Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Выделение мышиной эмбриональных кроветворных эндотелиальных клеток

Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/54150
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Departments of Medicine, Genetics and Biomedical Engineering, Yale Cardiovascular Research Center, Vascular Biology and Therapeutics Program, Yale Stem Cell Center, Yale University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Yale University School of Medicine, 3Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Гемопоэтические стволовые и клетки-предшественники (HSPC) вытекают из специализированных (кроветворный) эндотелиальных клеток в процессе развития, но мало известно о процессе, с помощью которого некоторые эндотелиальные клетки указать, чтобы стать кроветворные. Мы демонстрируем метод, основанный проточной цитометрии, позволяющий одновременное выделение кроветворных эндотелиальных клеток и HSPC из мышиных эмбриональных тканей.

Abstract

Спецификация кроветворных эндотелиальных клеток из эмбриональных эндотелия сосудов происходит в течение коротких периодов развития в рамках различных тканей, а также необходимо для возникновения окончательного HSPC из мышиного дополнительного эмбрионального желтка, плаценты, пуповины сосудов и эмбриональных аорто-гонады-мезонефроса ( AGM) регион. Переходный характер и небольшой размер этой популяции клеток делает его воспроизводимым изоляции для тщательной количественной оценки и экспериментальных приложений технически сложно. Мы установили флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS) протокола для основанное одновременной изоляции кроветворных клеток эндотелия и HSPC во время пиковой нагрузки генерации в желтка и AGM. Мы демонстрируем методы для рассечения желтка и AGM тканей из эмбрионов мышей, и мы представляем оптимизированными пищеварением ткани и конъюгации антитела условия для выживания клеток максимального до идентификации и поиска с помощью FACS. Представитель FACS анализиса участки показали, что идентифицировать гемогенного эндотелиальные клетки и HSPC фенотип, и описывают анализ метилцеллюлозы на основе оценки их крови формирующий потенциал на клонального уровне.

Introduction

Функциональная система кровообращения требует параллельного развития кровеносных сосудов и клеток крови. На самых ранних стадиях развития крови (примитивно кроветворения), происхождение эритробластов остается активно обсуждается 1. В противоположность этому, на более поздних стадиях развития клеток крови (окончательное кроветворения), она становится все более очевидным, что мульти-родословная HSPC возникают из специализированных клеток эндотелия сосудов, приобретающих кровь, образуя потенциал (гемогенного эндотелиальные клетки) в пределах желточного мешка, плаценты и AGM 2-5, а также в желточной и сосудов пуповины, эмбриональной эндокарда 6 и 7 головки сосудистую сеть . Спецификация кроветворных эндотелиальных клеток в этих различных тканях происходит на определенных этапах развития; например, в пределах желтка при ~ E8.25 и в ГОСА при ~ E10 8-12. Тем не менее, даже в этих конкретных окон развития, население гемогенного эндоthelial клетки представляет собой небольшую часть всех эндотелиальных клеток (1 - 3% от желтка и AGM эндотелиальных клеток) 11,12. Процесс кроветворения эндотелиальных клеток "спецификации" имеет решающее значение для мышиных, а также человека, кроветворения. Кроветворные клетки , как было показано бутона от эндотелии желтка сосудов и аорты у эмбрионов человека , 13, и несколько лабораторий показали , что производство клеток крови из человеческих плюрипотентных стволовых клеток требует эндотелиальные клетки промежуточного 14-16. Таким образом, определение фенотипа мышиных кроветворных эндотелиальных клеток и понимания молекулярных событий , которые приводят к их развитию в этой модели на животных должно облегчить преследование технологий в пробирке для генерации кроветворных эндотелиальных клеток , извлеченных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток. В свою очередь, в конечном итоге разработка подхода для крупномасштабного производства дифференцированных типов клеток крови из нескольких клонов HSPC - сами Деривед из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с помощью физиологически соответствующих кроветворный эндотелиальных клеток промежуточной - будет иметь невероятный терапевтический потенциал для гематологических, онкологических и восстановительной медицины. Для достижения этой цели мы определили фенотип кроветворных клеток эндотелия, на клонального уровне, в пределах мышиного желтка 11 и AGM 12, два основных участков окончательного HSPC производства во время эмбриогенеза. Как HSPC внутри костного мозга взрослого 17, эмбриональных кроветворных клеток эндотелия и HSPC проявляют Hoechst свойства эффлюксных краситель и , следовательно , появляются в "боковой" населения (SP) клеток на участке FACS 5,11,12 (как показано на рисунке 3). Кроме того, мы также показали , что эндотелиальные клетки кроветворных выражают маркеры как эндотелиальные , так и стволовых клеток (Flk1 и cKit, соответственно), но не выражают гемопоэтических клонов маркер CD45 5,11,12. Таким образом, гемогенного эндотелиальные клетки могут быть идентманьяков и выделяют FACS как клетки Flk1 + / cKit + / CD45- SP, и мы показали , что эти клетки дают начало HSPC , содержащийся в / cKit + / CD45 + SP фракции Flk1- из желтка и клеток AGM 5,11,12. Гемогенного эндотелиальные клетки и HSPC могут быть идентифицированы и изолированы от желтка или AGM тканей заготовленной либо из свеже эвтаназии эмбрионов, или из зародышей , культивированных в течение до 48 часов в бывшей естественных условиях культивирования эмбрионов (как показано на рисунке 1). Ex Vivo культуры позволяет селективное предварительная обработка индивидуальных эмбрионов с фармакологическими агентами, а также позволяет временную экспрессию желаемых трансгенов (т.е. путем лентивирусов трансдукции). идентификация FACS из кроветворных клеток эндотелия и HSPC по способу, описанному здесь, могут быть использованы в качестве количественной меры окончательного гемопоэтических развития в генетически измененных мышах; клетки также могут быть получены для последующих экспериментальных применений, включая кровь-фоrming анализы, анализ экспрессии и трансплантации.

