciente, 12 ex vivo modelos em corações isolados continuam a ser os meios ideais pelos quais a estudar os efeitos de tais medicamentos no miocárdio adequada.
Descreve-se a utilização de um modelo ex vivo para o estudo independente da carga de fármacos inotrópicos na função do miocárdio e do consumo de oxigénio. Corações de ratos Sprague Dawley foram canulada usando um ventrículo esquerdo trabalhando modelo de coração e perfusão usando um perfusato Krebs Henseleit modificado. pressões da aorta e átrio esquerdo foram controlados. Pressão-volume cateteres de impedância foram colocadas no ventrículo esquerdo através de punção apical para a monitorização contínua da função sistólica e diastólica. O consumo de oxigênio foi continuamente medida como a diferença indexada no teor de oxigénio entre perfus do átrio esquerdocomeram e o efluente da artéria pulmonar. Os medicamentos a serem testados foram infundidas no bloco do átrio esquerdo, e alterações no metabolismo do desempenho cardíaco e oxigénio foram medidos e comparados com uma linha de base imediatamente anterior.
Protocol
Este protocolo é realizada sob um protocolo atual em comissão de cuidados com os animais e a utilização da instituição.
1. Preparação para o Estudo
- Ligar o banho de água para aquecer o reservatório de tampão de Krebs-Henseleit (KHB) (definido como 42 ° C).
- Preparar 16 litros de KHB contendo (em mM) 128 de NaCl, 5,7 de KCl, 1,3 MgSO4, 25 NaHCO3, 2,7 CaCl2, 0,53 de EDTA, 0,54 NaC 3 H 3 O 3, e 10,8 dextrose. 13 As massas de substrato são como se segue : 27,584 g de NaCl, 1,58 g de KCl, 0,578 g de MgSO4, 8,401 g de NaHCO3, 1,47 g de CaCl2, 0,744 g de EDTA, 0,22 g de NaC 3 H 3 O 3, e 7,208 g de dextrose.
Nota: estes componentes podem ser armazenados em tubos cónicos na forma de pó para reconstituição no dia da experimentação.- Filtro de 4 L de água desionizada através de um filtro de 0,22 micron.
- Adicionar 3,7 L de água a esta de 4 Ltaça. Adicionar todos os componentes, excepto para CaCl2 à água.
- Dissolve-se o CaCl2 nos restantes 300 ml de água utilizando um copo separado.
- Oxigenar a solução com 95% de O2 / 5% de CO 2 a 1 L / min (LPM) durante 5 min. Isto corrige o pH para 7,40 e aumenta a dissolução do CaCI2.
- Adicionar o CaCl 2 a parte restante do KHB.
- Adicione o KHB concluído para um reservatório e circular por toda a tubulação para 30 min. Certifique-se de que o sistema está livre de bolhas macroscópicos. Oxigenado com 95% O2 / 5% de CO 2 a 0,5 LPM.
NOTA: KHB pode ser armazenado durante a noite no frigorifico durante não mais do que 1 - 2 dias, trazida de volta para a temperatura ambiente e filtrou-se para re-utilização. Não reutilize KHB entre os experimentos. - Prepare 2 x 50 ml copos limpos com KHB gelada e coloque-os em um balde de gelo perto da estação de dissecção. Certifique-se de que a KHB é frio (e não refrigerados) antes de ex plantando o coração.
- Posicionar o cateter de micro pressão-volume (PV) numa seringa de 10 ml cheia com KHB filtrada durante 30 min antes da calibração, conforme as instruções do fabricante.
NOTA: Temperatura de KHB usada para embeber o cateter PV deve ser o mais próximo de 37 ° C quanto possível.
- Preparar a anestesia e a estação de dissecação para o animal.
- Certifique-se de isoflurano adequada no reservatório. Elaborar 500 U de heparina numa seringa de 1 ml; colocar uma agulha de calibre 26 (1/2 ") nesta seringa. Prepara-se uma máscara para anestesiar o animal.
- Ajuste a pressão bloco de perfusão aórtica 80 mmHg eo átrio esquerdo (AE) pressão bloco de perfusão 10 mmHg. tanto o bloco aórtica aberta e bloco de LA para permitir quente KHB a escorrer para fora. Quando estiver pronto para dissecar o animal, abrir o bloco aórtica para permitir um gotejamento lento constante de KHB fora.
