Summary
Hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPC) stammer fra specialiserede (hemogenic) endotelceller under udvikling, men alligevel lidt om den proces, hvorved nogle endotelceller angiver at blive bloddannende. Vi demonstrerer et flow-cytometri metode tillader samtidig isolering af hemogenic endothelceller og HSPC fra murine embryonale væv.
Abstract
Specifikationen af hemogenic endotelceller fra embryonale vaskulær endotel opstår under korte udviklingsmæssige perioder inden for forskellige væv, og er nødvendig for fremkomsten af definitive HSPC fra murine ekstra embryonale blommesækken, placenta, navlestrengen fartøjer, og de embryonale aorta-gonade-mesonephros ( AGM) region. Den forbigående natur og lille størrelse af denne celle population gør sin reproducerbar isolation for omhyggelig kvantificering og eksperimentelle applikationer teknisk vanskeligt. Vi har etableret en fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) -baseret protokol til samtidig isolering af hemogenic endothelceller og HSPC under deres højeste generationstider i blommesækken og AGM. Vi demonstrerer metoder til dissektion af blommesækken og AGM væv fra mus embryoner, og vi præsenterer optimeret væv fordøjelse og antistofkonjugering betingelser for maksimal celle overlevelse forud for identifikation og genfinding via FACS. Repræsentant FACS analysis plots er vist, at identificere den hemogenic endothelcelle og HSPC fænotyper, og beskrive en methylcellulose-baserede assay til evaluering deres blod danner potentiale på en klonal niveau.
Introduction
En funktionel kredsløbssygdomme kræver en parallel udvikling af blodkar og blodceller. På de tidligste stadier af blod udvikling (primitive hæmatopoiese), forbliver oprindelsen af erytroblaster kraftigt debatteret en. I modsætning til senere stadier af blodceller udvikling (endelig hæmatopoiese), er det blevet mere og mere klart, at multi-slægt HSPC skyldes specialiserede vaskulære endotelceller, der erhverver bloddannende potentielle (hemogenic endotelceller) inden blommesækken, placenta og AGM 2-5, samt i vitelline og umbilical fartøjer, den embryoniske endocardium 6, og hoved vaskulatur 7. Specifikationen af hemogenic endotelceller inden for disse forskellige væv sker på bestemte stadier af udvikling; for eksempel inden blommesækken på ~ E8.25 og inden for AGM på ~ E10 8-12. Ikke desto mindre, selv under disse specifikke udviklingsmæssige vinduer, befolkningen i hemogenic endothelial celler udgør en lille brøkdel af alle endotelceller (1 - 3% af blommesækken og AGM endotelceller) 11,12. Processen med hemogenic endotelcelle "specifikation" er kritisk for murine, såvel som den menneskelige, hæmatopoiese. Hæmatopoietiske celler er blevet vist at bud fra endotelet i blommesækken fartøjer og aorta i humane embryoner 13, og flere laboratorier har vist, at blodlegemer fra humane pluripotente stamceller kræver en endotelcelle mellemprodukt 14-16. Således definerer fænotypen af murine hemogenic endotelceller og forstå de molekylære begivenheder, der fører til deres udvikling i denne dyremodel skulle lette udøvelse af in vitro teknologi til generering af hemogenic endotelceller fra humane pluripotente stamceller. Til gengæld eventuel udvikling af en metode til storstilet generation af differentierede blod celletyper fra multi-slægt HSPC - selv Deriaba fra humane pluripotente stamceller via en fysiologisk relevant hemogenic endotelceller mellemliggende - ville have utrolig terapeutisk potentiale for hæmatologisk, onkologisk og regenerativ medicin. Mod dette mål har vi defineret fænotype hemogenic endotelceller, på en klonal niveau, inden det murine blommesækken 11 og AGM 12, to store websteder af endelig HSPC produktion under embryogenese. Ligesom HSPC inden voksen knoglemarv 17, embryonale hemogenic endotelceller og HSPC udviser Hoechst dye efflux egenskaber og derfor møde inden for den "side population" (SP) af celler på en FACS plot 5,11,12 (som vist i figur 3). Derudover har vi også vist, at hemogenic endotelceller udtrykker markører for både endotel og stamceller (Flk1 og cKit, henholdsvis), men udtrykker ikke en hæmatopoietisk linje markering, CD45 5,11,12. Således kan hemogenic endotelceller være identficeret og isoleret ved FACS som Flk1 + / cKit + / CD45- SP-celler, og vi har vist, at disse celler giver anledning til HSPC indeholdt i Flk1- / cKit + / CD45 + SP brøkdel af blommesækken og AGM celler 5,11,12. Hemogenic endotelceller og HSPC kan identificeres og isoleres fra blommesækken eller AGM væv høstet fra enten frisk aflivede embryoner, eller fra embryoner dyrket i op til 48 timer i ex vivo embryo kultur (som afbildet i figur 1). Ex vivo kultur tillader selektiv forbehandling af individuelle embryoer med farmakologiske midler, og giver også mulighed for kortvarig ekspression af ønskede transgener (dvs. efter lentiviral transduktion). FACS identifikation af hemogenic endotelceller og HSPC ved den heri beskrevne fremgangsmåde kan anvendes som et kvantitativt mål for endelig hæmatopoietisk udvikling i genetisk manipulerede musemodeller; cellerne kan også hentes til efterfølgende eksperimentelle applikationer, herunder blod-forming assays, ekspressionsanalyse og transplantation.