Субъекты животных: Пользы и этические соображения

Растущий объем литературы установил важный вклад кроветворных эндотелиальных клеток к формированию HSPC во время окончательной стадии гемопоэза эмбрионального развития. Тем не менее, физиологические условия и сигналы , которые способствуют спецификации субпопуляции эндотелиальных клеток в сторону гемогенного судьбы остаются плохо понятыми, и поэтому еще не может быть передразнил в обстановке в пробирке. Действительно, методы , описанные в этой статье, используемых в настоящее время нашей лаборатории и других групп , чтобы улучшить понимание на местах по hematovascular развития, таким образом, что подход к экс естественных гемогенного спецификации эндотелиальных клеток и производства HSPC однажды может быть разработана. До тех пор, однако, поле остается зависимой от первичных тканей от дикого типа (и геначески модифицированные) эмбрионов мыши для указания гемогенного эндотелиальные клетки и HSPC для дальнейшего изучения. Гемогенного эндотелиальные клетки и HSPC могут быть надежно идентифицированы и изолированы от любой E8.5 (10 - 12 пар сомитов) желтка или E10.5 (35 - 40 сомитов пар) AGM 11,12. Из - за относительного дефицита кроветворных эндотелиальных клеток (обычно представляющий 1 - 3% от общего количества эндотелиальных клеток 11,12 в этих тканях) объединение тканей из множества (~ 8 - 10) Однопометники в одном образце настоятельно рекомендуется, чтобы получить достаточное количество клеток для последующего эксперимента. Проверка того, что гемогенного эндотелиальные клетки и HSPC были успешно идентифицированы и выделены может быть достигнуто путем культивирования клеток, извлекаемых в условиях, которые индуцируют дифференцировку гемопоэтических. В этих условиях, гемогенного эндотелиальные клетки и HSPC будут демонстрировать несколько клонов кроветворной дифференцировки, что приводит к появлению колоний, содержащих ERythroid клетки-предшественники (BFU-E), гранулоциты и макрофаги клетки-предшественники (CFU-GM) и гранулоцитов, эритроцит, макрофаг, колонии мегакариоцитов (прогениторных помощью CFU-GEMM).

Protocol

Заявление по этике: Протокол приводится ниже был рассмотрен, и в соответствии с руководящими принципами, Institutional Animal Care Йельского университета и использование комитета.

1. Всего Эмбрион Ex V Иво Культура для желтка исследований (Необязательно)

  1. Эвтаназии беременных плотин на E7.0 - E7.5, и удаления рогов матки в стерильных условиях, как описано более подробно ниже (шаги 2.4 - 2.7).
  2. Отдельные целые эмбрионы (с желтка неповрежденной 12) от окружающих децидуальной и приостановить в 50 мл цельной сыворотки крысы в 50 мл полистирольные пробирки.
  3. Газовый эмбрион бутылки в течение 3 мин с 5% CO 2 немедленно , как описано выше 12,18. Повторите этот шаг через 24 часа, если культивирование эмбрионов в течение 24 - 48 часов.
  4. Выдержите в прокат 37 ° C культуру до 48 часов.
    Примечание: Эмбрионы можно лечить экс виво с фармакологическими агентами (например, ингибитор Notch DAP.Т - 12) или растворимые белки (т.е. фибронектин 19) посредством предварительной инкубации эмбрионов в течение до 2 часов в культуральной среде , содержащей такие факторы, или за счет добавления этих факторов в прокатном культуральной среде в течение всего периода экс виво культуры период. Экспрессия гена можно манипулировать в эмбрионах путем предварительной инкубации эмбрионов с оптимальным образом титруют лентивирусов в течение 2 ч 12. Желток мешка сосудистой и развитие гемопоэтических можно наблюдать в режиме реального времени с использованием трансгенных мышей, репортер и методы оптических изображений.

2. Рассечение желтка (YS) или аорто-гонады-мезонефроса (AGM) из эмбрионов мыши

  1. Стерилизовать лабораторном столе путем распыления и протирки все поверхности с 70% этанола, чтобы уменьшить загрязнение в последующих клеточных культурах. Поместите впитывающую на лежащей снизу поверхности лабораторного стола.
  2. Стерилизовать хирургических инструментов с 70% этанола. Рекомендуемые хирургические инструменты два # 5 прямая силапс, и один 8,5 см прямые ножницы.
  3. При работе с эмбрионами из бывшей культуры естественных условиях, тщательно удалить целые эмбрионы из 50 мл пробирки Фалкон и немедленно перейти к шагу 2.8. В противном случае, пропустите этот шаг и перейдите к шагу 2.4.
  4. Эвтаназии беременной плотины в соответствующем эмбрионального возраста (E8.5, если уборочных YS; E10.5 если заготовка AGM).
    Примечание: Описанный метод использует двойной метод эвтаназии подход - смертельная дозировка летучего анестетика с последующим механическим смещением шейных позвонков - минимизировать животных боль и страдания, а также обеспечить минимально инвазивной и гуманного прекращения субъектов животных. Этот комбинированный метод для небольшого грызуна эвтаназии Американской ветеринарной медицинской ассоциации рекомендуется при исполнении квалифицированным и опытным исследователем (АВМА Методические рекомендации по эвтаназии животных: 2013 Edition).
    1. Обезболить мышь , используя смертельную дозу изофлуран (> 5% в O 2) в течение 3 - 5 мин. (CAUTION: Isoflurane является токсичным ингаляционное; использовать при химическом вытяжном шкафу с соответствующими средствами индивидуальной защиты органов дыхания оборудования.)
    2. После облучения мышей к изофлуран, проверить по крайней мере три признаки анестетика уровня - потеря рефлекса выпрямления, потеря пальца ноги пинч рефлекса и снижению частоты дыхания - обеспечение субъектов достигли глубокого обезболивающий плоскости перед продолжением механической эвтаназии.
    3. Цервикально вывихнуть дамбу, чтобы быстро вызвать смерть.
  5. Поместите эвтаназии плотины лежа на спине на лежащей снизу и обильно опрыскивать нижнюю часть живота с 70% этанола.
  6. Сделайте вертикальный разрез по средней линии нижней части брюшной стенки. Сделайте дополнительные ~ 1 дюйм горизонтальные надрезы расширения вправо и влево от средней точки вертикального разреза, и отсечь брюшной стенки, чтобы полностью раскрыть правый и левый рога матки каждая из которых содержит несколько супоросные эмбрионов.
  7. Использование щипцов, удерживая одну из двух рогов маткии использовать ножницы, чтобы отделить его от mesometrium. Поместите расчлененный матка на льду в стерильной Хэнка сбалансированный солевой раствор (HBSS) в полистироле культуре ткани пластины 60 мм. Повторите эти действия для другого рога матки.
  8. Под стандартным светом микроскопом рассекает, используйте пинцет, чтобы отстраниться мышечный слой матки мешочке, чтобы выявить основные плодного яйца и децидуальной. Изолировать YS (рис 2A), осторожно снимая мешка с прилагающегося эмбриона. Удалить YS ткани из собственно эмбриона в эмбриональном происхождении желточных сосудов.
  9. Для того, чтобы изолировать AGM, удалите YS и секут эмбрион ниже уровня сердца и конечностями и отбросить грудной клетки и области головы. Далее, секут эмбрион чуть ниже уровня задних конечностей и удалить и выбросить хвост ткани. Удалить задних конечностей и избыток вентральной ткани от оставшейся части, которая содержит AGM (Фигура 2В).
  10. Бассейн YS или AGM ткани из нескольких эмбрионов и хранитьна льду в HBSS + (HBSS, с добавлением 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки и 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,3 мг / мл L-глутамина) в чистую 1,5 мл трубки.