- Calibra-se o cateter fotovoltaico de acordo com as instruções dos fabricantes.
NOTA: Para obter melhores resultados, certifique-animal é entre 300 e 500 g; verificou-se que um peso do animal entre 425-450 g é ideal para o nosso sistema.
- Anestesiar o animal numa câmara de isoflurano utilizando (1 - 2%) até que o animal está inconsciente. Transferir o animal para a estação de dissecção e colocar a máscara de anestesia com isoflurano e oxigénio no animal. Execute toe pitada para avaliar o nível de sedação. Aplicar vet pomada nos olhos para evitar a secura e sob anestesia.
- Injectar heparina, 500 unidades por via intraperitoneal na cavidade abdominal. Permitir 10 min para a heparina de forma a ser absorvido. Fixe os membros do animal com fita para melhorar a visualização do tórax.
- A dissecção do coração.
- Depois de assegurar que não há resposta a um aperto do dedo do pé, levantar a pele para longe da cavidade abdominal com uma pinça e, em seguida, utilizar tesouras de incisão da cavidade peritoneal, a seguir a curva de tele diafragma volta ao ângulo posterior das costelas.
- Uma vez que o diafragma é visível, utilizando uma tesoura pequena, cortados ao longo da superfície anterior do diafragma seguindo a direcção dos cortes anteriores para permitir a entrada no tórax. Estender cada corte ao longo da linha axilar bilateral para a axila.
NOTA: Os próximos passos devem ser realizados de forma eficiente uma vez que a ventilação será comprometida uma vez que o diafragma é incisão. - Retrair a caixa torácica anterior do processo xifóide usando uma pinça. Inciso pericárdio e pleura.
- Identificar a veia cava inferior (VCI) e aorta logo acima do diafragma e retraem-los em bloco anterior usando uma pinça sem corte.
- Usando grandes, tesoura curva, rapidamente fazer uma incisão através da VCI e aorta, puxando o coração e os pulmões para fora do peito em bloco. Corte as esófago, traqueia, artérias e veias braquiocefálicas cefálica para remover o coração e os pulmões do tórax. Extirpar o teutecido mic com este bloco de tecido. Tome cuidado para não cortar a porção proximal da aorta ascendente.
- imediatamente mergulhe o coração e os pulmões em KHB gelada e passar para o aparelho de Langendorff, previamente configurado conforme descrito na etapa 1.
3. aórtica Canulação
- Colocar o complexo de coração-pulmão de um prato liso e orientar o coração com o timo e grandes vasos de frente para o experimentador e do aspecto posterior dos pulmões de frente para a mesa. Separar os dois lóbulos do timo e identificar a decolagem das artérias braquiocefálicas da aorta.
- Armar a aorta ao longo da borda do prato e transecto da aorta usando uma tesoura pequena aproximadamente 5 mm acima da válvula aórtica, apenas proximal à decolagem da artéria subclávia direita.
NOTA: A incisão deve render um círculo limpo - a aorta na secção transversal. Se estiver desligado angular (ou seja, uma grande oval)ou incompleta, repetir o corte para atingir o resultado desejado. Isso irá facilitar o uso da aorta eficiente.
- Armar a aorta ao longo da borda do prato e transecto da aorta usando uma tesoura pequena aproximadamente 5 mm acima da válvula aórtica, apenas proximal à decolagem da artéria subclávia direita.
- Usando 2 pares de pinças curvas em ambos os lados da aorta, orientar a aorta através da cânula aórtica (que deve ser gotejando lentamente com KHB). A válvula aórtica deve sentar-se 1 - 2 mm abaixo da ponta da cânula.
- Após punção aorta, reposicionar a pinça perpendicularmente ao longo da aorta para segurar a aorta no lugar. Alternativamente, coloque uma pequena braçadeira do outro lado da aorta para manter o complexo de pulmão coração no lugar, permitindo que um único experimentador para completar este modelo.
- Ter um assistente passar um fio de seda 4-0 logo abaixo do fórceps e gravata no lugar, looping em torno da cânula e amarrando várias vezes, tanto na frente e atrás do coração. Abra a cânula totalmente para começar fluxo aórtico retrógrada completo. Observe o coração bater vigorosamente.