Animal Emner: Bruger og etiske overvejelser
En voksende mængde litteratur har etableret det vigtige bidrag fra hemogenic endotelceller til HSPC dannelse under den endelige hæmatopoiese fase af fosterudviklingen. Alligevel forbliver de fysiologiske forhold og signaler, som fremmer specifikation af en subpopulation af endotelceller mod en hemogenic skæbne dårligt forstået, og derfor endnu ikke kan efterlignes i et in vitro indstilling. Faktisk er de, der er beskrevet i dette papir teknikker er i øjeblikket i brug af vores laboratorium og andre grupper for at forbedre feltets forståelse af hematovascular udvikling, således at måske en dag blive udviklet en tilgang til ex vivo hemogenic endotelceller specifikation og HSPC produktion. Indtil Men feltet er fortsat afhængige af primære væv fra vildtype (og gentisk modificerede) musefostre at få specificeret hemogenic endotelceller og HSPC til yderligere undersøgelse. Hemogenic endotelceller og HSPC kan identificeres pålideligt, og isoleret fra enten E8.5 (10 - 12 somit par) blommesækken eller E10.5 (35 - 40 somit par) AGM 11,12. På grund af den relative knaphed på hemogenic endotelceller (typisk svarende til 1 - 3% af de samlede endotelceller 11,12 indenfor disse væv) pooling af væv fra flere (~ 8 - 10) søskende i en enkelt prøve anbefales kraftigt for at opnå tilstrækkelige celler til efterfølgende eksperimenter. Kontrol af, at hemogenic endotelceller og HSPC succes er blevet identificeret og isoleret kan opnås ved dyrkning af udtagne celler under betingelser, der inducerer hæmatopoietisk differentiering. Under disse betingelser vil hemogenic endothelceller og HSPC udviser multi-slægt hæmatopoietisk differentiering, hvilket resulterer i fremkomsten af kolonier indeholdende erythroid progenitorer (BFU-E), granulocyt og makrofag progenitorer (CFU-GM) og granulocyt, erythrocyt, makrofag, megakaryocyt progenitor kolonier (CFU-GEMM).
Protocol
Etik Statement: Protokollen skitseret nedenfor er blevet gennemgået af, og er i overensstemmelse med retningslinjerne i, Yale Universitys Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Hele Embryo Ex V Ivo Kultur for blommesækken Studies (valgfri)
- Euthanize drægtige moderdyr ved E7.0 - E7.5, og fjern uterine horn under sterile betingelser, som beskrevet mere detaljeret nedenfor (trin 2.4 - 2.7).
- Separate hele embryoner (med blommesækken intakt 12) fra omgivende decidua og suspendere i 50 ml hel rotte serum i 50 ml polystyrenrør.
- Gas embryo flasker til 3 min med 5% CO2 straks som tidligere beskrevet 12,18. Gentag dette trin på 24 timer, hvis dyrkning embryoner til 24 - 48 timer.
- Inkuber i rullende 37 ° C kultur i op til 48 timer.
Bemærk: Embryoner kan behandles ex vivo med farmakologiske midler (dvs. Notch inhibitor DAP.T 12) eller opløselige proteiner (dvs. fibronectin 19) ved for-inkubering af embryoer til op til 2 timer i dyrkningsmedium, der indeholder sådanne faktorer, eller ved tilsætning af disse forhold til den rullende dyrkningsmedium til hele længden af ex vivo kultur periode. Genekspression kan manipuleres i embryoner ved præ-inkubering af embryoner med optimalt titreret lentivirus i 2 timer 12. Blommesækken vaskulære og hæmatopoietisk udvikling kan overvåges i realtid ved hjælp af transgene reporter mus og optiske billeddiagnostiske teknikker.
2. Dissektion af blommesækken (YS) eller aorta-gonad-mesonephros (AGM) fra musefostre
- Steriliseres lab bænk ved sprøjtning og tørre ned alle overflader med 70% ethanol for at reducere forureningen i de efterfølgende cellekulturer. Placer et absorberende underlag på lab bænk overflade.
- Sterilisere kirurgiske instrumenter med 70% ethanol. Anbefalede kirurgiske instrumenter er to # 5 lige kraftps, og en 8,5 cm straight saks.
- Hvis du arbejder med embryoner fra ex vivo kultur, forsigtigt fjerne hele embryoner fra 50 ml Falcon rør og fortsæt straks til trin 2.8. Ellers springe dette trin og gå videre til trin 2.4.
- Afliv gravid dæmning ved passende embryonale alder (E8.5 hvis høst YS, E10.5 hvis høst AGM).
Bemærk: Den beskrevne teknik anvender en dual-metode eutanasi tilgang - lethal dosis af et flygtigt anæstetikum efterfulgt af mekanisk cervikal dislokation - at minimere dyrs smerte og angst, og for at sikre minimalt invasiv og human afslutning af forsøgsdyr. Dette kombineret teknik til små gnavere eutanasi anbefales af den amerikanske Veterinary Medical Association, når de udføres af en uddannet og dygtig efterforsker (AVMA Retningslinjer for eutanasi af dyr: 2013 Edition).- Bedøver mus ved hjælp af en dødelig dosis af isofluran (> 5% i O 2) til stillingen 3 - 5 min. (CAUTION: Isofluran er et giftigt inhalant; brug under stinkskab med passende åndedrætsværn personlige værnemidler.)
- Efter eksponering af mus til isofluran, kontrollere mindst tre tegn på bedøvelsesmiddel niveau - tab af oprettende refleks, tab af tå knivspids refleks, og reduktion af respirationsfrekvens - at sikre emner har opnået en dyb bedøvelse fly, før de går med mekanisk dødshjælp.
- Cervically forrykke dæmning til hurtigt fremkalde døden.
- Placer aflives dæmning liggende på inkontinensunderlaget og liberalt spray underlivet med 70% ethanol.
- Lav en lodret snit langs midterlinien af den nedre bugvæggen. Gøre yderligere ~ 1 inch horisontale incisioner strækker højre og venstre fra midtpunktet af den lodrette indsnit, og dissekere væk bugvæggen til fuldt ud at eksponere højre og venstre uterine horn hver indeholder multiple drægtige embryoner.
- Ved hjælp af pincet, hold en af de to livmoderhorneneog bruge en saks til at adskille den fra mesometrium. Placer dissekerede uterus på is i steril Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) i en 60 mm polystyren vævskulturplade. Gentag for andre uterin horn.
- Under en standard lys dissektionsmikroskop, bruge pincet til at trække væk muskuløs lag af livmoderen sac at afsløre den underliggende amnionsækken og decidua. Isoler YS (figur 2A) ved forsigtigt at fjerne sæk af vedlagte embryo. Fjern YS væv fra embryo ordentlig på embryonale oprindelse vitelline fartøjer.