3. Расщепление первичной ткани в одноклеточной суспензии

  1. Центрифужную пробирку, содержащую заготовленные YS или AGM ткани в течение 5 мин при 2000 х г при 4 ° С.
  2. Удалить супернатант и ресуспендируют ткани в 1 мл либо 0,05% (для YS) или 0,2% (для AGM) коллагеназы типа II, разбавленным HBSS +. Инкубировать в течение 30 мин на водяной бане при 37 ° С, инвертирование трубку каждые 5 минут, чтобы перемешать.
  3. Осторожно механически диссоциируют ткани путем пропускания пробы 10 раз через P1000 пипетки. Если возникли трудности с аспирационной частично переваренной ткани, пипетка отверстие наконечника может быть расширена за счет отрезав ~ 5 мм наконечник с парой ножниц.
  4. Центрифуга образец в течение 5 мин при 2000 х г при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют в 1 мл охлажденного льдом HBSS +.
  5. Пропустите образец через 70 &# 956; м ячейка ситечко.
  6. Граф клеток с помощью ручного или автоматизированного гемоцитометра.
  7. Центрифуга образец в течение 5 мин при 2000 х г при 4 ° С. Ресуспендируют образца в DMEM + (4,5 г / л глюкозы Дульбекко в модификации Дульбекко с добавлением 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки и 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, и 0,3 мг / мл L-глутамина) пред- нагревают до 37 ° с, что клетки находятся в конечной концентрации 1 × 10 6 клеток / мл.

4. Обработка клеток с Нуклеиновой Кислоты Dye и мечение флуоресцентно сопряженными АНТИТЕЛ

  1. Алиготе , по меньшей мере 100 мкл образца (1 × 10 5 клеток) в свежую 1,5 мл пробирки для инкубации антител.
  2. Включите следующую пробу и необходимые контрольные трубки: неокрашенные; только cKit-APC; только CD45-FITC; только CD31-PE; только Flk1-PECy7; Hoechst 33342 только; Hoechst 33342 только + верапамил; Образец (принимает все цвета, не получат верапамил). Используйте минимум 1 × 10 Примечание: больший объем клеток, могут быть добавлены в пробирку с пробой при той же концентрации, чтобы иметь максимальный выход отсортированной гемогенного EC и HSPC.
  3. Добавить Верапамил разводили в 95% этаноле (обсуждение см для обоснования) к "Hoechst 33342 только + верапамилом" контрольную пробирку до конечной концентрации 50 мкМ. Инкубируйте все пробирки в течение 5 мин при 37 ° С. (ВНИМАНИЕ: Верапамил является мощным кальциевых каналов блокирующий агент и является чрезвычайно токсичным Handle с перчатками.).
  4. Добавить Hoechst 33342 в "Hoechst только 33342" контроль, к + верапамила только для управления Hoechst 33342, а к "Sample" трубы до конечной концентрации 5 мкг / мл. Инкубируйте все пробирки в течение 1 ч при 37 ° С, в защищенном от света месте. Аккуратно взболтайте каждые 15 мин. (ВНИМАНИЕ: Hoechst 33342 является токсичным ядерным красителем и должны быть обработаны в перчатках).
  5. Центрифуга все SAMPле в течение 5 мин при 2000 х г при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют клеточный осадок при концентрации 1 × 10 5 клеток / мл в холодном HBSS +.
  6. Добавить флуоресцентно конъюгированных антител к соответствующим антителом только трубках управления, и к "образец" трубы до конечной концентрации 2 мкг / мл. Инкубировать на льду в течение 30 мин, защищенном от света месте.
  7. Центрифуга все пробирки в течение 5 мин при 2000 мкг при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл охлажденного льдом HBSS. Образцы процедить через сетчатый фильтр колпачок 5 мл полистирола с круглым дном FACS труб и хранить на льду, защищенном от света месте, для немедленного FACS.

5. Идентификация и выделение кроветворных эндотелиальных клеток и HSPC путем FACS

Примечание: Этот протокол был оптимизирован с использованием 5-лазерной системы BD FACSAria оснащенный 100 мВт УФ-лазера 355 нм, 200 мВт 405 нм Фиолетовый лазер, 200 мВт 488 нм Синий лазер, 200 мВт 532 нм Зеленый лазер, и 150 мВт 637 нм красныйлазер. Клетки были рассортированы в стерильной PBS в качестве оболочки жидкости и в асептических условиях, а также через сопла 100 мкм со скоростью потока, установленным на давление образца 1 таким образом, что максимум 1500 - 2000 событий приобретаются в секунду, чтобы свести к минимуму клеточный стресс.