NOTA: Se o coração não começa a bater rapidamente (~ 200 BPM) e vigorosamente, oamarrar ou cânula podem ser ocluir uma ou de ambas as artérias coronárias. Se esse é suspeito, remova o empate e reposicioná-lo longe das artérias coronárias. Se o coração distende e não bater, a cânula pode ser através da válvula aórtica. Em caso de vazamento da artéria coronária (sprays KHB a partir da raiz da aorta), o avanço da cânula mais perto da válvula aórtica (este fenómeno pode ocorrer se a artéria inominada é canular no lugar da aorta ascendente).
4. Veia Pulmonar Oclusão e Preparação da artéria pulmonar para Canulação
NOTA: O objectivo deste passo é o de criar um sistema do átrio esquerdo fechado para assegurar que todo o volume e a pressão a partir do bloco átrio esquerdo é transmitida para as estruturas do coração esquerdo. Fracasso para ocluir completamente as veias pulmonares pode resultar em deficiência de pré-carga e pode falsificar resultados ou criar uma preparação de coração de trabalho instável.
- Remover o timo para melhorar a exposição de the artéria pulmonar (AP).
- rodar manualmente a cânula da aorta de modo a que o aspecto posterior do coração está de frente para o operador. Dissecar os vasos principais para o pulmão direito. Suspender o tecido pulmonar direita usando uma pinça para delinear mais destes navios. Usando grampos cirúrgicos de médio-grande (ou sutura), oclusão da artéria pulmonar direita e veia e brônquios com um único clipe. Ressecar o distal pulmão direito ao clipe.
NOTA: Devido a dificuldade de dissecção da artéria pulmonar livre, a nossa prática é a oclusão das veias pulmonares para a distensão da artéria pulmonar, tornando mais fácil para inciso sem prejudicar as estruturas vizinhas em um modelo de coração batendo. - Repita o passo 4,2 no pulmão esquerdo.
NOTA: armadilhas potenciais e resolução de problemas: Uma vez que ambas as artérias pulmonares são ocluído, o átrio direito visivelmente distender e o coração pode tornar-se bradicardia. Isto é porque o ventrículo direito fica pressurizado. Se isto não ocorre, é provável que o pulmveias onary não são completamente obstruída, e a pré-carga que irá ser insuficiente para trabalhar o modo de coração. Se o coração não é capaz de manter o débito cardíaco após atrial esquerdo (AE) canulação e tentativa de transição para o coração (veja abaixo) de trabalho, considerar a colocação de clipes adicionais ou um laço ao redor dos troncos das veias pulmonares para ocluir qualquer vazamento residual. Uma vez que os APs são ocluídas, no entanto, Passo 5 deve ser efectuada imediatamente para minimizar a isquemia do miocárdio. Note-se que alguns investigadores incisão na artéria pulmonar antes da ligação das veias pulmonares para evitar a pressurização do ventrículo direito. - incisão arterial pulmonar
- Girar a cânula da aorta de modo a que o aspecto anterior do coração está de frente para o operador. Identificar a artéria pulmonar. Mais uma vez, esta artéria pode ser distendido. Com uma tesoura pequena fazer uma incisão transversal aproximadamente 3 mm acima da válvula pulmonar.
NOTA: Este será imediatamente aliviar a pressão ea frequência cardíaca pode aumentar. Estarcausar esta cânula é fácil para desalojar, canular a artéria pulmonar após canulação do átrio esquerdo é completa.
- Girar a cânula da aorta de modo a que o aspecto anterior do coração está de frente para o operador. Identificar a artéria pulmonar. Mais uma vez, esta artéria pode ser distendido. Com uma tesoura pequena fazer uma incisão transversal aproximadamente 3 mm acima da válvula pulmonar.
5. Atrial Esquerdo Canulação
- Girar a cânula da aorta de modo a que o átrio esquerdo está de frente para o operador. Usando as pequenas tesouras, fazer um 2 - mm incisão 3 na parte superior do corpo do átrio esquerdo, cerca de 3 mm acima do sulco atrioventricular.
- Posicione a cânula atrial esquerda perpendicular ao plano da válvula mitral e apontou para o septo atrial.
- Abra a cânula LA KHB até que flui. Certifique-se de que a KHB é quente ao toque (fica frio rapidamente quando sentado em qualquer tubo não revestido), a fim de evitar a disfunção miocárdica devido à hipotermia seguinte transição para o modo de funcionamento. Transição para uma taxa de gotejamento durante a punção.
- Utilizando uma pinça para segurar contra-tração, insira a cânula atrial para o corpo do átrio esquerdo, tomando cuidado para não usar excessive força, que pode rasgar o átrio.
NOTA: O LA cânula deve ser posicionado de modo que fica no meio do átrio sem qualquer tensão na parede atrial. - Passe uma sutura de seda 4-0 ao redor do corpo do átrio esquerdo e dê um nó para criar um selo do átrio ao redor da cânula. Ter o cuidado de assegurar que a face posterior do átrio esquerdo está incluído na sutura. Adicionar suturas adicionais, conforme necessário. Uma vez selado, puxar a cânula para trás 1 - 2 mm, de modo que fica no meio do átrio e não contra o septo auricular.
NOTA: O motivo mais comum que o coração se torna malperfused na transição para trabalhar modo de coração é que a cânula LA confina com o septo atrial, que obstrui entrada do átrio esquerdo. O traçado LA muitas vezes muda de demonstrar uma adequada uma onda de onda e v quando a cânula é na posição correta (veja a Figura 2E). - Abrir a válvula de LA cânula para administrar inteiramente a pré-carga completa ao átrio esquerdo. monitorar otaxa de gotejamento do coração (que vem de efluentes coronária). Certifique-se de que a taxa de gotejamento não muda quando a cânula LA está aberta. Se isso acontecer, retie o átrio em torno da cânula, como descrito no passo 6.4, como tal representa uma fuga no sistema.
6. A canulação da artéria pulmonar e Transição para Trabalho Modo Coração
- Se a medição do consumo de oxigênio pelo miocárdio (ou outras substâncias em efluentes coronária, tais como os níveis da droga ou citocinas), insira 1/32 "tubo flexível dentro da incisão antes na artéria pulmonar.
NOTA: O consumo de oxigênio é medido como a diferença no teor de oxigénio entre perfusato atrial esquerda e efluentes artéria pulmonar 2.- Para a medição contínua do consumo de oxigênio pelo miocárdio, usar um eletrodo de oxigênio in-line para comparar atrial esquerda e efluente do seio coronário.
- Recolha efluente do seio coronário (tanto da artéria pulmonar e pingando do coração) em um cil formouinder para quantificação temporizada de fluxo coronário.
- Calcule o consumo de oxigênio pelo miocárdio, como descrito anteriormente. 2
- A transição para o trabalho modo de coração, desligando a bomba retrógrada da aorta.
NOTA: Quando isto é feito, a pressão torna-se LA a pressão de pré-carga e o resistor que foi anteriormente proporcionando resistência à bomba retrógrada no modo de Langendorff proporciona agora resistência ao débito cardíaco, a criação de uma pressão arterial média. Se a pressão arterial média declina abaixo ~ 80 mmHg, a causa provavelmente está relacionado a qualquer pré-carga ou a função miocárdica. O problema mais provável é a cânula atrial esquerdo, que deve ser ajustada depois de reiniciar a bomba retrógrada.
7. Inserção do Ventrículo Esquerdo Cateter Volume Pressão
NOTA: O cateter PV pode ser colocado quer retrógrada (através da válvula aórtica) ou através de punção apical. O benefício de retrógrada é que pOSIÇÃO é mais consistente e que obvia a necessidade de punção apical e os riscos concomitantes de lesão coronária ou perda de pré-carga. No entanto, a colocação retrógrada às vezes pode ser muito desafiador, por isso, descrevem ambas as técnicas aqui.
- Anexar um cateter 1,4 pressão-volume francês para o sistema de circuito de volume pressão. Calibrar o sistema em KHB quente de acordo com as instruções do fabricante. Assegurar a forma de onda é visível em tempo real. Traga o cateter e cabos perto da superfície do VE, de modo a não deslocar-lo após a colocação.
- Para a colocação retrógrada, abra a válvula ajustável e alimentar o cateter PV gentilmente através da válvula aórtica até a pressão estável e forma de onda de volume são identificados. Evite o uso excessivo da força, que pode danificar a válvula aórtica ou perfurar o ápice ventricular.
NOTA: Nós descobrimos que é importante para minimizar o comprimento da tubulação e número de voltas que o cateter PV deve navegar para abordar o AV. istopode ser útil para reduzir a tubagem que vem com o sistema. - Para a colocação apical, use um 24 G angio-cateter para criar uma punção apical no VE. Certifique-se de evitar a artéria descendente anterior coronária. Aponte a agulha na direcção da válvula aórtica do ápice ventricular. Avançar o cateter de pressão-volume no corpo da LV. Pare o avanço do cateter, logo que a pressão e o volume da forma de onda do LV é identificado.
- Uma vez que o cateter de pressão-volume está no lugar, movimentar a camisa de água em posição à volta do coração. Fixar o cateter para a parede da camisa de água com um pequeno pedaço de fita adesiva.
- Certifique-se de, pelo menos, um período de 30 min da estabilidade antes de iniciar quaisquer medidas ou intervenções.
8. A infusão de medicação
- (Opcional) infundir medicamentos (por exemplo, dopamina) para o bloco do átrio esquerdo, utilizando uma bomba de medicação padrão.
NOTA: Temos medicamentos dosados de acordo com o whole peso do corpo do animal desde que o fluxo equivalente a um débito cardíaco inteira passa através do bloco de fibrilação; apenas uma pequena porção desta passa através da circulação coronária, como faz in vivo. Alternativamente, um segundo conjunto de perfusato pode ser criada com uma concentração predefinida de medicação e utilizada para perfundir o coração.
NOTA: Em nosso protocolo, nós infundir medicamentos ao longo de um período de 12 min, a coleta de dados fisiológicos durante a final de 10 minutos de cada infusão e comparando-o a um imediatamente anterior 10 min de base.
9. Manipulações fisiológicas
- Frequência cardíaca
- (Opcional) sutura dois fios de estimulação na parede do átrio direito e anexar a um dispositivo temporário de estimulação.
NOTA: Este permite um controlo preciso da taxa cardíaca (acima da taxa sinusal nativa) e uma compreensão da relação entre a frequência cardíaca e da contractilidade independente de um medicamento cardiotónico.
- (Opcional) sutura dois fios de estimulação na parede do átrio direito e anexar a um dispositivo temporário de estimulação.
- preload
- variar apré-carga (definido como o volume diastólico final do ventrículo esquerdo), variando a altura da coluna de alimentação do bloco átrio esquerdo.
- Pressão sanguínea
- Manipular a pressão arterial (o principal determinante da pós-carga neste modelo) usando as válvulas de pressão na IH-51.
- teor de oxigénio coronária
- Realizar vários graus de hipóxia miocárdica por perfusão do coração com KHB saturado em várias misturas de gases. Faça isso usando reservatórios encamisados separados (cada um com a sua própria mistura de gás) para assegurar o equilíbrio entre o gás e KHB.
- Realizar isquemia coronária por meio de sutura ligar uma artéria coronária distal.
NOTA: A ligadura das artérias coronárias proximais no modo de coração de trabalho pode resultar em disfunção miocárdica letal. - Induzir isquemia coronária mundial, interrompendo ou retardando perfusão retrógrada por um período de tempo definido.
Representative Results
Um diagrama esquemático de um coração totalmente instrumentada em perfusão retrógrada (Figura 1A) e no coração de trabalho ventricular esquerda (Figura 1B). Aórticas típica, átrio esquerdo e pressão ventricular esquerda e de volume traçados são mostrados na Figura 2A -. D A pressão típica diastólico final é de cerca de 3 - 5 mm Hg neste modelo, e o pico de pressão sistólica é de cerca de 100 mmHg Figura 2E mostra a mudança. no lado esquerdo rastreio fibrilação quando a cânula LA é movido para longe do septo atrial durante a colocação e posicionamento da cânula. Nestas experiências, a pressão aórtica foi fixado em 90 mm Hg, e a pressão LA foi ajustado para 10 mmHg.