- For at isolere generalforsamlingen, fjerne YS og transektere fosteret under niveauet af hjertet og forelimbs og kassér thorax og hoved region. Dernæst transektere fosteret lige under niveauet for baglemmer og fjern og kassér halen væv. Fjern baglemmer og overskydende ventral væv fra den resterende sektion, som indeholder AGM (figur 2B).
- Pool YS eller AGM væv fra flere embryoner og butikpå is i HBSS + (HBSS suppleret med 10% (vol / vol) føtalt bovint serum og 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 0,3 mg / ml L-glutamin) i et rent 1,5 ml rør.
3. Fordøjelse af Primary Tissue i en enkelt celle Suspension
- Centrifugerør indeholdende høstet YS eller AGM væv i 5 minutter ved 2000 xg ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspender væv i 1 ml af enten 0,05% (for YS) eller 0,2% (for AGM) collagenase type II fortyndet i HBSS +. Inkuber i 30 minutter i vandbad ved 37 ° C, vende røret hver 5 min at blande.
- Forsigtigt mekanisk dissociere væv ved at føre prøve 10 gange gennem en P1000 pipette. Hvis har problemer aspirering delvist fordøjet væv, kan pipettespids boring udvides ved at afskære ~ 5 mm spids med en saks.
- Centrifuger prøven i 5 minutter ved 2000 xg ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender i 1 ml iskold HBSS +.
- Passere prøven gennem en 70 &# 956; m celle si.
- Tæl celler ved hjælp af en manuel eller automatisk hæmocytometer.
- Centrifuger prøven i 5 minutter ved 2000 xg ved 4 ° C. Resuspender prøve i DMEM + (4,5 g / l glucose Dulbeccos Modified Eagle Medium suppleret med 10% (vol / vol) føtalt bovint serum og 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 0,3 mg / ml L-glutamin) præ- opvarmet til 37 ° C, således at cellerne er i en slutkoncentration på 1 x 10 6 celler / ml.
4. Behandling af celler med Nucleic Acid Dye og mærkning med fluorescens konjugerede antistoffer
- Alikvot mindst 100 pi prøve (1 x 10 5 celler) i frisk 1,5 ml rør til antistof inkubation.
- Medtag følgende prøve og nødvendige kontrolforanstaltninger rør: Ufarvet; cKit-APC kun; CD45-FITC kun; CD31-PE alene; Flk1-PECy7 kun; Hoechst 33342 kun; Hoechst 33342 kun + Verapamil; Prøve (modtager alle farver, vil ikke modtage Verapamil). Brug mindst 1 x 10
- Tilføj Verapamil fortyndet i 95% ethanol (se Diskussion for rationale) til "Hoechst 33342 kun + Verapamil" kontrol rør til en slutkoncentration på 50 uM. Inkuber alle rør i 5 minutter ved 37 ° C. (ADVARSEL: Verapamil er en potent calcium-kanal blokerende agent og er ekstremt giftigt Håndtag med handsker.).
- Tilføj Hoechst 33342 til "Hoechst 33342 kun" kontrol, til Hoechst 33342 + Verapamil kun kontrol, og til "Sample" rør til en slutkoncentration på 5 ug / ml. Inkuber alle rør i 1 time ved 37 ° C, beskyttet mod lys. Bland forsigtigt ved at vende hver 15 min. (ADVARSEL: Hoechst 33342 er et giftigt nuklear farvestof og bør håndteres med handsker).
- Centrifuge alle Samples i 5 minutter ved 2000 xg ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender cellepellets i en koncentration på 1 x 10 5 celler / ml i kold HBSS +.
- Tilføj fluorescens konjugerede antistoffer til passende antistof-only kontrolrør, og til "Sample" rør til en slutkoncentration på 2 pg / ml. Der inkuberes på is i 30 minutter, beskyttet mod lys.
- Centrifuge alle rør i 5 minutter ved 2.000 xg ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 500 pi iskold HBSS. Strain prøver gennem mesh-filter cap af 5 ml rundbundet polystyren FACS rør og gemme på is, beskyttet mod lys, for umiddelbare FACS.
5. Identifikation og isolering af Hemogenic endothelceller og HSPC ved FACS
Bemærk: Denne protokol blev optimeret under anvendelse af en BD FACSAria 5-lasersystem udstyret med en 100 mw 355 nm UV-laser, en 200 mw 405 nm Violet laser, en 200 mw 488 nm blå laser, en 200 mw 532 nm grøn laser og en 150 mw 637 nm rødlaser. Celler blev sorteret i sterilt PBS som sheathvæske og under aseptiske forhold, og gennem en 100 um dyse med flowhastighed sat til en prøve tryk på 1, således at maksimalt 1.500 - 2.000 hændelser er erhvervet i sekundet for at minimere celle stress.
- Under disse indstillinger er beskrevet ovenfor, skal du bruge "Ufarvede" og enkelt farve kontrol rør til at optimere FACS cellesorterer laser intensiteter og udfører flerfarvede spektrale kompensationskontrol i henhold til producentens anvisninger. Brug frem og side scatter at udføre levende celler og dublet diskrimination fra de samlede hændelser (se producentens anvisninger for flere detaljer).
Bemærk: Denne protokol resulterer typisk i ~ 70-80% levedygtige celler. Hvis der opstår problemer med lav cellelevedygtighed, sikrer, at væv oprindeligt dissekeres hurtigt i iskold medier, og at alle trin undtagen dem angivelse ellers udføres på is med forsigtig pipettering at minimere klipning og celledød(Se Diskussion for mere detaljeret om bevarelse af cellelevedygtighed). - Brug en differentiel lineær skala afbildning af Hoechst Red vs. Hoechst blå fluorescens at identificere side befolkning (SP) hændelser (figur 3A). Brug "Hoechst 33342 kun + Verapamil" kontrol som en negativ kontrol for at verificere, at portene er korrekt tegnet for prøven. SP vil fremstå som en skulder til venstre af de ikke-SP-celler, og vil være nedsat i Verapamil-behandlet kontrol. Den ikke-SP befolkning vil blive brugt til at identificere ikke-hemogenic EF (figur 3B).