  1. В соответствии с этими настройками, описанных выше, используйте "незапятнанным" и отдельных трубок управления цветом для оптимизации FACS Клеточный сортер интенсивности лазерного излучения и выполнять многоцветную контроль спектральной компенсации в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте вперед и боковое рассеивание для выполнения живой клетки и дублета дискриминацию от общих событий (см инструкции производителя для получения более подробной информации).
    Примечание: Этот протокол, как правило, приводит к ~ 70 - 80% жизнеспособных клеток. В случае возникновения проблем с низкой жизнеспособности клеток, убедитесь, что ткани первоначально рассеченные быстро ледяным СМИ, и что все шаги, за исключением тех, в противном случае указания выполняются на льду, с нежным пипеткой, чтобы свести к минимуму сдвиговой и клеточную смерть(См Обсуждение для более подробно о сохранении жизнеспособности клеток).
  2. С помощью дифференциального линейного масштаба участок Hoechst Красные против Hoechst голубой флуоресценции для идентификации на стороне населения (SP) события (рис 3А). Используйте контроль "Хехст 33342 только + верапамил" в качестве отрицательного контроля, чтобы убедиться в том, что ворота нарисовано для образца. SP появится в виде плеча слева от не-SP клеток, и будет уменьшена в Верапамил обработанного контроля. Популяция не-СП будет использоваться для идентификации , не гемогенного EC (фигура 3В).
  3. Создание дополнительных участков дифференциальной флуоресценции (срубы масштаба осей) и рисовать дочерние ворота из СП для идентификации кроветворных эндотелиальные клетки (рис 3C-E).
    Примечание: гемогенного эндотелиальные клетки профилированный как клетки Flk1 + / cKit + / CD45- SP (Рисунок 3D), и HSPC являются Flk1- / cKit + / CD45 + SP клетки (рис 3e). Гемогенного эндотелиальной гргезов можно анализировать параллельно с не-кроветворных эндотелиальных клеток, которые определены в данном подходе как CD31 + / CD45- клетках не-SP (фигура 3В).
  4. Получение гемогенного клетки эндотелиального или HSPC фракции на метилцеллюлозы, содержащей пластины для кроветворной культуры (см ниже), или в другие буферы для последующей обработки и анализа.

6. гемопоэтических Дифференциация в культуре

  1. Добавить 0,5 мл (135 мкл / см 2) на основе метилцеллюлозы кроветворную культуральных сред желаемое количество лунок 24-луночного планшета для культуры ткани при комнатной температуре. Добавить 0,5 мл стерильной воды в неиспользуемые лунки, чтобы минимизировать испарение. Подготовить свежие и держать при комнатной температуре до использования.
  2. Сортировка 1 - 10 ячеек для клонального анализа, или до 1000 гемогенного эндотелиальные клетки (Flk1 + / cKit + / клетки CD45- SP) или HSPC (клетки Flk1- / cKit + / CD45 + SP) для расширения объемной и дифференциации непосредственно в каждую лункупластина, содержащая метилцеллюлозы. Образование колоний обнаруживается приблизительно у 10 - 20%.
  3. В стерильной капот культуры ткани, используйте кончик P1000 с наконечником подстриженной расширить свое отверстие, аккуратно ресуспендируют каждую лунку посеянных метилцеллюлозы СМИ 2 - 3 раза, следя за тем, чтобы избежать создания пузырьков. Это обеспечивает приостановку отсортированных клеток в полужидком метилцеллюлозы для оптимального роста.
  4. Инкубируйте планшет при 37 ° С с 5% CO 2 в течение до 2 -х недель.
  5. Монитор одиночных клеточных культур для формирования дифференцированных гемопоэтических колоний клеток с течением времени (рисунок 4). Оценка лунок для числа и типа дифференцированных гематопоэтических колоний в дни 1, 3, 7 и 14 с помощью метода (ов), описанной ниже в пункте 6.7.
    1. Оценка пластины на 1-й день, чтобы подтвердить слитности и жизнеспособность отсортированных клеток.
    2. По 3-й день, проверить для раннего формирования прикрепленных кроветворных колоний эндотелиальных клеток с "Брусчаткатон "морфологии (см Голди и др. , 11 и Марсело и др. 12 для представления 3 -й день морфологии).
    3. По дням 5 - 7, проверьте для формирования закругленных кластеров HSPC в скважинах, содержащих отсортированный гемогенного EC. HSPC должны соблюдаться рядом с сплющенные гемогенного EC, отображающее "булыжник" морфологии эндотелиальных клеток.
      Примечание: гемогенного эндотелиальные клетки должны образовывать гемопоэтические колонии (определяемые кроветворной числом колоний), и должны продемонстрировать способность дифференциации нескольких клонов (определяют путем наблюдения нескольких типов колоний из одной клетки). Ранее мы наблюдали , что ~ 20% гемогенного EC или HSPC извлекается FACS выживают с образованием дифференцировки и пролиферации гемопоэтических колоний в метилцеллюлозы 11.
  6. Для оценки образования колоний путем фазовой микроскопии:
    1. Визуализируйте и подсчета колоний при небольшом увеличении ундэр фазы световой микроскоп, и идентифицировать BFU-E, CFU-GM и CFU-GEMM колоний по морфологии колоний, как описано Голди и др. 11.
  7. Для оценки образования колоний по морфологии клеток:
    1. Аспирируйте отдельные колонии из метилцеллюлозы поверхности в кончик P1000 с концом обрезается, чтобы расширить отверстие. Это способствует стремление вязкой метилцеллюлозы среды и обеспечивает успешное извлечение колонии.
    2. Ресуспендируют выбрал колонии в 200 мл HBSS и вращение на предметное стекло с помощью цитоцентрифуге при 28 мкг в течение 5 мин.
    3. Fix слайдов в 100% метанола в течение 5 мин (Внимание: Метанол является токсичным и должен использоваться только в химической капот с соответствующей вентиляцией и средствами индивидуальной защиты).
    4. Погрузитесь слайдов в 0,04% Гимза в течение 20 мин (Внимание:. Гимза содержит метанол используется в химической капюшон с соответствующей вентиляцией и человекааль защитное оборудование).
    5. Промыть слайды в деионизированной воде.
    6. Крепление сползает с покровные и восприятия изображения при большом увеличении в стандартном оптическом микроскопе, сравнивая морфологии клеток в том, что классически наблюдается в кроветворных клеток из костного мозга взрослого, которые культивируют в средах метилцеллюлозы. Для примеров, пожалуйста, смотрите инструкции производителя.
  8. Для оценки образования колоний путем экспрессии в клетках кроветворных маркеров линии дифференцировки по FACS:
    1. Добавьте 2 мл HBSS в каждую лунку 24-луночного планшета , содержащую колонии культивировали на 0,5 мл метилцеллюлозы (т.е. разбавить коммерчески доступного запаса метилцеллюлозы 1: 4). Пипетировать вверх и вниз, чтобы смешать, и передать свежую трубку (ами).
    2. Образец Центрифуга при 2000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С с использованием стандартной настольной микроцентрифуге.
    3. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток (а) в 1 мл HBSS +, объединяя образцы, если это желательно.
    4. CentrifuОбразец GE при 2000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
    5. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток (ы) в 400 мкл HBSS +.
    6. Аликвоты образцов в четыре 1,5 мл пробирки следующим образом: неокрашенные; только B220-FITC; GR-1-FITC только; только Ter119-FITC.
    7. Добавить флуоресцентно-конъюгированного антитела соответствующую пробирку до конечной концентрации 2 мкг / мл. Инкубируют при 37 ° С в течение 15 мин.
    8. Образец Центрифуга при 2000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в охлажденном льдом 0,5 мл HBSS.
    9. Анализ каждого образца FACS для экспрессии каждого кроветворной клонального маркера: B220 отмечает B-клетки 20; GR-1 марки миелоидных клеток 21; Ter119 отмечает эритроидных клеток 22.
      Примечание: Дополнительные антитела, нацеленные на другие маркеры гемопоэтические клональные могут быть включены в этот подход, если это желательно.