Para testar os efeitos das catecolaminas, cada parâmetro fisiológico (derivado principalmente a partir do cateter de pressão-volume e software associado) foi comparado com o que precede imediatamente período de referência. No exemplo mostrado, a dopamina foi infundida a 15 ng / kg / min para dentro do bloco átrio esquerdo. Embora a pressão diastólica final é idêntica nas duas condições (dada a pressão atrial corrigido neste modelo), o volume diastólico final do ventrículo esquerdo diminui em 2,5%, e o volume sistólico final do ventrículo esquerdo diminui 4,9%, obtendo-se um aumento do volume sistólico (Figura 3A). Em comparação com as infusões de placebo, o trabalho ventricular esquerda acidente vascular cerebral, identificada como a área dentro da curva de pressão-volume, um aumento de 32% durante o tratamento com a dopamina (Figura 3B, P <0,001, teste t, n = 10 por grupo). Isto foi associado com um maior aumento no consumo de oxigénio do miocárdio em relação ao placebo infusões (Figura 3C). Desta forma, os custos de energia e potência relativas de diferentes medicamentos cardiotónicos e doses pode ser comparado a um outro independente dos seus efeitos sobre as condições de carga.
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Figura 1: Diagrama de Fluxo em um coração totalmente instrumentada em retrógrado perfusão e Modo Coração de Trabalho (Painel A: modo de Langendorff; Painel B:.. Modo de coração a trabalhar no modo retrógrado, KHB é infundida a uma pressão de ajuste de perfusão na raiz da aorta. este modo é utilizado para recuperar o miocárdio seguinte tempo de isquemia e durante a instrumentação. ao trabalhar modo de coração, perfusato flui através do coração esquerdo antes de perfusão da circulação coronária. neste modo, o miocárdio deve gerar sua própria pressão de perfusão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
FIGURA 2: Pressão Representante e Desconto traçados obtidos durante as medições da linha de base. (A) Pressão na raiz aórtica, (B) a pressão atrial esquerda, (C) a pressão ventricular esquerda e (D) traçados volume ventricular esquerdo durante uma medida de referência são exibidos. O volume sistólico, trabalho acidente vascular cerebral, o débito cardíaco, tau, e outros parâmetros podem ser automaticamente calculado e exibida em tempo real pelo software. Um traçado embotada átrio esquerdo (E) associada a um débito cardíaco pobre no modo coração de trabalho pode ser um indício de que a cânula é mal posicionado no átrio esquerdo. Note que o v onda de destaque no traçado de pressão do átrio esquerdo bem colocado é comum, provavelmente devido a uma diminuição da complacência atrial esquerda no animal totalmente instrumentada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeito da dopamina. Sobre a pressão-volume Curva da infusão de dopamina resulta em um deslocamento para a esquerda na curva de PV (A), incluindo um aumento do volume da pulsação, diminuiu terminar volume sistólico, em comparação com as medições da linha de base. Note-se que a forma de alguns componentes destas curvas PV diferem daqueles tipicamente medida in vivo (ver Figura 4), devido à ausência de pressão arterial e Elastância venosa. (B) relativa a uma linha de base imediatamente anterior, o trabalho de acidente vascular cerebral aumentou significativamente mais durante as infusões de dopamina do que o placebo (**, P = 0,0017, teste t), assim como o consumo de oxigénio do miocárdio (*, P = 0,013, t-teste, C). Usando esse modelo, o consumo de oxigênio do miocárdio médio na linha de base foi de 0,22 ± 0,02 mmol O2 / grama de tecido / minuto, utilizando um dissolv estimadoEd teor de oxigénio de 165 nmol / L em solução salina a 40 ° C. Tais medições podem ser usados para comparar o consumo de oxigênio do miocárdio de vários medicamentos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise de Loops Desconto Pressão. The Loop Pressão-Volume teórico Mostrado descreve o ciclo normal cardíaca após o fechamento da válvula aórtica (AV) (1), a contração isovolêmica ocorre (1 - 2). Como a pressão ventricular cai abaixo da pressão atrial. A duração desta fase está representada por Tau. A válvula mitral (MV), em seguida, abre simultaneamente com a sístole auricular, o enchimento do ventrículo (2-3). Sístole, em seguida, começa com contracti isovolêmicaem (3-4) até que a pressão ventricular exceder a pressão arterial diastólica, momento em que o abre AV. Volume sistólico é a diferença entre as linhas 1 - 2 e 3 -. 4 trabalho acidente vascular cerebral é a área dentro da 1 - 2 - 3 -. Curva 4 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este modelo de coração de trabalho permite a avaliação do desempenho ventricular com controle total da pré-carga ventricular e pós-carga, tensão de oxigênio do perfusato, bem como a frequência cardíaca. Entre outros fatores, que permite a avaliação dos efeitos do miocárdio intrínsecas de medicamentos inotrópicos independentes da pós-carga e pré-carga, que maneiras que não são possíveis utilizando um modelo in vivo. Porque este modelo utiliza um perfusato cristalóide, que permite a avaliação do miocárdio sem interferência da hemoglobina, o que simplifica a análise espectroscópica de estados de energia do miocárdio, por exemplo. 14 Neste modelo, o átrio direito não é canulada como parte de nossa instrumentação, embora seja possível ao fazê-lo. Nós intencionalmente escolheu não fazê-lo, a fim de facilitar a amostragem de fluxo seio coronário para a avaliação do consumo de oxigênio pelo miocárdio. Importante, porém, o coração direito ainda executa o trabalho pressão e volume neste modelo, uma vez que as bombas de cosinus coronário fluir para dentro da cânula da artéria pulmonar. Fornecendo algum pré-carga do ventrículo direito melhora o posicionamento do septo ventricular e melhora o desempenho do ventrículo esquerdo, e é um componente importante deste modelo. 15
Existem várias armadilhas experimentais de mencionar. A primeira é a canulação retrógrada inicial, a qual deve ser executada de modo expedito (isto é, em menos de 2 min) para minimizar o período de isquemia. A habilidade mais importante mestre é o isolamento eficiente, preparação e manipulação da aorta ascendente. É importante que o coto aórtico não ser cortado excessivamente curto, deixando espaço suficiente para a canulação por cima da válvula da aorta. No entanto, também é importante que o coto aórtico não ser demasiado longo, o que pode causar torqueing da aorta em torno da cânula. Também é importante que a cânula da aorta e da raiz da aorta ser apropriadamente escolhidos de tamanho. Um excessivamente grande aorta em uma pequena cânula também podelevar a torqueing da raiz da aorta na cânula. A artéria subclávia direita normalmente tira da aorta ascendente aproximadamente 7 mm acima da válvula aórtica. Identificar os vasos braquiocefálicos (cerca de 1 mm de diâmetro) durante a dissecção e corte da aorta servem como marcos importantes para a incisão aórtica transversal. Aparar a aorta logo abaixo da decolagem do primeiro artéria inominada é aconselhável. A inclusão deste navio na raiz da aorta aparado geralmente leva a um vazamento de KHB e perda de pressão da raiz da aorta após a transição para o modo de funcionamento do coração.
Outro aspecto tecnicamente desafiador de canulação é a canulação do átrio esquerdo. Embora seja possível para canular o apêndice atrial esquerdo, verificou-se que a cânula frequentemente fica preso dentro do apêndice, e não passar facilmente para dentro do corpo do átrio esquerdo. Assim, prefere-se fazer a incisão no corpo do átrio esquerdo, aproximadamente2 mm superior ao sulco atrioventricular. É importante para posicionar a cânula da auricula esquerda no plano correcto antes da inserção, a fim de evitar que se rasgue o átrio parede fina ao fixar a cânula.
Verificou-se que o tamanho ideal da incisão átrio esquerdo foi de aproximadamente 3 mm. Criando muito pequena de uma incisão também pode fazer a colocação da cânula da auricula esquerda mais difícil, e pode levar à ruptura do átrio esquerdo. Nós usamos um 8 mm, peça reta, chanfrada do tubo de oxigênio-impermeável (diâmetro interno 2,9 mm) no bloco do átrio esquerdo. Verificou-se que utilizando este, em vez de uma cânula com um bordo chanfrado, leva a canulação fibrilação mais consistente e facilita o processo de fixação do bloco átrio esquerdo. Independentemente da tubagem utilizada, é importante para garantir que a extremidade do tubo não é obstruída pelo septo atrial ou a válvula mitral (como acima descrito, verificou-se que o traçado da pressão atrial esquerda foi útil neste Regard), como até mesmo sutil movimento da cânula atrial pode alterar significativamente a pré-carga do ventrículo esquerdo e medidas hemodinâmicas resultantes. Pela mesma razão, é importante para garantir que o átrio esquerdo não vaza seguinte após a abertura do bloco átrio esquerdo. É importante, independentemente do tipo de tubo utilizado para assegurar que o tubo dentro deste sistema é impermeável ao oxigénio para garantir a entrega de oxigénio adequado ao coração.
Outro aspecto um desafio técnico do processo foi a colocação do cateter de pressão-volume (PV). Nós inicialmente favoreceu uma colocação retrógrada do cateter através do bloco da aorta. Embora tecnicamente viável, que encontramos a ser muito mais simples e conveniente para colocar o cateter PV através de punção transapical. Deve ser tomado cuidado para monitorizar a posição do cateter ao longo da duração da experiência, como por vezes o cateter pode mover-se dentro ou para fora do ventrículo esquerdo. Isto pode ser feito através da monitorização do pressuRe e traçados de volume ao longo do tempo.
Finalmente, os cuidados devem ser tomados para garantir que a solução KHB é criado fresco para cada experimento. É possível pesar os constituintes de KHB e armazená-los em tubos cônicos em forma de pó antes do tempo. No dia da experimentação, estes podem ser misturados com água estéril, filtrada, dióxido de carbono / oxigénio, e, em seguida, adição de cálcio à mistura. É também importante para lavar o sistema com um detergente em pó activo da enzima, tais como Tergazyme (ou semelhante) e substituir o filtro perfusato regularmente.
Vários limitações desta preparação experimental, devem ser observadas. Primeiro, semelhante a todas as preparações de Langendorff perfundido-cristalóides, KHB e outras perfusatos asanguinous têm um oxigênio diminuiu significativamente a capacidade de carga em relação ao sangue. Embora esta é parcialmente compensada através da vasodilatação coronária e fluxo coronário suprafisiológica, a preparação não é inteiramente physiologiC por esta razão. Em segundo lugar, devido à conformidade quase infinita da câmara Windkessel utilizado no presente instrumento, as pressões sistólica e diastólica são apenas minimamente separada (ver Figura 2A) e, assim, a pressão de perfusão coronária é não fisiológica. Isto pode ser superado em modelos futuros através da incorporação de um componente Elastância ao bloco de pós-carga. Em terceiro lugar, como com todas as preparações de coração isolado, o coração passa por um período definido (2-3 min) de isquemia quente, que é susceptível de criar lesão miocárdica ou disfunção. Minimizando esta lesão através da prática da técnica é de extrema importância para resultados representativos. Além disso, embora necessário para o bem-estar animal, os anestésicos inalados pode servir como um supressor do miocárdio no início do processo de reperfusão, embora seja esperado que este efeito é rapidamente abolida como o coração é reperfundidos com KHB.
O sistema descrito permite trabalhar o coração para uma ampla variedade de Physiolinvestigações OGIC relevantes para a assistência ao paciente, pesquisa e ensino. Com algumas modificações adicionais, o sistema também pode ser utilizado para simular a fisiologia importante relevante para a doença cardíaca congénita, incluindo a hipertensão pulmonar e fisiologia único ventrículo. As limitações incluem a que é uma preparação ex vivo, que o coração está a ser perfundido por um tampão, em vez de um sangue de conteúdo de oxigénio mais elevado.
Acknowledgments
O equipamento e as experiências descritas aqui foram financiados pelo Departamento de Cardiologia do Hospital Infantil de Boston e por doações filantrópicas da família Haseotes. Somos gratos a Drs. Frank McGowan e Huamei Ele por nos fornecer as primeiras experiências com este modelo, e Lindsay Thomson para obter ajuda com trabalhos de arte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | 8.401 g/4 L |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | 0.744 g/4 L |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | 1.580 g/4 L |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | 0.578 g/4 L |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | 0.220 g/ 4 L |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | 27.584 g/4 L |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | 7.208 g/4 L |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | 1.470 g/4 L |
| Biventricular working heart model | Harvard Apparatus | IH-51 | |
| Pressure volume catheter | Millar, Inc | SPR-944-1 | 6 mm spacing catheter used |
| LabChart Pro 8 | AD Instruments | Version 8.1 |
References
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