- Opret yderligere forskellen fluorescens plots (log skala akser) og tegne datter porte af SP til at identificere hemogenic endotelceller (figur 3C-E).
Bemærk: Hemogenic endotelceller er profileret som Flk1 + / cKit + / CD45- SP-celler (figur 3D), og HSPC er Flk1- / cKit + / CD45 + SP-celler (Figur 3E). Hemogenic endotel calen kan analyseres parallelt med ikke-hemogenic endotelceller, og som fastlægges i denne tilgang som CD31 + / CD45- ikke-SP celler (figur 3B). - Hent hemogenic endotelcelle eller HSPC fraktionen på methylcellulose holdige plader for hæmatopoietisk kultur (se nedenfor), eller i andre buffere til efterfølgende bearbejdning og analyse.
6. Hæmatopoietisk Differentiering i Kultur
- Tilsæt 0,5 ml (135 pl / cm2) methylcellulose-baserede hæmatopoietisk dyrkningsmedier til ønskede antal brønde i en 24-brønds vævsdyrkningsplade ved stuetemperatur. Tilsæt 0,5 ml sterilt vand i ubrugte brønde for at minimere fordampning. Forbered frisk og holde ved stuetemperatur indtil anvendelse.
- Sorter 1 - 10 celler til klonal analyse, eller op til 1.000 hemogenic endotelceller (Flk1 + / cKit + / CD45- SP celler) eller HSPC (Flk1- / cKit + / CD45 + SP-celler) for bulk-ekspansion og differentiering direkte i hver brønd i denplade indeholdende methylcellulose. Kolonidannelse detekteres hos ca. 10 - 20%.
- I en steril vævskultur hætte, brug en P1000 tip med spidsen trimmet til at udvide sin boring, til forsigtigt resuspender hver brønd af seedede methylcelluloseskiver medier 2 - 3 gange, idet man undgå skabelse af bobler. Dette sikrer suspension af de sorterede celler ind i halvfast methylcellulose for optimal vækst.
- Inkuber plade ved 37 ° C med 5% CO2 i op til 2 uger.
- Overvåg enkelt cellekulturer til dannelse af differentierede hæmatopoietiske cellekolonier over tid (figur 4). Score brønde til antal og type af differentierede hæmatopoietiske kolonier på dag 1, 3, 7 og 14 ved fremgangsmåde (e) nedenfor skitseret i trin 6.7.
- Score plader på dag 1 for at bekræfte sammenflydning og fortsatte levedygtighed de sorterede celler.
- Ved dag 3, så tjek for tidlig dannelse af vedhængende hemogenic endotel celle kolonier med "brostentone "morfologi (se Goldie et al. 11 og Marcelo et al. 12 for repræsentation af dag 3 morfologi).
- Ved dag 5 - 7, så tjek for dannelse af afrundede HSPC klynger i brønde, der indeholder sorteres hemogenic EF. HSPC bør observeres ved siden fladtrykte hemogenic EF vise en "brosten" endotelcelle morfologi.
Bemærk: Hemogenic endotelceller bør danne hæmatopoietiske kolonier (bestemt ved hæmatopoietisk koloni nummer), og påvise multi-slægt differentiering kapacitet (bestemt ved observation af multiple kolonityper fra en enkelt celle). Vi har tidligere observeret, at ~ 20% af hemogenic EF eller HSPC hentet af FACS overlever at danne differentiere og prolifererende hæmatopoietiske kolonier i methylcellulose 11.
- For at vurdere kolonidannelse med fasemikroskopi:
- Visualiser og tælle kolonier ved lav forstørrelse undER en fase lysmikroskop, og identificere BFU-E, CFU-GM, og CFU-GEMM-kolonier ved kolonimorfologi, som beskrevet af Goldie et al. 11.
- For at vurdere kolonidannelse med cellemorfologi:
- Aspirer enkelte kolonier fra methylcellulose overflade i en P1000 spids med enden trimmes at udvide boring. Dette letter aspiration af viskose methylcellulosemedium og sikrer vellykket genfinding af kolonien.
- Resuspender plukket kolonier i 200 ml HBSS og centrifugering på en glasplade ved hjælp af en cytocentrifuge ved 28 xg i 5 min.
- Fix dias i 100% methanol i 5 min (ADVARSEL: Methanol er giftigt og bør kun anvendes i en kemisk hætte med passende ventilation og personlige værnemidler).
- Sænk dias i 0,04% Giemsa farve i 20 min (ADVARSEL:. Giemsa farve indeholder methanol Anvendelse i en kemisk hætte med passende ventilation personal beskyttelsesudstyr).
- Skyl objektglassene i deioniseret vand.
- Mount glider med dækglas og billede ved stor forstørrelse under en standard lys mikroskop, sammenligner celle morfologi til at klassisk observeret i hæmatopoietiske celler fra voksne knoglemarv, der er dyrket i methylcellulose medier. For eksempler, se producentens anvisninger.
- For at vurdere kolonidannelse med celle ekspression af en hæmatopoietisk linje markører ved FACS:
- Tilsæt 2 ml HBSS til hver brønd i en 24-brønds plade indeholdende kolonier dyrket på 0,5 ml methylcellulose (dvs. fortyndes kommercielt tilgængeligt lager methylcellulose 1: 4). Pipettere op og ned for at blande, og overførsel til friske rør (s).
- Centrifuge prøve ved 2000 xg i 5 min ved 4 ° C under anvendelse af en standard bordplade mikrocentrifuge.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten (er) i 1 ml HBSS +, samle prøver, hvis det ønskes.
- Centrifuge prøve ved 2000 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten (r) i 400 pi HBSS +.
- Alikvot i fire 1,5 ml rør som følger: Ufarvet; B220-FITC kun; GR-1-FITC kun; TER119-FITC alene.