Representative Results

Успешная маркировка кроветворных эндотелиальных клеток и HSPC из эмбриональных YS или AGM будет дают FACS разброс участков , сходные с представительными участков , представленных на рисунке 3. Следуя стандартной живой клетке и дискриминации дублетном по прямой и боковой разброс (не показан), боковые населения (SP) события визуализируются в линейном Hoechst Красный против Hoechst Синий дифференциального участка при отсутствии Верапамил как "плечо" влево смещенной от большинства (не SP) событий (рис 3А). Когда SP ворота правильно нарисовано, SP клетки составляют приблизительно 1 - 3% от общего количества клеток жизнеспособна YS и 3 - 5% от общего количества жизнеспособных AGM событий. Верапамил лечения должно приводить к> 50% ингибирование SP событий , независимо от источника ткани (Фигура 3А, верхние панели). Ранее мы определили, что другие группы населения, которые появляются за пределами SP плеча, но также блокированные верапамила являются Ter119-положительным erythrобластей, и поэтому исключаются из нашего SP населения 5.

По сравнению с СП, не-SP клетки идентифицируют как плотного скопления клеток , прилегающих к ИП "плечо" (фиг.3А). Эта популяция содержит не-кроветворных ЕС , который можно отличить с помощью CD31-PE против CD45-FITC дочернего участка (рис 3B), как CD31 + / CD45- события. Номера гемогенного ЕС , как правило , 2 - 5% не SP клеток из ГОСА (рис 3б) или желтка (не показан), а также большого числа этих клеток может быть отсортирован назад с относительной легкостью.

Для идентификации HSPC и кроветворных EC, дочь ворота заимствованы из SP фракции, идентификации CD45 + и CD45- клетки, где CD45 + клетки , как правило , <20% от общего количества событий в обоих AGM (рис 3C) или YS (не показан). Гемогенного EC впоследствии идентифицированы из клеток CD45- в дифференциальной cKit-APC против Flk1-PECy7 дочь рмного , как двойных положительных событий, и , как правило , представляют собой 1 - 3% от событий CD45- при выделении из любого ГОСА (рис 3 D) или YS (не показан). HSPC идентифицируются из CD45 + фракции в отдельном cKit-APC против Flk1-PECy7 дочь участка как Flk1- / cKit + клеток, а также , как правило , составляют примерно 25 - 30% от небольшой популяции CD45 + клеток , когда получены либо из YS (не показано) или AGM (рис 3 Е). Таким образом, как гемогенного EC и HSPC исключительно редки (~ 0.01% от общего числа событий клеток), и это характерно для этого протокола, чтобы вернуть несколько сотен каждого типа клеток, даже когда ткань из нескольких эмбрионов объединенном. Ворота в дочерних участках должны быть установлены со ссылкой на отрицательных контрольных групп. Для того , чтобы различать между специфической и неспецифической меченых антител, ворота должны быть первоначально обращено в отношении обоих неокрашенные управления (рисунок 3С), а также образцы , которые были обработаны с флуоресцентно-конъюгированных изотипа (IgG2a или IgG2b) антител управления (не показан). Этот последний контроль показал , что неспецифическое окрашивание минимальна этим протоколом, поэтому пока мы рекомендуем изотипа контрольные антитела (например., IgG2a-PE или IgG2b-FITC) изначально используется для оптимизации параметров Сортировщик FACS и определяют границы ворот , мы также находим, что неокрашенные элементы управления являются достаточными для проверки границ ворот и экспериментальное качество во время обычных FACS сортировки. Если ворота правильно нарисовано, минимальный положительный разброс должен наблюдаться в одинарные или двойные ворота положительным при записи с неокрашенными или изотипа контроля.

Гемогенного эндотелиальные клетки из AGM и HSPC подвергаются кроветворной дифференциации более 14 дней культивирования в метилцеллюлозы (рис 4а). Относительная доля типов колоний, как правило, наблюдается в нихкультур зависит от источника ткани. Гемогенного эндотелиальные клетки , выделенные из тканей желточного мешка в E8.5-E9.5 подъема придают BFU-E, CFU-GM, и лишь немногие CFU-GEMM 5, в то время как гемогенного эндотелиальные клетки , выделенные из E10.5 ГОСА порождающие преимущественно КОЕ -GEMM 12, хотя возможны и другие клоны все еще ​​наблюдается, как показано на рисунке 4B (верхняя левая панель). HSPC изолированы от E10.5 AGM также дают расти преимущественно CFU-GEMM по культуре в метилцеллюлозы (рис 4В, верхняя средняя панель), хотя эти клетки будут также дифференцироваться в другие типы гемопоэтических колоний , а также. Non-гемогенного эндотелиальные клетки (CD31 + / CD45- не-SP) также покрыло (4В, верхняя правая панель). Эти клетки не демонстрируют рост гемопоэтических культуры через 14 дней.

Анализы кроветворной способности отдельных поверхностных маркеров, экспрессирующих типов клеток, включая клетки с и без экспрессии кроветворной ай эндотелиальные маркеры CD31, Flk1, с-Kit, VE-кадмиевые, CD41 и CD45 в рамках СП фракции AGM на E10.5 были выполнены и демонстрируют, что формирование мульти-родословная колонии активность в E10.5 AGM ограничено к CD31 +, VE-кадгерин +, с-Kit +, CD41 + и CD45 + SP клетки 12. Интересно отметить, что колониеобразующих активность была отмечена в обеих Flk-1 + и Flk-1- SP клеток, но только Flk1 + с-Kit + CD45- SP клетки давали несколько колоний линии преемственности через эндотелиальной монослоя промежуточного характеризуется как "булыжник "эндотелиальной морфология клеток (рис 4B, нижняя левая панель) и по поглощению Дил-AcLDL 12. Более того, экспрессия с-Kit необходим для кроветворной активности AGM SP 12 клеток.

