Gnagare Working Heart modell för studier av Myocardial prestanda och syreförbrukning

Introduction

Studiet av isolerade organ medger kontroll av fysiologiska betingelser utöver vad som är möjligt in vivo. Ex vivo hjärtpreparat beskrevs först av Otto Langendorff, ^en som beskrev en isolerad modell med retrograd perfusion. Därefter andra beskrev "arbets hjärta" modell, där hjärtmuskeln utför både tryck och volym arbete. ² Sådana preparat har varit avgörande för att belysa mekanismerna för hjärtinfarkt åtgärder, ³ myocardial metabolism, ^4-6 och effekter av kardiotoniska läkemedel. ^{7- 9}

Användningen av läkemedel som förbättrar hjärtkontraktilitet är vanligt i kritiskt sjuka patienter. Men några data som jämför de relativa effekterna av dessa läkemedel på kontraktilitet och syreförbrukning, uppgifter som kan vara användbara i vården av patienter med kliniska tecken på hjärtsvikt av under den postoperativa miljö. ¹⁰ Eftersom de flesta hjärtstimulerande läkemedel påverkar inte bara hjärtmuskeln, men också arteriolar motstånd, venös kapacitans ¹¹ och en patients ämnesomsättning, ¹² ex vivo isolerade hjärt modeller förblir optimala medel för att studera effekterna av sådana läkemedel på myokardium korrekt.

Vi beskriver användningen av en ex vivo modell för lastoberoende studie av inotropa läkemedel på hjärtmuskelfunktionen och syreförbrukning. Hjärtan från Sprague Dawley råttor med kanyl med hjälp av en vänsterkammar arbetar hjärta modell och perfusion med hjälp av en modifierad Krebs Henseleit perfusat. Aorta och vänster förmak tryck kontrollerades. Tryck-volym impedans katetrar placerades i den vänstra kammaren via apikala punktering för kontinuerlig övervakning av systoliskt och diastoliskt funktion. Syreförbrukningen mättes kontinuerligt som den indexerade skillnaden i syrehalt mellan vänster atriella perfusåt och lungartären utflödet. Mediciner som skulle testas infunderades in i vänstra förmakets blocket, och förändringar i hjärtverksamhet och syremetabolism mättes och jämfördes med en omedelbart föregående baslinjen.

Protocol

Detta protokoll utförs under en nuvarande protokollet under institutionens djurvård och användning kommittén.

1. Förberedelser för studier

1. Slå på vattenbad för att värma upp Krebs-Henseleit-buffert (KHB) reservoar (inställd på 42 ° C).
2. Förbereda 16 L av KHB innehållande (i mM) 128 NaCl, 5,7 KCl, 1,3 MgSO _4, 25 NaHCOa _3, 2,7 _CaCl2, 0,53 EDTA, 0,54 Nac ₃ H ₃ O _3, och 10,8 dextros. ¹³ Substrat massorna är följande : 27,584 g NaCl, 1,58 g KCl, 0,578 g MgSO _4, 8,401 g NaHCO _3, 1,47 g _CaCl2, 0,744 g EDTA, 0,22 g Nac ₃ H ₃ O _3, och 7,208 g dextros.
   Notera: dessa komponenter kan lagras i koniska rör i pulverform för konstituering på dagen för experimenterande.
   1. Filter 4 I avjoniserat vatten genom ett 0,22 mikron filter.
   2. Lägg 3,7 L av detta vatten till en 4 Lbägare. Lägg till alla delar utom för _CaCl2 till vattnet.
   3. Upplösa _CaCl2 i de återstående 300 ml vatten med hjälp av en separat bägare.
   4. Syresätta lösningen med 95% _O2 / 5% _CO2 vid ett L / min (LPM) under 5 min. Detta korrigerar pH till 7,40 och förbättrar upplösningen av _CaCl2.
   5. Tillsätt _CaCl2 till återstoden av KHB.
   6. Lägg den färdiga KHB till en reservoar och cirkulera genom alla slangar i 30 minuter. Säkerställa att systemet är fritt från makroskopiska bubblor. Oxygenat med 95% _O2 / 5% _CO2 vid 0,5 LPM.
      OBS: KHB kan lagras över natten i kylskåp i högst 1-2 dagar, kom tillbaka till rumstemperatur och återfiltrerad för användning. Återanvänd inte KHB mellan experiment.
   7. Förbered 2 x 50 ml ren bägare med iskall KHB och placera dem i en hink med is nära dissekering stationen. Se till att KHB är iskall (snarare än kyld) före ex plantering hjärtat.
   8. Placera mikrotryck volym (PV) kateter i en 10 ml spruta fylld med filtrerat KHB under 30 minuter före kalibrering, enligt tillverkarens instruktioner.
      OBS: temperatur KHB används för att suga PV katetern bör vara så nära 37 ° C som möjligt.
3. Förbered anestesi och dissekera station för djuret.
   1. Säkerställa tillräcklig isofluran i reservoaren. Upprätta 500 U heparin i en 1 ml spruta; placera en 26 gauge (1/2 ") nål på denna spruta. Förbered en mask för anesthetizing djuret.
4. Ställ aortablocket perfusionstryck till 80 mmHg och vänster förmak (LA) blockera perfusionstryck till 10 mmHg. Öppen både aortablocket och LA-block för att tillåta varm KHB droppa ut. När du är redo att dissekera djur, öppnar aortablocket för att tillåta en stadig långsam upptining av KHB ut.
5. Kalibrera PV kateter enligt tillverkarens instruktioner.

"> 2. Animal Förberedelse och Dissection

OBS: För bästa resultat, se till att djuret är mellan 300 och 500 g; vi har funnit att ett djur vikt mellan 425-450 g är idealisk för vårt system.

1. Söva djuret i en kammare med hjälp av isofluran (1-2%) till dess att djuret är medvetslöst. Överföra djuret till dissekering stationen och placera anestesimask med isofluran och syre på djuret. Utför tå nypa för att bedöma graden av sedering. Applicera veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
2. Injicera heparin, 500 enheter intraperitoneal i bukhålan. Låt 10 minuter för Heparin att absorberas. Säkra benen hos djuret med tejp för att förbättra visualisering av bröstkorgen.
3. Dissektion av hjärtat.
   1. När se till att det inte finns något svar på en tå nypa, lyft huden bort från bukhålan med pincett och sedan använda sax för att incisionsfilm bukhålan efter kurvan för than membranet tillbaka till den bakre vinkeln av revbenen.
   2. När membranet är synlig, med hjälp av en liten sax, skurna längs den främre ytan av membranet efter det att riktningen för de tidigare snitt för att möjliggöra inträde i bröstkorgen. Förlänga varje snitt längs axillarlinjen bilateralt till armhålan.
      OBS! I nästa steg ska utföras effektivt eftersom ventilationen kommer att äventyras när membranet snittas.
   3. Kör bröstkorgen framtill från xiphoid processen med hjälp av pincett. Incisionsfilm hjärtsäck och lungsäcken.
   4. Identifiera den nedre hålvenen (IVC) och aortan just ovanför membranet och dra tillbaka dem i klump anteriort med trubbiga pincett.
   5. Användning av stora, böjd sax, snabbt göra ett snitt över IVC och aorta, dra i hjärtat och lungorna ut ur bröstkorgen i klump. Skär matstrupen, luftstrupe, brachiocephalic artärer och vener kraniellt att avlägsna hjärtat och lungorna från bröstkorgen. Skära ut thymic vävnad med detta block av vävnad. Se till att inte skära den proximala delen av den uppåtgående aorta.
   6. Omedelbart doppa hjärta och lungor i iskallt KHB och flytta till Langendorff apparaten installeras enligt beskrivningen i steg 1.

3. Aortakanyle

1. Placera hjärt-lung-komplex i en platt skålen och orientera hjärtat med bräss och stora fartyg som vetter mot försöksledaren och den bakre aspekten av lungorna inför tabellen. Dra isär de två loberna i tymus och identifiera starten av de brachiocephalic artärer från aorta.
   1. Drapera aorta över kanten av skålen och transekt aorta med användning av en liten sax ca 5 mm ovanför aortaklaffen, alldeles proximalt till start av den högra subklavikulära artären.
      OBS: Snittet bör ge en ren rund cirkel - aorta i tvärsnitt. Om den är av-vinkel (dvs ett brett oval)eller ofullständiga, upprepa snittet för att uppnå det önskade resultatet. Detta kommer att underlätta en effektiv aorta kanyle.
2. Med användning av 2 par böjda pincett på vardera sidan av aorta, guide aorta över aortakanylen (som bör vara långsamt droppande med KHB). Aortaklaffen ska sitta 1 - 2 mm under spetsen av kanylen.
   1. Efter aorta kanyler, flytta pincetten vinkelrätt över aorta för att hålla aorta på plats. Alternativt, placera en liten klämma över aorta för att hålla hjärtlungmaskin komplexet på plats, vilket möjliggör en enda försöksledaren att slutföra denna modell.
3. Låt en medhjälpare passera en siden 4-0 sutur strax under tången och slips på plats, looping runt kanylen och binda flera gånger både framför och bakom hjärtat. Öppna kanylen fullständigt för att börja fullt tillbakagående aortaflöde. Observera att hjärtat slår kraftigt.
   OBS: Om hjärtat inte börjar slå snabbt (~ 200 BPM) och kraftfullt, denbinda eller kanyl kan vara ockludera en eller båda av hjärtats kranskärl. Vid misstanke om detta, ta bort slips och flytta bort från hjärtats kranskärl. Om hjärtat utvidgar och inte slå, kan kanylen vara över aortaklaffen. Om kransartärläckage (KHB sprayer från aortaroten), avancera kanylen närmare aortaventilen (detta fenomen kan inträffa om en brachiocephalic artär är kanylera i stället för den uppåtgående aorta).

4. lungvenen Ocklusion och Beredning av lungartären för Kanyle

OBS: Syftet med detta steg är att skapa ett slutet vänster förmak för att säkerställa att all volym och påtryckningar från vänster förmak blocket överförs till vänster hjärtstrukturerna. Underlåtenhet att fullständigt täppa lungvenerna kan leda till förspänning brist och kan förfalska resultatet eller skapa en instabil arbets hjärta förberedelse.

1. Ta bräss att förbättra exponeringen av the lungartären (PA).
2. rotera manuellt aortakanylen så att den posteriora aspekten av hjärtat är vänd mot operatören. Dissekera ut kärlen leder till höger lunga. Upphäva rätten lungvävnad med hjälp av pincett för att ytterligare avgränsa dessa fartyg. Använda medel stora kirurgiska klämmor (eller sutur), täppa till höger lungartären och venen och luftrör med ett enda klipp. Resect höger lunga distalt klippet.
   OBS: På grund av svårigheter att dissekera lungartären fri, är vår praxis att täppa lungvenerna att tänja lungartären, vilket gör det lättare att incisionsfilm utan att skada de närliggande strukturerna i ett slående hjärta modell.
3. Upprepa steg 4,2 på den vänstra lungan.
   OBS: Potentiella fallgropar och problemlösning: När båda lungartärerna är tilltäppta, kommer den högra förmak synligt tänja och hjärtat kan bli Bradykardisk. Detta beror på den högra ventrikeln blir trycksatt. Om detta inte sker, är det troligt att Pulmonary vener är inte helt tilltäppt, och att förspänning kommer att vara otillräckliga för att arbeta hjärtläge. Om hjärtat inte kan upprätthålla hjärtminutvolym efter vänster förmak (LA) kanyle och försökte övergång till arbets hjärta (se nedan), överväga att placera ytterligare klipp eller en slips runt lungvenen stubbar att täppa eventuella rest läcka. När PAS är tilltäppt, dock, steg 5 bör utföras omedelbart för att minimera myokardischemi. Observera att vissa forskare incisionsfilm lungartären före ligering av lungvenerna att undvika trycksättning av den högra ventrikeln.
4. Pulmonell arteriell incision
   1. Rotera aortakanylen så att den främre aspekten av hjärtat är vänd mot operatören. Identifiera lungartären. Återigen kan denna artär att utspänd. Med små saxar gör en tvärgående snitt ca 3 mm ovanför lungventilen.
      OBS: Detta kommer omedelbart att lätta på trycket och hjärtfrekvensen kan öka. Befinna sigorsaka detta kanyl är lätt att rubba, cannulate lungartären efter vänster förmak kanyle är klar.

5. vänster förmak Kanyle

1. Rotera aortakanylen så att det vänstra förmaket är vänd mot operatören. Med användning av de en liten sax, gör en 2 - mm snitt 3 i överkroppen av det vänstra förmaket, ca 3 mm ovanför atrioventrikulär spåret.
   1. Placera vänstra förmakets kanyl som är vinkelrät mot planet för mitralisklaffen och pekade mot den atriella septum.
   2. Öppna LA kanylen tills KHB flöden. Se till att KHB är varm vid beröring (det blir kallt snabbt när man sitter i en icke-mantlade rör) för att undvika hjärtsvikt på grund av hypotermi efter övergången till arbetsläge. Övergången till en dropphastighet under kanyle.
2. Använd pincett för att hålla motdrag sätter förmaks kanylen i kroppen av vänster förmak, noga med att inte använda excessive kraft, som kan riva atrium.
   OBS! LA kanylen bör placeras så att den sitter i mitten av atrium utan någon spänning på förmaksväggen.
3. Passera en 4-0 silke sutur runt kroppen av vänster förmak och knyt en knut för att skapa en tätning av atrium runt kanylen. Vara noga med att se till att den posteriora aspekten av vänster förmak är inkluderad i suturen. Lägg till ytterligare suturer som behövs. När förseglade, dra kanylen tillbaka 1-2 mm så att den sitter i mitten av atrium snarare än mot förmaks septum.
   OBS: Den vanligaste orsaken till att hjärtat blir malperfused vid övergången till arbets hjärta läget är att LA kanylen ligger an mot förmaks septum, som täpper vänster förmak inflöde. LA spårning ändras ofta för att visa en riktig en våg och v våg när kanylen är i rätt läge (se figur 2E).
4. Öppna LA kanyl ventilen helt för att administrera hela förspänning till vänster förmak. övervakadropphastighet från hjärtat (som kommer från krans utflöde). Se till att dropphastigheten inte ändras när LA kanylen är öppen. Om den gör det, retie atrium runt kanylen som beskrivs i steg 6,4, eftersom detta utgör en läcka i systemet.

6. lungartären Kanyle och övergång till arbets Heart läge

1. Om mätning syreförbrukning (eller andra ämnen i krans utflödet, såsom läkemedelsnivåer eller cytokiner), sätter 1/32 "flexibel slang i den tidigare snitt i lungartären.
   OBS: Syreförbrukningen mäts som skillnaden i syrehalt mellan vänster förmak perfusat och lungartären avloppsvatten ^2.
   1. För kontinuerlig mätning av syreförbrukning, använda en in-line syreelektroden att jämföra vänster förmak och sinus coronarius avloppsvattnet.
   2. Samla sinus coronarius avloppsvatten (från både lungartären och droppande från hjärtat) i en graderad cylinder för tidsinställd kvantifiering av koronarflödet.
   3. Beräkna syreförbrukning som tidigare beskrivits. ²
2. Övergång till arbets hjärta läge genom att stänga av bakåtsträvande aorta pumpen.
   OBS: När detta är gjort, blir LA trycket före lasttrycket och motståndet som tidigare ger resistens mot bakåtsträvande pumpen i Langendorff läge ger nu motstånd mot hjärtminutvolym, vilket skapar en medelartärtryck. Om det genomsnittliga artärtrycket avtar under ~ 80 mmHg, är orsaken sannolikt relaterade till antingen förspänning eller hjärtmuskelfunktion. Den mest sannolika problemet är det vänstra förmakets kanyl, som bör anpassas efter omstart av retrograd pumpen.

7. Införande av vänsterkammartryck Volym kateter

OBS! PV katetern kan placeras antingen retrograd (genom aortaklaffen) eller via apikala punktering. Fördelen med retrograd är att position är mer konsekvent och det undanröjer behovet av apikal punktering och åtföljande risk för kranskärls skada eller förlust av förspänning. Däremot kan retrograd placering ibland vara mycket utmanande, så vi beskriver båda teknikerna häri.

1. Bifoga en 1,4 French tryck-volym katetern till tryck-volymslingsystem. Kalibrera systemet i varmt KHB enligt tillverkarens instruktioner. Säkerställa vågformen är synlig i realtid. Föra katetern och kablar nära ytan av LV för att inte rubba den efter placering.
2. För retrograd placering öppnar justerbar ventil och mata PV katetern försiktigt över aortaklaffen tills ett stabilt tryck och volym vågform identifieras. Undvika överdriven användning av våld som kan skada aortaklaffen eller punktera den ventrikulära apex.
   OBS: Vi har funnit att det är viktigt att minimera längden på slangen och antal varv som PV katetern måste navigera att närma sig AV. Detkan vara till hjälp för att skära ner på slangen som medföljer systemet.
3. För apikala placering, använd en 24 G angio-kateter för att skapa en apikal punktering i LV. Se till att undvika den vänstra främre nedåtgående kransartären. Rikta nålen mot aortaklaffen från ventrikulära apex. För fram tryck-volym kateter i kroppen hos LV. Sluta föra katetern så snart som LV tryck och volym vågform identifieras.
4. När väl tryck-volym katetern är på plats, flytta vattenmanteln i läge runt hjärtat. Säkra katetern till väggen i vattenmanteln med en liten bit tejp.
5. Säkerställa åtminstone en 30 minuters period av stabilitet innan du påbörjar några mätningar eller ingrepp.

8. Infusion av medicinering

1. (Tillval) Ingjuta läkemedel (t.ex. dopamin) i den vänstra förmaks blocket med en vanlig medicinering pump.
   OBS: Vi har doserade läkemedel enligt groe djurets kroppsvikt eftersom flödes motsvarar en hel hjärtminutvolym passerar genom förmaks block; endast en liten del av detta passerar genom kranskärlscirkulation, som det gör in vivo. Alternativt kan en andra uppsättning av perfusatet skapas med en förinställd koncentration av läkemedel och användas för att BEGJUTA hjärtat.
   OBS: I våra protokoll, vi infundera läkemedel under en 12-minutersperiod, samla fysiologiska data under den slutliga 10 min av varje infusion och jämföra den med en omedelbart föregående 10 min baslinje.

9. Fysiologiska manipulationer

1. Hjärtfrekvens
   1. (Tillval) sutur två stimulerings ledningar på höger förmaksväggen och fäst till en tillfällig stimuleringsanordning.
      OBS: Detta möjliggör exakt styrning av hjärtfrekvensen (ovanför infödda sinustakten) och en förståelse för relationen mellan hjärtfrekvens och kontraktilitet oberoende av en hjärtstimulerande läkemedel.
2. förspänning
   1. varierar denförspänning (definierad som vänster ventrikulär slutdiastoliska volym) genom att variera höjden av kolonnen som matar vänstra förmakets blocket.
3. Blodtryck
   1. Manipulera blodtryck (den primära faktorn för afterload i denna modell) med tryckventilerna på IH-51.
4. Koronar syrehalt
   1. Åstadkomma olika grader av hjärtinfarkt hypoxi genom perfusion hjärtat med KHB mättad i olika gasblandningar. Gör detta genom att använda separata mantlade reservoarer (var och en med sin egen gasblandning) för att säkerställa jämvikten mellan gas och KHB.
   2. Utför koronar ischemi genom sutur ligera en distal kranskärl.
      OBS! Ligering av proximala kransartärer i arbetshjärtläge kan leda till dödlig hjärtsvikt.
   3. Framkalla global koronar ischemi genom att avbryta eller fördröja retrograd perfusion under en definierad tidsperiod.

Representative Results

En schematisk bild av en helt instrumenterade hjärta i retrograd perfusion (figur 1A) och vänsterkammararbets hjärta (Figur 1B). Typiska aorta, vänster förmak och vänster kammare tryck- och volym kurvor visas i figur 2A -. D Den typiska slut diastoliska trycket är ungefär 3 - 5 mm Hg i denna modell, och topp systoliska trycket är ungefär 100 mmHg Figur 2E visar förändringen. i vänster förmak spårning när LA kanylen flyttas bort från förmaks septum under placeringen och positioneringen av kanylen. I dessa experiment var aortatrycket inställt på 90 mmHg och LA Trycket inställdes till 10 mm Hg.

För att testa effekten av katekolaminer, var varje fysiologisk parameter (härrör främst från tryckvolymkateter och tillhörande programvara) jämfört med närmast föregående referensperiod. I det visade exemplet, var dopamin infunderades med 15 | ig / kg / min in i vänstra förmakets blocket. Även om slut diastoliska trycket är identisk i de två villkor (med tanke på den fasta förmakstrycket i denna modell), minskar den vänstra ventrikulära slutdiastoliska volym med 2,5%, och den vänstra ventrikulära slutsystoliska volymen minskar med 4,9%, vilket gav en ökad slagvolym (figur 3A). Jämfört med placeboinfusioner, den vänstra ventrikulära slagarbete, identifierats som det område inom tryck-volymkurvan, ökade med 32% vid behandling med dopamin (Figur 3B, P <0,001, t-test, n = 10 per grupp). Detta i samband med en större ökning av myokardiets syreförbrukning i förhållande till placebo infusioner (Figur 3C). På detta sätt kan den relativa potensen och energikostnader för olika hjärtstimulerande läkemedel och doser jämföras med varandra oberoende av deras inverkan på belastningsförhållanden.

innehåll "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1: Diagram över Flow i en helt Instrumenterad hjärta i retrograd perfusion och Working Heart läge (Panel A: Langendorff läge; Panel B:.. Arbets hjärta läge I bakåtsträvande läge är KHB infunderas vid en uppsättning perfusionstryck i aortaroten. detta läge används för att återställa hjärtmuskeln efter ischemisk tid och under instrumentering. i arbetshjärtläge strömmar perfusatet genom den vänstra hjärtat innan perfusion av kranskärlscirkulation. i det här läget måste myokardium generera sin egen perfusionstryck. klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2: Representant tryck och volym kurvor erhållits under baslinjemätningar. (A) aortaroten tryck, (B) vänster förmak, (C) vänster ventrikulära trycket och (D) Vänster kammarvolym kurvor under en mätning baslinje visas. Slagvolym, slagarbete, hjärtminutvolym, tau, och andra parametrar kan beräknas automatiskt och visas i realtid av programvaran. En trubbig vänster förmak spårning (E) i samband med en dålig hjärtminutvolym i arbets hjärta läge kan vara en ledtråd att kanylen är felplacerad i vänster förmak. Observera att den framstående v vågen i välplacerade vänster förmak tryck spårning är vanligt, sannolikt på grund av en minskad vänster förmak överensstämmelse i fullt instrumenterade djur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3:. Effekt av dopamin på tryckvolymkurvan Dopamin infusionsresulterar i en vänstervridning i PV kurvan (A), inklusive en ökad slagvolym minskade slut slagvolym jämfört med baslinjemätningar. Observera att formen på vissa delar av dessa solcells kurvor skiljer sig från de som typiskt mäts in vivo (se figur 4) på grund av frånvaron av arteriella och venösa elasticiteten. (B) I förhållande till en omedelbart föregående baslinjen, ökad slagarbete betydligt mer under infusioner av dopamin än placebo (**, P = 0,0017, t-test), som gjorde myocardial syreförbrukning (*, P = 0,013, t-test, C). Med hjälp av denna modell, den genomsnittliga hjärtmuskelsyreförbrukningen vid baslinjen var 0,22 ± O ₂ / gram vävnad / minut 0,02 mmol, med en bedömd dissolved syrehalt av 165 | j, mol / L i saltlösning vid 40 ° C. Sådana mätningar kan användas för att jämföra den syreförbrukning av olika mediciner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Analys av tryckVolym loopar. De teoretiska tryck-volym Loop Visas Beskriver Normal hjärtcykel Efter aortaklaffen (AV) förslutning (1), sker isovolemisk kontraktion (1 - 2). Som ventrikulärt tryck sjunker under förmakstryck. Längden på denna fas representeras av Tau. Mitralisklaffen (MV) öppnas sedan samtidigt med atrial systole, fyller kammaren (2-3). Systole börjar sedan med isovolemisk contractipå (3-4) tills ventrikulär trycket överstiger diastoliskt arteriellt tryck, vid vilken tidpunkt AV öppnas. Slagvolym är skillnaden mellan linjerna 1 - 2 och 3 -. 4 Stroke arbete är det område inom 1 - 2 - 3 -. 4 kurva Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta arbets hjärta modellen kan bedömningen av kammar prestanda med full kontroll över kammar förspänning och efterbelastning, syre spänning perfusatet, samt hjärtfrekvens. Bland andra faktorer, tillåter den bedömning av de inneboende hjärt effekterna av inotropa läkemedel oberoende av afterload och förspänning, vilka sätt som inte är möjligt med hjälp av en in vivo-modell. Eftersom denna modell utnyttjar en kristalloid perfusat, tillåter det bedömningen myokardiet utan inblandning från hemoglobin, vilket förenklar spektroskopisk analys av hjärtenergitillstånd, till exempel. ¹⁴ I denna modell, är det högra förmaket inte kanyl som en del av vår instrumentering, även om det är möjligt att göra så. Vi valde avsiktligt att inte göra det för att underlätta provtagning av sinus coronarius flödet för bedömning av myokardial syreförbrukning. Viktigt är dock fortfarande utför höger hjärttrycket och volym arbete i denna modell som det pumpar coronary sinus strömma in i lungartären kanylen. Ge några högerkammar förspänning förbättrar positioneringen av kammarskiljeväggen och förbättrar vänsterkammar prestanda, och är en viktig del av denna modell. ¹⁵

Det finns flera experimentella fallgropar att nämna. Den första är den första retrograd kanyle, som ska utföras ändamålsenligt (dvs. på mindre än två minuter) för att minimera tiden för ischemi. Den viktigaste färdighet att bemästra är effektiv isolering, förberedelse och hantering av stigande aorta. Det är viktigt att aortastumpen inte skäras överdrivet kort, vilket lämnar tillräckligt med utrymme för kanylering ovanför aortaklaffen. Det är emellertid också viktigt att aortastumpen inte vara för lång, vilket kan orsaka torqueing av aorta runt kanylen. Det är också viktigt att aortan kanylen och aortaroten ha lämpliga storleken matchade. En alltför stor aorta på en liten kanyl kan ocksåleda till torqueing av aortaroten på kanylen. Den högra subklavikulära artären tar vanligtvis av från aorta ascendens ca 7 mm ovanför aortaklaffen. Identifiera brachiocephalic fartyg (ca 1 mm i diameter) under dissekering och trimning av aorta är viktiga landmärken för den tvärgående aorta snitt. Trimma aorta strax under starten av den första brachiocephalic artären är tillrådligt. Införande av detta kärl i den trimmade aortaroten leder vanligtvis till ett läckage av KHB, och förlust av aortaroten press på övergången till arbets hjärta läge.

En annan tekniskt utmanande aspekt av kanyle är den vänstra förmakskanyle. Även om det är möjligt att cannulate vänstra förmakets bihang, fann vi att kanylen ofta fastnar i bihang, och passerar inte lätt in i kroppen av vänster förmak. Sålunda föredrar vi att göra snittet i kroppen av det vänstra förmaket, approximativt2 mm som är överlägsna den atrioventrikulära spåret. Det är viktigt att positionera vänstra förmakets kanyl i rätt plan före insättning för att undvika att riva den tunnväggiga atrium vid säkring av kanylen.

Vi fann att den ideala storleken på vänster förmak incision var ungefär 3 mm. Skapa alltför små av ett snitt kan också göra placeringen av vänstra förmakets kanyl svårare, och kan leda till sönderslitning av det vänstra förmaket. Vi använder en rak, 8 mm, avfasade bit av syre ogenomträngligt slang (innerdiameter 2,9 mm) på vänster förmak blocket. Vi har funnit att användningen av denna, i stället för en kanyl med en avfasad kant, leder till mest konsekventa förmakskanyle och underlättar processen för att säkra den vänstra förmaks blocket. Oberoende av slangar som används, är det viktigt att se till att i slutet av slangen inte är tilltäppt av förmaks septum eller mitralisklaffen (såsom beskrivs ovan, fann vi att den vänstra förmak spårning var till hjälp i detta Regard), som även subtila rörelse förmaks kanylen kan avsevärt ändra vänsterkammar förspänning och resulterande hemodynamiska mätningar. Av samma anledning är det viktigt att säkerställa att det vänstra förmaket inte läcker efter efter att ha öppnat den vänstra förmaks blocket. Det är viktigt, oberoende av vilken typ av slangar som används för att säkerställa att slangen inom detta system är syre ogenomträngligt för att säkerställa tillräcklig syretillförsel till hjärtat.

En annan tekniskt utmanande aspekt av förfarandet var placeringen av tryck volym (PV) kateter. Vi ansåg att man inledningsvis en retrograd placering av katetern genom aortablocket. Även tekniskt möjligt, vi funnit det vara mycket enklare och ändamålsenligt att placera PV katetern via transapical punktering. Man måste vara försiktig för att övervaka positionen av katetem under hela experimentets varaktighet, som ibland katetern kan röra sig in i eller ut ur den vänstra ventrikeln. Detta kan göras genom att övervaka pressure och volym kurvor över tid.

Slutligen bör man se till att KHB lösning skapas färsk för varje experiment. Det är möjligt att väga ut beståndsdelarna i KHB och lagra dem i koniska rör i pulverform i förväg. På dagen för experimenterande, kan dessa blandas med sterilt, filtrerat vatten, koldioxid / syre, och sedan kalcium tillsättes till blandningen. Det är också viktigt att tvätta systemet med enzymets aktiva pulveriserade rengöringsmedel såsom Tergazyme (eller liknande) och byt perfusatet filtret regelbundet.

Flera begränsningar av denna experimentella beredning bör noteras. Först, i likhet med alla kristalloida-perfusion Langendorff preparat KHB och andra asanguinous perfusat har en betydligt minskad syrebärande kapacitet i förhållande till blod. Även om detta delvis kompenseras genom kranskärlsutvidgning och supraphysiologic koronarflödet, är framställningen inte helt fysiologic av detta skäl. För det andra, på grund av den nästan oändliga överensstämma Windkessel kammare som används i detta instrument, systoliskt och diastoliskt tryck endast minimalt åtskilda (se figur 2A) och därmed koronarperfusionstrycket är icke-fysiologiska. Detta kan övervinnas i framtida modeller genom att införliva en elasticiteten komponent till afterload blocket. För det tredje, som med alla isolerade hjärtpreparat, genomgår hjärta en definierad period (2-3 minuter) varm ischemi som sannolikt kommer att skapa hjärtmuskelskada eller dysfunktion. Minimera denna skada genom tillämpning av teknik är av yttersta vikt att representativa resultat. Vidare, även om det behövs för djurskydd kan inhalationsanestetika fungera som en myocardial suppressant tidigt i reperfusion processen, men det förväntas att denna effekt snabbt avskaffas hjärtat reperfuseras med KHB.

Arbets hjärta beskrivna systemet gör det möjligt för en mängd olika Physiologic undersökningar som är relevanta för vård, forskning och undervisning. Med några ytterligare ändringar, kan systemet också användas för att simulera viktiga fysiologi relevant för medfödd hjärtsjukdom, inklusive pulmonell hypertension och enda kammare fysiologi. Begränsningar inkluderar att det är en ex vivo-framställning, att hjärtat är under perfusion av en buffert istället för en högre-syrehalt blod.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	8.401 g/4 L
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E6758	0.744 g/4 L
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333	1.580 g/4 L
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	0.578 g/4 L
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	0.220 g/ 4 L
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014	27.584 g/4 L
Dextrose	Sigma-Aldrich	D9434	7.208 g/4 L
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	1.470 g/4 L
Biventricular working heart model	Harvard Apparatus	IH-51
Pressure volume catheter	Millar, Inc	SPR-944-1	6 mm spacing catheter used
LabChart Pro 8	AD Instruments	Version 8.1