- Tilføj fluorescens-konjugeret antistof til passende rør til en slutkoncentration på 2 pg / ml. Der inkuberes ved 37 ° C i 15 minutter.
- Centrifuge prøve ved 2000 xg i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i iskold 0,5 ml HBSS.
- Analyser hver prøve ved FACS for ekspression af hvert hæmatopoietisk linje markør: B220 markerer B-celler 20; GR-1 markerer myeloide celler 21; TER119 markerer erythroide celler 22.
Bemærk: Yderligere antistoffer rettet mod andre hæmatopoietisk afstamning markører kan inkorporeres i denne tilgang, hvis det ønskes.
Representative Results
Vellykket mærkning af hemogenic endotelceller og HSPC fra embryonale YS eller AGM vil give FACS scatter plots ligner de repræsentative plots præsenteret i figur 3. Efter standard levende celle og dublet forskelsbehandling fremad og sidespredning (ikke vist), side befolkning (SP) begivenheder visualiseres i en lineær Hoechst Red vs. Hoechst Blå differentialplottet i fravær af verapamil som en "skulder" venstre-forskudt fra størstedelen af begivenheder (ikke-SP) (figur 3A). Når SP porten er formelt korrekt, vil SP celler repræsenterer ca. 1 - 3% af det samlede levedygtige YS celler og 3 - 5% af de samlede levedygtige AGM begivenheder. Verapamil behandling bør resultere i> 50% inhibering af SP begivenheder uanset vævskilde (figur 3A, toppaneler). Vi har tidligere fastslået, at andre befolkningsgrupper, der vises uden for SP skulder, men er også blokeret af verapamil er TER119-positive erythroblaster og er derfor udelukket fra vores SP befolkning 5.
Sammenlignet med SP, er ikke-SP-celler identificeret som den tætte klynge af celler støder op til SP "skulder" (figur 3A). Denne population indeholder ikke-Hemogenic EF, der kan skelnes ved hjælp af et CD31-PE versus CD45-FITC datter plot (figur 3B), som CD31 + / CD45- begivenheder. Ikke-Hemogenic EF er typisk 2 - 5% af ikke-SP celler fra AGM (figur 3B) eller blommesæk (ikke vist), og høje antal af disse celler kan sorteres tilbage med relativ lethed.
Til identifikation af HSPC og Hemogenic EF, er datter porte trækkes fra SP fraktionen, identificere CD45 + og CD45- celler, hvor CD45 + -celler er typisk <20% af alt hændelser i både AGM (figur 3C) eller YS (ikke vist). Hemogenic EF efterfølgende identificeret fra CD45- celler i en differential cKit-APC vs. Flk1-PECy7 datter pparti som dobbelt-positive begivenheder, og typisk repræsenterer 1 - 3 ud% af CD45- hændelser, når isoleret fra enten AGM (figur 3 D) eller YS (ikke vist). HSPC identificeres fra CD45 + fraktionen i en separat cKit-APC versus Flk1-PECy7 datter plot som Flk1- / cKit + -celler, og også typisk udgør ca. 25 - 30% af den lille population af CD45 + celler, når opnået fra enten YS (ikke vist) eller AGM (Figur 3 E). Således kan både Hemogenic EF og HSPC er undtagelsesvis sjældne (~ 0,01% af de samlede celle hændelser), og det er typisk for denne protokol til at returnere et par hundrede af hver celletype, selv når væv fra flere embryoer pooles. Gates i datter plots bør etableres med henvisning til negative kontrolgrupper. For at skelne mellem specifikke og ikke-specifikke antistof-farvning, bør porte der oprindeligt tegnet i forhold til begge Ufarvede kontroller (figur 3C), samt prøver, der er blevet behandlet med fluorescens-konjugerede isotype-matchede (IgG2A eller IgG2b) kontrol antistoffer (ikke vist). Sidstnævnte kontrol har vist, at ikke-specifik farvning er minimal ved denne protokol, derfor mens vi anbefaler, at isotype-matchede kontrol antistoffer (f.eks., IgG2a-PE eller IgG2b-FITC) i første omgang bruges til at optimere FACS sorteringsanlæg indstillinger og bestemme gate grænser finder vi også, at ufarvede kontroller er tilstrækkelige til at kontrollere gate grænser og eksperimenterende kvalitet under rutinemæssige FACS sortering. Hvis porte er korrekt trukket, skal minimal positiv scatter iagttages i single- eller dobbelt-positive porte, når du optager fra ufarvede eller isotype-matchede kontroller.
Hemogenic endotelceller fra generalforsamlingen og HSPC gennemgår hæmatopoietisk differentiering over 14 dages kultur i methylcellulose (figur 4A). Den relative andel af kolonityper typisk observeres i dissekulturer afhænger vævskilde. Hemogenic endothelceller isoleret fra blommesækken væv ved E8.5-E9.5 giver anledning til BFU-E, CFU-GM, og kun få CFU-GEMM 5, hvorimod hemogenic endotelceller isoleret fra E10.5 AGM giver anledning til overvejende CFU -GEMM 12, selv om andre afstamninger stadig overholdes, som vist i figur 4B (øverste venstre panel). HSPC isoleret fra E10.5 AGM også give anledning overvejende til CFU-GEMM på kultur i methylcellulose (figur 4B, øverste midterste panel), selv om disse celler også vil differentiere til andre hæmatopoietisk koloni typer som godt. Ikke-hemogenic endotelceller (CD31 + / CD45- non-SP) er også blevet udpladet (figur 4B, øverste højre panel). Disse celler demonstrerer ingen vækst i hæmatopoietisk kultur efter 14 dage.