В то время как это было показано, что некоторые миелоидные клетки-предшественники имеют сходные морфологические характеристики по сравнению с кроветворных эндотелиальных клеток, миелоидных клеток-предшественников выразить CD45 и не может генерировать несколько клональные колонии 12,23 и приводят к закругленными клеточных кластеров без основного эндотелиального монослоя (рис 4В, нижняя правая панель). Таким образом, население мы определяем как гемогенного эндотелий (или, Flk-1 + / с-Kit + / CD45-SP клетки) представляют собой эндотелиальные клетки с формированием экспрессии потенциал и надежный гена hematoendothelial крови, в том числе GATA-1/2, LMO2, SCL / ТАЛ-1, Runx-1, с-Kit, CD34, CD41, CD45 , и 11 , которые отличаются от гемопоэтических стволовых клеток и клеток - предшественников, а также их не-кроветворных эндотелиальных клеток аналогами.

Рисунок 1
Рисунок 1. В целом рабочий процесс. Вкратце, зародыши удаляются из беременных плотин, и YS или AGM ткани собирают. Эмбрионы могут быть необязательно культивируют в течение 2 4 - 48 ч ех естественных условиях до сбора ткани. Заготовленные Ю.С. или AGM ткани перевариваются в суспензии отдельных клеток, аликвоты в контрольных и пробирок, и инкубировали в присутствии красителя Hoechst и / или флуоресцентно-конъюгированных антител. Верапамил, ингибитор кальциевых каналов, также используется для создания отрицательного контроля, необходимой для проверки точного стробирования СП фракции. Гемогенного эндотелиальные клетки идентифицируются FACS, как Flk1 + / cKit + / CD45- SP клетки, в то время как HSPC содержатся в Flk1- / cKit + / CD45 + SP фракции клеток; оба типа клеток сортируются на метилцеллюлозы для подтверждения гемогенного потенциала. Кроме того, не гемогенного эндотелиальные клетки могут подвергаться дискриминации (и извлекается, если это необходимо) , как CD31 + / CD45- не-SP клетки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

igure 2 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54150 / 54150fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Препарирование YS и AGM ТКАНЕЙ. A) YS отсечен от E8.5 эмбрионов, и помещают в стерильную целое HBSS + для последующего пищеварения. B) Ствол E10.5 эмбрионов выделяют путем горизонтальных пореза ниже обеих передних конечностей и задних конечностей почек. AGM затем отделяют от зачатков конечностей и брюшных тканей с помощью пинцета. C) светлого поля изображения показывают рассечение обоих YS и AGM от E10.5 эмбриона (масштаб = 1 мм). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.

Рисунок 3
Рисунок 3. Представитель Графики Демонстрация Gate Иерархия для дискриминациииз кроветворных эндотелиальных клеток с (Flk1 + / cKit + / клеток CD45- SP), HSPC (Flk1- / cKit + / CD45 + SP клетки) и Non-кроветворных эндотелиальных клеток (CD31 + / CD45- без ИП) FACS из E8.5 Ю.С. или E10.5 AGM. После клеточного и дублетном дискриминации живой клетки либо из YS (левая панель) или AGM (справа панели) с помощью вперед и бокового рассеяния (не показан), а) боковой популяции (SP) ворота рисуется и проверены значительным уменьшением СП фракции в верапамила обработанного отрицательного контроля. Популяция не-СП определяется как плотного скопления клеток, прилегающих к SP. В каждой из представленных графиков отображаются 20000 событий б) не гемогенного эндотелиальные клетки идентифицируют как клетки CD31 + / CD45- внутри не-SP фракции, и представляют собой 2 -. 5% клеток не-SP ли полученные из ГОСА (показано ) или Ю.С. (не показан). Для discriрованные гемогенного EC или HSPC, С) дочерние ворота заимствованы из SP фракции для идентификации CD45 + и CD45- клеток. D) для идентификации кроветворных эндотелиальных клеток либо из AGM (показано) или Ю.С. (не показаны), дополнительные дочерние ворота рисуются от CD45- фракции отличить + (против cKit-) и Flk1 + (против Flk1-) клеток cKit. Гемогенного ЕС или от YS или ГОСА , как правило , ~ 1 - 3% от событий CD45- Е) HSPC идентифицированы из CD45 + фракции в качестве cKit + и Flk1-, и , как правило , составляют 20 -. 30% CD45 клеток + ли , отсортированных из ГОСА (показано ) или YS (не показан). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Visuaлизация кроветворных дифференциацию следующая Культура кроветворных эндотелиальных клеток и HSPC на метилцеллюлоза. A) Колонии формы из отсортированных отдельных клеток в течение 7 дней с момента посева на метилцеллюлозы. Multi-родословная гемопоэтических потенциал может быть подтверждена путем наблюдения нескольких гемопоэтических типов колоний, которые были определены оценки различны морфологии колонии 11. B) Фаза микроскопических изображений отсортированных гемогенного EC и HSPC от AGM (или YS, не показаны) показывают мульти-клонов кроветворной образование колоний после 7 дней культивирования в метилцеллюлозы культуральной среде. Номера кроветворный EC от ГОСА (или Ю.С., не показан) , не демонстрируют рост в этих условиях. При большем увеличении, прилипшие клетки с классической "булыжник" эндотелиальной морфологии клеток (белая стрелка) можно увидеть что приводит к кластерам гемопоэтических клеток в кульбенности гемогенного ЕС; нет таких эндотелиальные клетки не наблюдается в культурах отсортированного HSPC (масштаб = 100 мкм). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Там остается много нерешенных вопросов в области развития hematovascular - поле, которое все еще находится в зачаточном состоянии из-за технических трудностей, связанных с изучением клеточных популяций переходных и малых, которые возникают только в определенных окнах развития. Методы, описанные выше, улучшить многие из этих трудностей, позволяя для изоляции даже отдельных клеток от гемогенного эндотелиальных клеток и популяций HSPC в эмбриональных тканях в критические моменты времени развития с использованием реагентов и оборудования, которые обычно доступны в большинстве лабораторий. Наш протокол также позволяет параллельно изоляции не-кроветворных эндотелиальных клеточных фракциях от YS и ГОСА, которые могут быть использованы для независимого анализа, или в качестве средства управления для гемогенного фракции эндотелиальных клеток в последующих анализах.

Ключевым моментом в изоляции кроветворных эндотелиальных клеток с использованием этого многоцветного метода FACS на основе спектрального подходит коmpensation и точный рисунок одноцветных ворот. Таким образом, настоятельно рекомендуется, чтобы неокрашенными и одноцветные элементы управления были включены во все экспериментальных серий, и что они - вместе с образцами, обработанных изотипа антител управления - использоваться для первоначального установления надлежащего спектрального компенсации и чертеж ворот. Тем не менее, неспецифическое окрашивание минимальна этим протоколом, таким образом, неокрашенные и одноцветные элементы управления являются достаточными для рутинной проверки ворот сразу настройки сортировщика FACS были оптимизированы.

Неточно нарисованные SP ворота представляют собой особую озабоченность в связи с подходом, описанным в настоящем докладе. Предыдущие исследования показали , что мультипотентными стволовые клетки обладают преференциального оттоком Hoechst красный 17, образуя физиологическую основу для их появления в СП по FACS. Мы показали , что эндотелиальные клетки кроветворных и HSPC аналогичным образом найдены в пределах фракции SP клетки 5,11. Такие лекарства, как кальциевого канала вhibitor Верапамил блокировать этот Hoechst поведение оттоку краситель в SP клетках посредством закупорки различных транспортеров резистентности ко многим лекарственным трансмембранный. В гемопоэтических стволовых клеток и клеток - предшественников, это происходит в первую очередь через ABCG2 / BCRP1 транспортером 24. Обычно верапамил индуцирует> 50% блокированию SP, однако, общая степень Hoechst оттоком и его последующее засорение по верапамил видно было показано, что зависит от времени развития, предположительно из-за изменения экспрессии устойчивых к множественным лекарственно типов транспортеров с дифференциальным Hoechst отток способность и чувствительность к Верапамил 5. Таким образом, настоятельно рекомендуется, чтобы Верапамил обработанных Hoechst окрашенных отрицательный контроль быть Стандартно включены для обеспечения надлежащего SP гейтинг: если SP ворота правильно нарисовано, заметное сокращение числа SP клеток должны быть обнаружены в образцах, окрашенных Hoechst в наличие верапамил.

Ранее мы показали, что отсортированSP клетки из E9.5 мышиный желтка имеют ~ 80 - 90 раз больше , способность генерировать HSPC в метилцеллюлозы основе гемопоэтических культуры по сравнению с подобранного количества E9.5 нефракционированного, не Хехст окрашивают целые клетки ткани YS 5. Дальнейшая характеристика СП показал, что в мышиной желтка во время раннего кроветворной и развития сосудов на E8.0, есть заметное выражение VE-кадгерина и FLK-1, но низкая экспрессия стебля (с-Kit) и гемопоэтических маркеров (CD45). Таким образом, в этой временной точке развития, изначальная (не гемогенного) EC, определяемой как FLK-1 + / CD31 + господствуют / CD45- не SP клетки. Это выражение профиль сдвиги как выражение эндотелиальной маркер уменьшается и CD45 и с-Kit экспрессии увеличивается, одновременно с увеличением способности генерировать HSPC в пробирке между E9.5 и E11.5 5. Это говорит о том гемопоэтической активности Ю.С. ткани содержится в SP, становятся наиболее очевидными между E9.5 и E11.5 и occurrING через приурочено потери эндотелиальных характеристик и постепенного приобретения кроветворной способности. Таким образом , экспрессия множественной лекарственной резистентности переносчиков , которые приводят к SP фенотипа являются важным фенотипический маркер гемогенного эндотелий 5; на самом деле, не SP клеток из AGM не проявляют кроветворных потенциал 12. Таким образом, успешная изоляция SP через Hoechst окрашивания как YS и AGM гарантирует, что клетки будут сортироваться из гемопоэтических стволовых клеток отделение данной ткани, и последующим окрашиванием антител клеток в этой фракции позволит дискриминацию гемогенного (Flk -1 + / с-Kit + / CD45-) по сравнению с HSPC (Flk1- / с-Kit + / CD45 +) популяции 5,11,12. Кроме того, ранее было отмечено , что CD41 + клетки в SP из желтка и тканей AGM являются способными к образованию нескольких клонального колонии в метилцеллюлоза , основанной культуре 11,12. Определим гемогенного эндотелиальные клетки как Flk1 + с-Kit + CD45- SP клеткис помощью CD45 в качестве назначенного маркера гемопоэтической линии , а не CD41 с учетом нашего нахождения , что экспрессия Flk1 и CD45 практически взаимоисключающими 5,11. Это позволяет чистую изоляцию клеток в СП, которые имеют как эндотелиальные (Flk-1) и стволовых характеристики (с-Kit), необходимые для эндотелиальной к кроветворной перехода, но которые еще не претерпели эти изменения, как определено отсутствие CD45 в них клетки. Было бы полезно рассмотреть вопрос о суб-фракционирование населения HSPC, определяемый как Flk-1- / с-Kit + / CD45 + / SP клеток, в Csf1r + (ткань макрофаги) и Csf1r- (HSC) фракции, как недавно сообщил Гомес и его коллеги 25, поскольку это обеспечит более высокое разрешение истинного HSPC в сравнении популяций ткани макрофагов предшественников, но это не должно влиять на целостность гемогенного фракции эндотелиальных клеток , чья изоляция мы обозначили так как Csf1r является маркером макрофагами клеток - предшественников 26.