Assays af hæmatopoietisk kapacitet individuel overflademarkør udtrykkende celletyper, herunder celler med og uden ekspression af hæmatopoietisk and endotel markører CD31, Flk1, c-Kit, VE-cad, CD41, og CD45 inden SP brøkdel af generalforsamlingen på E10.5 er blevet udført, og vise, at multi-slægt kolonidannende aktivitet i E10.5 AGM er begrænset til CD31 +, VE-cadherin +, c-Kit +, CD41 + og CD45 + SP celler 12. Interessant nok blev kolonidannende aktivitet noteret i både FLK-1 + og FLK-1- SP-celler, men kun Flk1 + c-Kit + CD45- SP-celler gav anledning til multi-slægt kolonier via en endotelmonolaget mellemprodukt karakteriseret ved både "brosten "endotelceller morfologi (figur 4B, nederste venstre panel) og af Dil-AcLDL optagelse 12. Desuden er nødvendig for hæmatopoietisk aktivitet AGM SP celler 12 udtryk for c-Kit.
Mens det er blevet vist, at visse myeloide stamceller har lignende morfologiske karakteristika sammenlignet med hemogenic endotelceller, myeloide progenitorceller udtrykker CD45 og kan ikke generere multi-slægt kolonier
Figur 1. Samlet Workflow. Kort fortalt er embryoer fjernet fra gravide moderdyr, og YS eller AGM væv høstes. Embryoner kan eventuelt dyrket i 2 4 - 48 timer ex vivo før væv høst. Høstede YS eller AGM væv spaltes en enkelt cellesuspension, opdelt i alikvoter i kontrol- og prøveglas og inkuberet i nærvær af Hoechst farvestof og / eller fluorescens-konjugerede antistoffer. Verapamil, en calcium kanal hæmmer, er også brugt til at generere en negativ kontrol afgørende for verifikation af nøjagtig gating af SP fraktionen. Hemogenic endotelceller identificeres ved FACS som Flk1 + / cKit + / CD45- SP-celler, mens HSPC er indeholdt i Flk1- / cKit + / CD45 + SP fraktionen af celler; både celletyper er ordnet på methylcellulose om bekræftelse af hemogenic potentiale. Derudover kan ikke-hemogenic endothelceller diskrimineres (og hentes, hvis det ønskes) som CD31 + / CD45- non-SP celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
igur 2 "src =" / files / ftp_upload / 54150 / 54150fig2.jpg "/>
Figur 2. Dissektion af YS og AGM væv. A) YS dissekeres væk fra E8.5 embryoer, og placeret hele i sterilt HBSS + til efterfølgende fordøjelse. B) Stammen af E10.5 embryoer isoleres ved at gøre vandrette snit under både forben og bagbenenes knopper. Generalforsamlingen derefter adskilt fra lemmer knopper og ventrale væv ved hjælp af pincet. C) Lys-field billeder viser dissektion af både YS og AGM fra en E10.5 embryo (skala = 1 mm). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Repræsentative Plots Demonstration Gate hierarki for diskriminationaf Hemogenic endotel Cell s (Flk1 + / cKit + / CD45- SP celler), HSPC (Flk1- / cKit + / CD45 + SP celler), og ikke-hemogenic endotelceller (CD31 + / CD45- ikke-SP) ved FACS fra E8.5 YS eller E10.5 AGM. efter levende celle og dublet diskrimination af celler fra enten YS (venstre paneler) eller AGM (højre paneler) ved frem- og sidespredning (ikke vist), A) den side befolkning (SP) gate er trukket og verificeret ved et signifikant fald af SP fraktionen i Verapamil-behandlede negativ kontrol. Den ikke-SP population er identificeret som den tætte klynge af celler støder op til SP. I hver af de præsenterede plots vises 20.000 begivenheder b) ikke-hemogenic endotelceller identificeres som CD31 + / CD45- celler i ikke-SP fraktionen, og repræsenterer 2 -. 5% af ikke-SP solceller, også opnået fra AGM (vist ) eller YS (ikke vist). at diskribringe anvendelsen Hemogenic EF eller HSPC, C) datter porte er trukket fra SP fraktionen at identificere CD45 + og CD45- celler. D) Til identifikation af hemogenic endotelceller fra enten AGM (vist) eller YS (ikke vist), er yderligere datter porte trukket fra CD45- fraktion til at skelne cKit + (vs. cKit-) og Flk1 + (vs. Flk1-) celler. Hemogenic EF fra enten YS eller AGM er typisk ~ 1 - 3% af CD45- begivenheder E) HSPC er identificeret fra CD45 + fraktion som cKit + og Flk1-, og typisk repræsenterer 20 -. 30% af CD45 + celler hvorvidt sorteret fra AGM (vist ) eller YS (ikke vist). klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. udstyr og forretnilization af Hæmatopoietisk Differentiering efter Kultur Hemogenic endotelceller og HSPC på Methylcellulose. A) Kolonier form fra sorterede enkelte celler indenfor 7 dage efter plating på methylcellulose. Multi-slægt hæmatopoietisk potentiale kan bekræftes ved observation af flere bloddannende koloni typer, identificeret ved vurderingen af særskilte koloni morfologier 11. B) Fase mikroskopisk billeddannelse af sorteres hemogenic EF og HSPC fra AGM (eller YS, ikke vist) viser multi-slægt hæmatopoietisk kolonidannelse efter 7 dages dyrkning i methylcellulose dyrkningsmedium. Ikke-hemogenic EF AGM (eller YS, ikke vist) viser ikke vækst under disse betingelser. Ved højere forstørrelse, kan vedhæftende celler med klassisk "brosten" endotelceller morfologi (hvid pil) ses at give anledning til klynger af hæmatopoietiske celler i culturer af hemogenic EF; ikke sådanne endotelceller observeres i kulturer af sorterede HSPC (skala = 100 um). Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Der er stadig mange ubesvarede spørgsmål inden for hematovascular udvikling - et område, der stadig er i sin vorden på grund af de tekniske vanskeligheder forbundet med at studere forbigående og små cellepopulationer, der dukker kun under særlige udviklingsbehov vinduer. De teknikker skitseret ovenfor forbedre mange af disse vanskeligheder ved at tillade isolering af selv enkelte celler fra hemogenic endotelceller og HSPC befolkninger i embryonale væv på kritiske udviklingsmæssige tidspunkter ved hjælp af reagenser og udstyr, der typisk findes i de fleste laboratorier. Vores protokol giver også mulighed for parallel isolation af ikke-hemogenic endotheliale cellefraktioner fra YS og AGM, der kan anvendes til uafhængige analyser, eller som kontroller for hemogenic endotelcelle fraktion i efterfølgende analyser.
Et centralt punkt i isoleringen af de hemogenic endotelceller ved hjælp af denne flerfarvet FACS-baserede metode er hensigtsmæssig spektrale compensation og præcis tegning af ensfarvede porte. Som sådan, anbefales det kraftigt, at ufarvede og ensfarvede kontroller inkluderes i alle eksperimentelle kørsler, og at de - sammen med prøver behandlet med isotype-matchede kontrol antistoffer - anvendes til at begynde med at etablere en ordentlig spektral kompensation og tegning af porte. Men ikke-specifik farvning er minimal ved denne protokol, således ufarvede og ensfarvede kontroller er tilstrækkelige til rutinemæssig kontrol af porte, når FACS sorteringsanlæg indstillinger er blevet optimeret.
Unøjagtigt trukket SP porte er en særlig bekymring med tilgangen er beskrevet i denne rapport. Tidligere undersøgelser har vist, at multipotente stamceller udviser præferentiel udstrømning af Hoechst rød 17, der danner den fysiologiske basis for deres udseende i SP ved FACS. Vi har vist, at hemogenic endotelceller og HSPC er tilsvarende inden SP cellefraktion 5,11. Lægemidler såsom calcium kanal ihibitor Verapamil blokerer denne Hoechst farvestof efflux adfærd i SP celler via blokering af en række transmembrane multiresistens transportører. I hæmatopoietiske stamceller og stamceller, dette sker primært via ABCG2 / BCRP1 transporter 24. Typisk verapamil inducerer> 50% blokering af SP, men har vist den samlede grad af Hoechst efflux og efterfølgende blokering af Verapamil ses at være påvirket af udviklingsmæssig timing, formodentlig på grund af skiftende ekspression af multiple multilægemiddelresistente transportproteiner typer med differentiale Hoechst efflux evne, og følsomhed over for Verapamil 5. Det er således anbefales, stærkt, at Verapamil-behandlet Hoechst-farvet negativ kontrol skal standardmæssigt inkluderet for at sikre korrekt SP gating: Hvis en SP gate er formelt korrekt, skal registreres en bemærkelsesværdig reduktion i antallet af SP celler i prøver farvet med Hoechst i tilstedeværelsen af verapamil.
Vi har tidligere vist, at sorteretSP-celler fra E9.5 murine blommesækken har en ca. 80 - 90 gange større evne til at generere HSPC i methylcellulose-baserede hæmatopoietisk kultur, når sammenlignet med en matchet antal E9.5 ufraktioneret, ikke-Hoechst farvede hele YS vævsceller 5. Yderligere karakterisering af SP har vist, at i den murine blommesækken under tidlig hæmatopoietisk og vaskulær udvikling på E8.0, der er mærkbar ekspression af VE-cadherin og FLK-1, men lav ekspression af stamceller (c-Kit) og hæmatopoietiske markører (CD45). Således i denne udviklingsfase tidspunkterne, ur (ikke-hemogenic) EF, defineret som FLK-1 + / CD31 + / CD45- non SP celler dominerer. Dette udtryk profil skifter som endotel markør udtryk falder og CD45 og c-Kit ekspression øges, samtidig med en stigende evne til at generere HSPC in vitro mellem E9.5 og E11.5 5. Dette tyder hæmatopoietisk aktivitet af YS væv er indeholdt i SP, bliver tydeligst mellem E9.5 og E11.5, og occurring gennem en tidsindstillet tab af endotel karakteristika og gradvis erhvervelse af hæmatopoietisk kapacitet. Som sådan ekspression af de multilægemiddelresistens transportører, der giver anledning til SP fænotype er en vigtig fænotypisk markør for hemogenic endotel 5; Faktisk behøver ikke-SP celler fra AGM ikke udviser bloddannende potentiale 12. vellykket isolering af SP via Hoechst-farvning i både YS og AGM sikrer således, at celler vil blive sorteret fra den hæmatopoietiske stamceller ved en givet væv, og efterfølgende antistof farvning af celler i denne fraktion vil tillade diskrimination af hemogenic (Flk -1 + / c-kit + / CD45-) versus HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) populationer 5,11,12. Endvidere har det været tidligere bemærket, at CD41 + celler i SP af blommesækken og AGM væv er i stand til multi-slægt kolonidannelse i methylcellulose baseret kultur 11,12. Vi definerer hemogenic endotelceller som Flk1 + c-Kit + CD45- SP celles ved hjælp af CD45 som en udpeget markør for hæmatopoietisk afstamning snarere end CD41 givet vores konstatering af, at ekspressionen af Flk1 og CD45 er næsten udelukker hinanden 5,11. Dette giver en ren isolation af celler i SP, der har både endotel (FLK-1) og spindel egenskaber (c-Kit) er nødvendige til endotel til hæmatopoietisk overgang men som endnu ikke har undergået denne ændring, som bestemt ved fravær af CD45 i disse celler. Det ville være nyttigt at overveje sub-fraktionering af HSPC befolkning, defineret som FLK-1- / c-Kit + / CD45 + / SP celler, i Csf1r + (væv makrofag) og Csf1r- (HSC) fraktion som for nylig rapporteret af Gomez og kolleger 25, da dette ville give større opløsning af den sande HSPC versus væv makrofag progenitorpopulationer, men dette bør ikke påvirke integriteten af hemogenic endothelcelle fraktion, hvis isolation vi har skitseret siden Csf1r er en markør for makrofag progenitorer 26.
HemogENIC endotelceller er en sjælden subpopulation i både YS og AGM (omfattende 1 - 3% af endotelceller), og derfor en stor udfordring i deres undersøgelse er utilstrækkelig celle udbytte for efterfølgende ansøgninger. Denne protokol normalt resulterer i 70-80% af cellerne resterende levedygtige på tidspunktet for sortering, og en typisk hemogenic endotelcelle slags fra poolede væv opnået fra talrige fostre kan give kun få hundrede celler selv under optimale betingelser med kun 10-20% for udtagne celler indlejret i methylcellulose producerende kolonier. For at maksimere sorterede celle nummer, anbefales det kraftigt, at efterforskerne tager skridt til at sikre væv og cellernes levedygtighed gennem alle trin i proceduren: væv bør hurtigt dissekeret og samlet, og prøver skal opbevares på is når det er muligt. Prøverne bør være forberedt frisk umiddelbart før FACS sortering, og sorteret i indsamling rør indeholdende højt serum indhold, eller direkte i methylcellulose kultur som beskriverd ovenfor. Hvis levedygtighed fortsat problemer, opsamlingsrør kan også være præ-coatet med serum for yderligere at forbedre sorterede celleoverlevelse. Hvis hemogenic endotelcelle udbytte er fortsat lav, kan voksen knoglemarv eller kommercielt tilgængelige fluorofor-konjugerede perler anvendes til spektral godtgørelse for de embryonale vævsafledte enkelt farveindstillinger beskrevet heri. Hvis sorterede celler er beregnet til kultur, bør hemogenic endotelceller og HSPC sorteres direkte i vævsdyrkningsbrønde. Hvis sorterede celler er beregnet til DNA eller RNA-relateret genekspression analyse, hemogenic og ikke-hemogenic endotelceller og HSPC kan sorteres direkte i opsamlingsrør indeholdende prøve lyseringspuffer at minimere celletab.
Den skitserede teknik tillader vellykket (og samtidig) isolering af hemogenic og ikke-hemogenic endotelceller, samt HSPC og modne blodlegemer fraktioner fra samme embryoniske væv. Denne tilgang muliggør yderligere study af de molekylære fundament for de kritiske overgange, der opstår som endotelceller genererer blod. Erfaringer fra disse udviklingsmæssige undersøgelser kan derefter anvendes til at optimere genereringen af humane hemogenic endothelceller og HSPC afkom fra pluripotente, og potentielt autologe stamceller til behandling af fremherskende hæmatopoietiske lidelser.
Disclosures
Dette arbejde blev støttet byNIH tilskud HL128064, HL096360, EB017103, og CT Innovations giver 15-RMB-YALE-04, til KKH, og NICHD / NIH T32HD007094.
Acknowledgments
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) | Sigma | D5942 | TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling. |
| Absorbent bench underpad | Covidien | 7134 | |
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | TOXIC inhalant: Use in fume hood. |
| 100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000 U/ml Penicillin, 10,000 mg/ml Streptomycin, 29.2 mg/ml L-glutamine) | Invitrogen | 10378016 | |
| Type II Collagenase | Worthington | LS004174 | |
| Falcon 70 μM nylon cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| Anti-Mouse CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
| Anti-Mouse CD31 - PE | eBioscience | 12-0311-81 | |
| Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 561259 | |
| Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma | 14533 | TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25 mg/ml in distilled H2O, store aliquots at -20 °C until ready for use. |
| Verapamil Hydrochloride | Sigma | 1711202 | TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling. Prepare stock solution of 5 mM (100x) in 95% ethanol. Store at -20 °C until ready for use |
| Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| MethoCult GF M3434 | Stem Cell Technologies | 3434 | Thaw and aliquot per manufacturer's instructions |
| Modified Giemsa Stain | Sigma | GS500 | TOXIC: Contains Methanol - use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution. |
| Cytospin Centrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Clipped Funnel Starter Kit | Thermo Scientific | 3120110 | Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge |
| Anti-Mouse B-220 - FITC | BD Pharmingen | 553088 | |
| Anti-Mouse Gr-1-FITC | eBioscience | 11-5931-85 | |
| Anti-Mouse Ter-119-FITC | eBioscience | 11-5921-85 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 10437-077 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5 g/L) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate | EMD Millipore | PIFB24P05 | |
| IgG2A-PE | BD Pharmingen | 553930 | |
| IgG2B-FITC | BD Pharmingen | 556923 |
References
- Hirschi, K. K. Hemogenic endothelium during development and beyond. Blood. 119 (21), 4823-4827 (2012).
- Boisset, J. C., et al. et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464 (7285), 112-115 (2010).
- Nadin, B. M., Goodell, M. A., Hirschi, K. K. Phenotype and hematopoietic potential of side population cells throughout embryonic development. Blood. 102 (7), 2436-2443 (2003).
- Nakano, H., et al. Haemogenic endocardium contributes to transient definitive haematopoiesis. Nat Commun. 4, 1564 (2013).
- Li, Z., et al. Mouse embryonic head as a site for hematopoietic stem cell development. Cell Stem Cell. 11 (5), 663-675 (2012).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- de Bruijn, M. F., Speck, N. A., Peeters, M. C., Dzierzak, E. Definitive hematopoietic stem cells first develop within the major arterial regions of the mouse embryo. Embo J. 19 (11), 2465-2474 (2000).
- Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
- Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-Kit, Notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Dev Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
- Tavian, M., et al. Aorta-associated CD34+ hematopoietic cells in the early human embryo. Blood. 87 (1), 67-72 (1996).
- Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21 (1), 31-41 (2004).
- Kelly, M. A., Hirschi, K. K. Signaling Hierarchy Regulating Human Endothelial Cell Development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 718-724 (2009).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), (2010).
- Bohnsack, B. L., Lai, L., Dolle, P., Hirschi, K. K. Signaling hierarchy downstream of retinoic acid that independently regulates vascular remodeling and endothelial cell proliferation. Genes Dev. 18 (11), 1345-1358 (2004).
- Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of the T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
- Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151 (5), 2399-2408 (1993).
- Kina, T., et al. The monoclonal antibody TER-119 recognizes a molecule associated with glycophorin A and specifically marks the late stages of murine erythroid lineage. British Journal of Haematology. 109 (2), 280-287 (2000).
- Jackson, K. A., et al. Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. J Clin Invest. 107 (11), 1395-1402 (2001).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