HemogENIC эндотелиальные клетки являются редкой субпопуляции в обоих YS и AGM (содержащей 1 - 3% эндотелиальных клеток), и, следовательно, одной из основных проблем в их исследовании недостаточно выход клеток для последующего применения. Этот протокол обычно приводит к 70-80% клеток, оставшихся жизнеспособными по времени сортировки и типичного гемогенного эндотелиальных клеток сорта из целого ряда тканей, полученных из нескольких эмбрионов может дать лишь несколько сотен клеток даже при оптимальных условиях только 10-20% восстановленных клеток, внедренных в метилцеллюлозы производство колоний. Чтобы максимизировать отсортированный количество клеток, настоятельно рекомендуется, чтобы исследователи предпринять шаги по обеспечению ткани и жизнеспособность клеток на каждом этапе процедуры: ткани должны быть быстро рассекают и объединяли, и образцы должны храниться на льду, когда это возможно. Образцы должны быть приготовлены свежие непосредственно перед FACS сортировки и рассортированы по сбору пробирки, содержащие высокое содержание в сыворотке крови, или непосредственно в метилцеллюлозы культуру, как описаноd выше. Если проблемы жизнеспособности сохраняются, сбор трубки могут также быть предварительно покрыты сывороткой для дальнейшего повышения выживаемости клеток отсортированный. Если кроветворный выход эндотелиальных клеток остается низким, костного мозга взрослого или коммерчески доступные флуорофором конъюгированные гранулы могут быть использованы для спектральной компенсации взамен эмбриональных тканей, полученных контрольных одноцветных объектов, описанных в настоящем документе. Если отсортированные клетки предназначены для культуры, гемогенного эндотелиальные клетки и HSPC должны быть отсортированы непосредственно в тканевых культур скважин. Если отсортированные клетки предназначены для ДНК или анализа экспрессии генов РНК-связанных, кроветворных и не-кроветворных эндотелиальных клеток и HSPC могут быть отсортированы непосредственно в пробирки, содержащие по сбору проб буфер для лизиса, чтобы минимизировать потерю клеток.

Изложенная методика позволяет успешно (и одновременно) изоляцию кроветворных и не-кроветворных эндотелиальных клеток, а также HSPC и зрелых клеток крови фракции из тех же самых эмбриональных тканей. Такой подход позволяет дальнейшее шпилькуу молекулярных основ критических переходов, которые происходят в эндотелиальные клетки вырабатывают кровь. Результатов, полученных в результате этих исследований в области развития могут быть использованы для оптимизации генерации кроветворных эндотелиальных клеток человека и HSPC потомстве из плюрипотентных, и потенциально аутологичной, стволовые клетки для лечения распространенных расстройств кроветворных.

Disclosures

Эта работа была поддержана byNIH грантов HL128064, HL096360, EB017103 и CT Инновации предоставляют 15-ПКМ-YALE-04, к KKH и NICHD / NIH T32HD007094.

Acknowledgments

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) Sigma D5942 TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling.
Absorbent bench underpad Covidien 7134
#5 Straight Forceps Fine Science Tools 11251-20
8.5 cm straight scissors Fine Science Tools 14090-09
Isoflurane (Isothesia) Henry Schein  50033 TOXIC inhalant: Use in fume hood.
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000 U/ml Penicillin, 10,000 mg/ml Streptomycin, 29.2 mg/ml L-glutamine)  Invitrogen 10378016
Type II Collagenase Worthington LS004174
Falcon 70 μM nylon cell strainer Corning CLS431751
Anti-Mouse CD45-FITC eBioscience 11-0451-81
Anti-Mouse CD31 - PE eBioscience 12-0311-81
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 BD Pharmingen 561259
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) Sigma 14533 TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25 mg/ml in distilled H2O, store aliquots at -20 °C until ready for use.
Verapamil Hydrochloride Sigma 1711202  TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling.   Prepare stock solution of 5 mM (100x) in 95% ethanol.  Store at -20 °C until ready for use 
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235
MethoCult GF M3434 Stem Cell Technologies 3434 Thaw and aliquot per manufacturer's instructions
Modified Giemsa Stain Sigma GS500 TOXIC: Contains Methanol - use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution.
Cytospin Centrifuge Thermo Scientific A78300003
Clipped Funnel Starter Kit Thermo Scientific 3120110 Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge
Anti-Mouse B-220 - FITC BD Pharmingen 553088
Anti-Mouse Gr-1-FITC eBioscience 11-5931-85
Anti-Mouse Ter-119-FITC eBioscience 11-5921-85
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Scientific 10437-077
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5 g/L) Life Technologies  11965-092
Hank's Buffered Salt Solution Life Technologies  14175-095
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate EMD Millipore PIFB24P05
IgG2A-PE BD Pharmingen 553930
IgG2B-FITC BD Pharmingen 556923

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hirschi, K. K. Hemogenic endothelium during development and beyond. Blood. 119 (21), 4823-4827 (2012).
  2. Boisset, J. C., et al. et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464 (7285), 112-115 (2010).
  5. Nadin, B. M., Goodell, M. A., Hirschi, K. K. Phenotype and hematopoietic potential of side population cells throughout embryonic development. Blood. 102 (7), 2436-2443 (2003).
  6. Nakano, H., et al. Haemogenic endocardium contributes to transient definitive haematopoiesis. Nat Commun. 4, 1564 (2013).
  7. Li, Z., et al. Mouse embryonic head as a site for hematopoietic stem cell development. Cell Stem Cell. 11 (5), 663-675 (2012).
  8. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  9. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  10. de Bruijn, M. F., Speck, N. A., Peeters, M. C., Dzierzak, E. Definitive hematopoietic stem cells first develop within the major arterial regions of the mouse embryo. Embo J. 19 (11), 2465-2474 (2000).
  11. Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
  12. Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-Kit, Notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Dev Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
  13. Tavian, M., et al. Aorta-associated CD34+ hematopoietic cells in the early human embryo. Blood. 87 (1), 67-72 (1996).
  14. Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21 (1), 31-41 (2004).
  15. Kelly, M. A., Hirschi, K. K. Signaling Hierarchy Regulating Human Endothelial Cell Development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 718-724 (2009).
  16. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  17. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  18. Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), (2010).
  19. Bohnsack, B. L., Lai, L., Dolle, P., Hirschi, K. K. Signaling hierarchy downstream of retinoic acid that independently regulates vascular remodeling and endothelial cell proliferation. Genes Dev. 18 (11), 1345-1358 (2004).
  20. Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of the T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
  21. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  22. Kina, T., et al. The monoclonal antibody TER-119 recognizes a molecule associated with glycophorin A and specifically marks the late stages of murine erythroid lineage. British Journal of Haematology. 109 (2), 280-287 (2000).
  23. Jackson, K. A., et al. Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. J Clin Invest. 107 (11), 1395-1402 (2001).
  24. Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
  25. Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  26. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).

Tags

Биология развития выпуск 112 гемогенный эндотелий окончательное кроветворения развитие сосудов мышиные эмбрионы FACS гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники
Выделение мышиной эмбриональных кроветворных эндотелиальных клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fang, J. S., Gritz, E. C., Marcelo,… More

Fang, J. S., Gritz, E. C., Marcelo, K. L., Hirschi, K. K. Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (112), e54150, doi:10.3791/54150 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter