Summary
Hematopoietiska stam- och progenitorceller (HSPC) härrör från specialiserade (hemogenic) endotelceller under utveckling, men lite är känt om den process genom vilken en del endotelceller anger att bli blodbildande. Vi visar en flödescytometri baserad metod tillåter samtidig isolering av hemogenic endotelceller och HSPC från murina embryonala vävnader.
Abstract
Specifikationen av hemogenic endotelceller från embryonala kärlendotel sker under korta utvecklingsperioder inom olika vävnader, och är nödvändig för uppkomsten av slutgiltiga HSPC från mus extra embryonala gulesäcken, placenta, navel fartyg och embryonala aorta-gonad-mesonephros ( AGM) regionen. Den övergående natur och små storleken på denna cellpopulation gör sin reproducerbar isolering för noggrann kvantifiering och experimentella applikationer tekniskt svårt. Vi har etablerat en fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) -baserad protokoll för samtidig isolering av hemogenic endotelceller och HSPC under sin topp generationstider i gulesäcken och årsstämma. Vi visar metoder för dissektion av gulesäcken och AGM vävnader från musembryon, och vi presenterar optimerade vävnad matsmältningen och antikroppkonjugering förutsättningar för maximal cellöverlevnad före identifiering och hämtning via FACS. Representativa FACS analys tomter visat att identifiera hemogenic endotelceller och HSPC fenotyper, och beskriva en metylcellulosa-baserad analys för att utvärdera deras blodbildande potential på en klonal nivå.
Introduction
Ett funktionellt cirkulationssystemet kräver en parallell utveckling av blodkärl och blodceller. Vid de tidigaste stadierna av utveckling blod (primitiva blodbildningen), förblir ursprung erytroblaster kraftigt diskuteras en. I motsats, i senare skeden av blodkroppar utveckling (definitiv hematopoes), har det blivit allt tydligare att flera härstamning HSPC uppstå från specialiserade vaskulära endotelceller som förvärvar blodbildande potential (hemogenic endotelceller) i gulesäcken, placenta och AGM 2-5, liksom i vitelline och navel fartyg, embryonala endokardiet 6, och huvud kärl 7. Specifikationen av hemogenic endotelceller inom dessa olika vävnader sker vid specifika utvecklingsstadier; till exempel inom gulesäcken vid ~ E8.25 och inom bolaget under ~ E10 8-12. Men även under dessa särskilda utvecklings fönster, befolkningen i hemogenic Endothelial celler utgör en liten andel av alla endotelceller (1 - 3% av gulesäcken och AGM endotelceller) 11,12. Processen för hemogenic endotelceller "specifikation" är avgörande för mus, liksom människa, blodbildningen. Hematopoietiska celler har visat sig knoppas från endotelet i gulesäcken fartyg och aorta i humana embryon 13, och flera laboratorier har visat att blodkroppar från humana pluripotenta stamceller kräver en endotelcell intermediär 14-16. Sålunda definierar fenotypen av murina hemogenic endotelceller och förstå de molekylära händelser som leder till deras utveckling i denna djurmodell bör underlätta utövandet av in vitro-tekniker för generering av hemogenic endotelceller från humana pluripotenta stamceller. I sin tur, en eventuell utveckling av en metod för storskalig produktion av differentierade blodcelltyper från flera härstamning HSPC - själva Derived från humana pluripotenta stamceller via en fysiologiskt relevant hemogenic endotelceller mellan - skulle ha otrolig terapeutisk potential för hematologiska, onkologiska och regenerativ medicin. Mot detta mål har vi definierat fenotypen av hemogenic endotelceller, på en klon nivå, inom den murina gulesäcken 11 och AGM 12, två viktiga platser för slutgiltig HSPC produktion under embryogenes. Liknande HSPC inom vuxen benmärg 17, embryonala hemogenic endotelceller och HSPC uppvisar Hoechst färgämne utflödes egenskaper och därför visas inom "sida befolkningen" (SP) av celler på en FACS plot 5,11,12 (såsom visas i figur 3). Dessutom har vi också visat att hemogenic endotelceller uttrycker markörer av både endoteliala och stamceller (Flk1 och ckit, respektive), men uttrycker inte den hematopoetiska härstamningen markör, CD45 5,11,12. Således kan hemogenic endotelceller vara identified och isoleras genom FACS såsom Flk1 + / ckit + / CD45- SP-celler, och vi har visat att dessa celler ger upphov till HSPC som finns i Flk1- / ckit + / CD45 + SP fraktion av gulesäcken och AGM-celler 5,11,12. Hemogenic endotelceller och HSPC kan identifieras och isoleras från gulesäcken eller AGM vävnader skördas från antingen nyligen euthanized embryon, eller från embryon odlade i upp till 48 timmar i ex vivo embryoodling (såsom visas i figur 1). Ex vivo kultur tillåter selektiv förbehandling av individuella embryon med farmakologiska medel, och tillåter också för övergående uttryck av önskade transgener (dvs genom lentivirala transduktion). FACS identifiering av hemogenic endotelceller och HSPC genom metoden beskriven häri kan användas som ett kvantitativt mått på definitiv hematopoetisk utveckling i genetiskt manipulerade musmodeller; cellerna kan även hämtas för efterföljande experimentella applikationer, inklusive blod-forming analyser, expressionsanalys, och transplantation.
Djur Ämnen: Använder och etiska överväganden
En växande mängd litteratur har etablerat viktiga bidrag hemogenic endotelceller till HSPC formation under slutgiltiga hematopoies skede av embryonal utveckling. Ändå förblir fysiologiska förhållanden och signaler som främjar specificering av en subpopulation av endotelceller mot en hemogenic öde dåligt förstått, och därför ännu inte kan efterliknas i en miljö in vitro. Faktum är att de tekniker som beskrivs i detta dokument finns för närvarande används av vårt labb och andra grupper för att förbättra fältets förståelse för hematovascular utveckling, så att en strategi för ex vivo hemogenic endotelceller specifikation och HSPC produktion skulle en dag kunna utvecklas. Fram till dess, men fältet är fortfarande beroende av primära vävnader från vild-typ (och genentiskt modifierade) musembryon för att erhålla specificerad hemogenic endotelceller och HSPC för vidare studier. Hemogenic endotelceller och HSPC tillförlitligt kan identifieras och isoleras från antingen E8.5 (10 - 12 somit par) gulesäcken eller E10.5 (35 - 40 somit par) årsstämma 11,12. På grund av den relativa bristen på hemogenic endotelceller (typiskt representerar 1-3% av den totala endotelceller 11,12 inom dessa vävnader) gemensamt utnyttjande av vävnader från flera (~ 8 - 10) kullsyskon till ett enda prov rekommenderas för att erhålla tillräckliga celler för efterföljande experimentering. Verifiering av att hemogenic endotelceller och HSPC har framgångsrikt identifierats och isolerats kan åstadkommas genom odling av återvunna celler under förhållanden som inducerar hematopoetisk differentiering. Under dessa betingelser, kommer hemogenic endotelceller och HSPC uppvisar flera härstamning hematopoetisk differentiering, vilket resulterar i uppkomsten av kolonier innehållande erythroid progenitorceller (BFU-E), granulocyt och makrofager föregångare (CFU-GM), och granulocyt, erytrocyt, makrofager, megakaryocyter gångar kolonier (CFU-GEMM).
Protocol
Etik uttalande: Protokollet som beskrivs nedan har granskats av, och är i överensstämmelse med de riktlinjer, Yale University Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Hela Embryo Ex V ivo Kultur för gulesäcken Studies (tillval)
- Avliva gravida dammar vid E7.0 - E7.5, och ta bort livmoderhornen under sterila betingelser, såsom beskrivs i större detalj nedan (steg 2,4-2,7).
- Separata hela embryon (med gulesäcken intakt 12) från omgivande decidua och suspendera i 50 ml hel råttserum i 50 ml polystyrenrör.
- Gas embryo flaskor för 3 min med 5% CO2 omedelbart som tidigare beskrivits 12,18. Upprepa detta steg på 24 timmar om odling embryon för 24 - 48 timmar.
- Inkubera i rullande 37 ° C kultur under upp till 48 timmar.
Obs: Embryon kan behandlas ex vivo med farmakologiska medel (dvs DAP Notch-hämmare.T 12) eller lösliga proteiner (dvs., fibronektin 19) genom förinkubering av embryon för upp till 2 timmar i odlingsmedium som innehåller sådana faktorer, eller genom tillsats av dessa faktorer till valsodlingsmediet för hela längden av den ex vivo kultur period. Genuttryck kan manipuleras i embryon genom förinkubering av embryon med optimalt titrerade lentivirus under 2 timmar 12. Gulesäcken kärl- och hematopoetisk utveckling kan följas i realtid med hjälp av transgena reporter möss och optiska avbildningstekniker.
2. Dissekering av gulesäcken (YS) eller Aorta-gonad-mesonephros (AGM) från musembryon
- Sterilisera laboratoriebänk genom att spraya och torka ned alla ytor med 70% etanol för att minska föroreningar i efterföljande cellkulturer. Placera ett absorberande underlägg på lab bänk yta.
- Sterilisera kirurgiska instrument med 70% etanol. Rekommenderade kirurgiska instrument är två # 5 raka kraftps, och en 8,5 cm raka sax.
- Om man arbetar med embryon från ex vivo kultur, försiktigt bort hela embryon från 50 ml Falcon rör och fortsätt omedelbart till steg 2,8. Annars hoppa över detta steg och gå vidare till steg 2,4.
- Avliva gravid dammen vid lämplig embryonal ålder (E8.5 om avverknings YS, E10.5 om skörd AGM).
Obs: Den beskrivna tekniken utnyttjar en dual-metod dödshjälp strategi - dödlig dos av en flyktig bedövningsmedel, följt av mekanisk halsdislokation - för att minimera djurens smärta och ångest, och för att säkerställa minimalt invasiva och human uppsägning av djur. Detta i kombination teknik för små gnagare dödshjälp rekommenderas av American Veterinary Medical Association när de utförs av en utbildad och kunnig utredare (AVMA riktlinjer för avlivning av djur: 2013 Edition).- Söva musen med användning av en letal dos av isofluran (> 5% i O 2) 3 - 5 min. (CAUTION: Isofluran är en giftig inhalant; användning under dragskåp med lämplig andnings personlig skyddsutrustning.)
- Efter exponering av möss för isofluran, ta åtminstone tre tecken på anestesinivå - förlust av rätande reflex, förlust av tå nypa reflex, och minskning av andningsfrekvens - för att säkerställa försökspersoner har uppnått en djup bedövningsmedel plan innan man går vidare med mekanisk dödshjälp.
- Cervically rubba dammen för att snabbt framkalla död.
- Placera avlivas dammen liggande på underlägg och frikostigt spraya nedre delen av buken med 70% etanol.
- Göra ett vertikalt snitt längs mittlinjen av den nedre bukväggen. Gör ytterligare ~ 1 tum horisontella snitt som sträcker sig till höger och vänster från mittpunkten av den vertikala snitt, och dissekera bort bukväggen till fullo exponera höger och vänster livmoderhornen var och en innehåller flera dräktiga embryon.
- Använd pincett, hålla en av de två livmoderhornenoch använda sax för att skilja den från mesometrium. Placera dissekerade livmodern på is i sterilt Hanks balanserade saltlösning (HBSS) i en 60 mm polystyren vävnadskulturplatta. Upprepa för andra livmoderhornet.
- Under en vanlig ljus dissektionsmikroskop, använder pincett för att dra bort muskelskikt livmoder sac att avslöja den underliggande fostersäcken och decidua. Isolera YS (Figur 2A) genom att försiktigt avlägsna sac från medföljande embryot. Ta YS vävnad från embryo korrekt på embryonala ursprung vitelline fartyg.
- För att isolera årsstämman bort YS och transekt embryot under nivån för hjärtat och framben och kassera bröstkorgen och huvudet regionen. Nästa, transekt embryot strax under nivån för bakbenen och ta bort och kasta svansen vävnad. Avlägsna bakbenen och överskott av ventrala vävnad från den återstående delen, som innehåller AGM (Figur 2B).
- Pool YS eller AGM vävnader från flera embryon och lagrapå is i HBSS + (HBSS supplementerat med 10% (volym / volym) fetalt bovint serum och 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, och 0,3 mg / ml L-glutamin) i ett rent 1,5 ml rör.
3. Nedbrytning av primär vävnad i en enda cell Suspension
- Centrifugrör innehållande skördade YS eller AGM vävnader under 5 min vid 2000 xg vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera vävnad i 1 ml av antingen 0,05% (för YS) eller 0,2% (för AGM) kollagenas typ II utspäddes i HBSS +. Inkubera i 30 minuter i vattenbad vid 37 ° C, inverterande röret var 5 minuter för att blanda.
- Försiktigt mekaniskt dissociera vävnad genom att prov 10 gånger genom en P1000 pipett. Om de har svårt att aspirera delvis smält vävnad, kan pipettspetsen hålet vidgas genom att skära av ~ 5 mm spets med en sax.
- Centrifugera provet under 5 minuter vid 2000 xg vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera i 1 ml iskall HBSS +.
- Passera provet genom en 70 &# 956; m cellfilter.
- Räkna celler med hjälp av en manuell eller automatiserad hemocytometer.
- Centrifugera provet under 5 minuter vid 2000 xg vid 4 ° C. Återsuspendera provet i DMEM + (4,5 g / L glukos Dulbeccos Modified Eagle Medium tillsatt med 10% (volym / volym) fetalt bovint serum och 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, och 0,3 mg / ml L-glutamin) pre- värmdes till 37 ° C, så att cellerna är vid en slutlig koncentration av 1 x 10 6 celler / ml.
4. Behandling av celler med nukleinsyra Dye och märkning med fluorescerande konjugerade antikroppar
- Alikvot minst 100 ul av provet (1 x 10 5 celler) till färska 1,5 ml rör för antikropp inkubation.
- Inkludera följande exempel och nödvändiga styrrören: Obehandlat; ckit-APC enbart; CD45-FITC endast; CD31-PE endast; Flk1-PECy7 endast; Hoechst 33342 endast; Hoechst 33342 endast + Verapamil; Prov (tar emot alla färger, inte kommer att få Verapamil). Använd minst 1 x 10
- Lägg Verapamil utspädd i 95% etanol (se diskussion för logiska grunden) till "Hoechst 33342 endast + Verapamil" kontrollrör till en slutlig koncentration av 50 ^ M. Inkubera alla rör i 5 minuter vid 37 ° C. (OBS: Verapamil är en potent kalciumkanalblockerande medel och är extremt giftigt Handtag med handskar.).
- Lägga Hoechst 33342 till "Hoechst 33342 enda" kontroll, till Hoechst 33342 endast + Verapamil kontroll, och till "Sample" rör till en slutlig koncentration av 5 | ig / ml. Inkubera alla rör under 1 timme vid 37 ° C, skyddat från ljus. Blanda försiktigt genom att vända varje 15 min. (OBS: Hoechst 33342 är en giftig kärn färgämne och bör hanteras med handskar).
- Centrifugera alla samples under 5 min vid 2000 xg vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelletar i en koncentration av 1 x 10 5 celler / ml i kall HBSS +.
- Lägga fluorescerande konjugerade antikroppar mot lämpliga antikropps endast kontrollrör, och till "Sample" rör till en slutlig koncentration av 2 | ig / ml. Inkubera på is i 30 minuter, skyddade från ljus.
- Centrifugera alla rören under 5 min vid 2000 xg vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten i 500 ul iskall HBSS. Strain prover genom maskfilterlocket av 5 ml rundbottnad polystyren FACS rör och lagra på is, skyddas från ljus, för omedelbara FACS.
5. Identifiering och isolering av Hemogenic endotelceller och HSPC genom FACS
Obs: Detta protokoll har optimerats med hjälp av en BD FACSAria 5-lasersystem utrustat med en 100 MW 355 nm UV-laser, en 200 MW 405 nm Violet laser, en 200 MW 488 nm blå laser, en 200 MW 532 nm grön laser, och en 150 mw 637 nm Rödlaser. Cellerna sorteras i steril PBS som omslutande vätska och under aseptiska förhållanden, och genom en 100 um munstycke med flödeshastighet inställd på en provtrycket ett sådant sätt att maximalt 1500 - 2000 händelser förvärvas per sekund för att minimera cellstress.
- Under dessa inställningar som beskrivs ovan, använder "Ofärgade" och enkla färgkontroll rör för att optimera FACS cellsorterare laserintensitet och utföra flerfärgade spektral ersättning kontroll enligt tillverkarens anvisningar. Använd framåt och sidospridning för att utföra levande cell och doublet diskriminering totala händelser (se tillverkarens instruktioner för mer information).
Obs: Detta protokoll resulterar vanligtvis i ~ 70-80% levande celler. Om problem uppstår med låg cellviabilitet, se till att vävnader initialt dissekeras snabbt i iskall media, och att alla steg utom de som anger annars utförs på is, med försiktig pipettering för att minimera skjuvning och celldöd(Se diskussion för mer detaljerat på att bevara cellviabilitet). - Använd en differential linjär skala tomt på Hoechst Red vs Hoechst blå fluorescens för att identifiera sido befolkning (SP) händelser (Figur 3A). Använd "Hoechst 33342 endast + Verapamil" kontroll som en negativ kontroll för att verifiera att portarna är korrekt dras för provet. SP kommer att visas som en ansats till vänster av de icke-SP-celler, och kommer att sänkas i Verapamil-behandlad kontroll. Den icke-SP befolkningen kommer att användas för att identifiera icke-hemogenic EG (Figur 3B).
- Skapa ytterligare differential fluorescens tomter (log-skala axlar) och dra dotter grindar av SP för att identifiera hemogenic endotelceller (Figur 3C-E).
Obs: Hemogenic endotelceller är profilerade som Flk1 + / ckit + / CD45- SP-celler (Figur 3D), och HSPC är Flk1- / ckit + / CD45 + SP-celler (figur 3E). Hemogenic endotelial calnar kan analyseras parallellt med icke-hemogenic endotelceller, som preciseras i denna strategi som CD31 + / CD45- icke-SP-celler (figur 3B). - Hämta hemogenic endotelceller eller HSPC fraktion på metylcellulosa innehållande plattor för hematopoetisk kultur (se nedan), eller i andra buffertar för efterföljande bearbetning och analys.
6. hematopoetisk differentiering i kultur
- Tillsätt 0,5 ml (135 | j, l / cm 2) metylcellulosa baserade hematopoietisk odlingsmedia till önskat antal brunnar i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta vid rumstemperatur. Tillsätt 0,5 ml sterilt vatten i oanvända brunnar för att minimera avdunstning. Framställ färsk och hålla vid rumstemperatur fram till användning.
- Sortering 1 - 10 celler för klonal analys, eller upp till 1.000 hemogenic endotelceller (Flk1 + / ckit + / CD45- SP-celler) eller HSPC (Flk1- / ckit + / CD45 + SP-celler) för bulk expansion och differentiering direkt i varje brunn iplatta innehållande metylcellulosa. Kolonibildning detekteras i cirka 10 - 20%.
- I en steril vävnadsodling huva, använda en P1000 spets med spetsen trimmas för att bredda sin borrning, försiktigt resuspendera varje brunn av de sådda metylcellulosa media 2 - 3 gånger, var noga med att undvika skapandet av bubblor. Detta säkerställer suspension av de sorterade cellerna i halvfast metylcellulosa för optimal tillväxt.
- Inkubera plattan vid 37 ° C med 5% CO2 i upp till 2 veckor.
- Övervaka enskilda cellkulturer för bildning av differentierade hematopoietiska cellkolonier över tiden (Figur 4). Betyg brunnar för antal och typ av differentierade hematopoietiska kolonier på dag 1, 3, 7 och 14 genom metod (er) beskrivs nedan i steg 6,7.
- Betyg plattor på dag 1 för att bekräfta konfluens och fortsatt livskraft sorterade celler.
- På dagen tre, kontrollera för tidig bildning av vidhäftande hemogenic endotelceller cellkolonier med "kullerstenton "morfologi (se Goldie et al. 11 och Marcelo et al. 12 för representation av dag tre morfologi).
- Genom dagar 5 - 7, kontrollera bildandet av rundade HSPC kluster i brunnar innehållande sorterade hemogenic EG. HSPC bör observeras i anslutning till tillplattade hemogenic EG visar en "gatsten" endotelceller morfologi.
Obs: Hemogenic endotelceller bör utgöra hematopoetiska kolonier (bestäms av hematopoetisk koloniantal), och bör visa flera härstamning differentiering kapacitet (bestämd genom observation av flera kolonityper från en enda cell). Vi har tidigare konstaterat att ~ 20% av hemogenic EG eller HSPC hämtas av FACS överleva för att bilda differentierande och sprider hematopoietiska kolonier i metylcellulosa 11.
- För att bedöma kolonibildning genom fas mikroskopi:
- Visualisera och räkna kolonier vid låg förstoring under en fas ljusmikroskop, och identifiera BFU-E, CFU-GM och CFU-GEMM-kolonier genom koloni-morfologi, såsom beskrivits av Goldie et al. 11.
- För att bedöma kolonibildning genom cellmorfologi:
- Aspirera individuella kolonier från metylcellulosa yta i en P1000 spets med slutet trimmas för att vidga hålet. Detta underlättar uppsugning av trögflytande metylcellulosa medium och säkerställer lyckad hämtning av kolonin.
- Resuspendera plockade kolonier i 200 ml HBSS och snurra på en glasskiva med hjälp av en cytocentrifug vid 28 xg under 5 minuter.
- Fix bilder i 100% metanol under 5 minuter (OBS: Metanol är giftig och bör endast användas i en kemisk huva med lämplig ventilation och personlig skyddsutrustning).
- Sänk glasen i 0,04% Giemsa fläcken under 20 minuter (OBS:. Giemsa stain innehåller metanol Användning i en kemisk huva med lämplig ventilation personal skyddsutrustning).
- Skölj objektglasen i avjoniserat vatten.
- Mount glider med täck och bild med hög förstoring under ett standardljusmikroskop, jämföra cellmorfologi som klassiskt observerats i hematopoetiska celler från vuxna benmärgen som odlas i metylcellulosa media. För exempel, se tillverkarens instruktioner.
- För att bedöma kolonibildning genom celluttryck av hematopoietiska härstamningsmarkörer genom FACS:
- Tillsätt 2 ml HBSS till varje brunn i en 24-brunnars platta innehållande kolonier odlade på 0,5 ml metylcellulosa (dvs utspädd kommersiellt tillgänglig lager metylcellulosa 1: 4). Pipettera upp och ned för att blanda, och transport till nytt rör (er).
- Centrifugera provet vid 2000 xg under 5 min vid 4 ° C med användning av en standard bordsmikrocentrifug.
- Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten (s) i en ml HBSS +, samla prover om så önskas.
- centrifugeGE provet vid 2000 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten (er) i 400 | j, l HBSS +.
- Alikvot i fyra 1,5 ml rör enligt följande: Obehandlat; B220-FITC endast; GR-1-FITC endast; Ter119-FITC bara.
- Lägga fluorescerande-konjugerad antikropp till lämpligt rör till en slutlig koncentration av 2 | ig / ml. Inkubera vid 37 ° C under 15 min.
- Centrifugera provet vid 2000 xg under 5 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten i iskall 0,5 ml HBSS.
- Analysera varje prov genom FACS för uttryck av varje hematopoetisk härstamning markör: B220 markerar B-celler 20; GR-1 märken myeloidceller 21; Ter119 markerar erytroida celler 22.
Obs: Ytterligare antikroppar riktade mot andra hematopoetisk härstamning markörer kan införlivas i denna strategi, om så önskas.
Representative Results
Framgångsrik märkning av hemogenic endotelceller och HSPC från embryonala YS eller AGM kommer att ge FACS spridningsdiagram som liknar de representativa kurvor som presenteras i Figur 3. Följande standard levande cell och dublett diskriminering genom framåt- och sidospridning (ej visad), sido population (SP) händelser visualiseras i en linjär Hoechst Red vs Hoechst Blå differential tomt i frånvaro av Verapamil som en "skuldra" vänster skiftat från majoriteten av (icke-SP) händelser (Figur 3A). När SP grinden är korrekt utformat kommer SP-celler utgör cirka 1-3% av den totala livskraftiga YS celler och 3-5% av den totala livskraftiga AGM händelser. Verapamil behandling bör resultera i> 50% hämning av SP händelser oberoende av vävnadskälla (figur 3A, toppaneler). Vi har tidigare konstaterat att andra populationer som visas utanför SP axeln men är också blockerade av verapamil är Ter119-positiva erythroblaster och omfattas därför inte av vår SP befolkning 5.
Jämfört med SP, är icke-SP-celler identifierades som den täta kluster av celler intill SP "axeln" (figur 3A). Denna population innehåller icke-Hemogenic EG som kan urskiljas med hjälp av en CD31-PE mot CD45-FITC dotter plot (Figur 3B), som CD31 + / CD45- händelser. Icke-Hemogenic EG är vanligtvis 2 - 5% av icke-SP-celler från AGM (figur 3B) eller gulesäck (ej visad), och höga antal av dessa celler kan sorteras tillbaka med relativ lätthet.
För identifiering av HSPC och Hemogenic EG är dotter grindar dras från SP-fraktionen, identifiera CD45 + och CD45- celler där CD45 + celler typiskt är <20% av totala händelser i både AGM (figur 3C) eller YS (ej visad). Hemogenic EG därefter identifieras från CD45- celler i en differential ckit-APC mot Flk1-PECy7 dotter pmycket som dubbelpositiva evenemangen och representerar typiskt 1 - 3% av CD45- händelser när den isoleras från antingen AGM (fig 3 D) eller YS (ej visad). HSPC identifieras från CD45 + fraktionen i en separat ckit-APC mot Flk1-PECy7 dotter tomt som Flk1- / ckit + celler, och även vanligtvis utgör cirka 25-30% av den lilla populationen av CD45 + celler när det erhållits från antingen YS (ej visat) eller AGM (figur 3 E). Således, både Hemogenic EG och HSPC är exceptionellt sällsynta (~ 0,01% av den totala cellhändelser), och det är typiskt för detta protokoll för att returnera ett par hundra av varje celltyp även när vävnad från flera embryon samman. Gates i dotter tomter bör fastställas med hänvisning till negativa kontrollgrupper. För att skilja mellan specifik och icke-specifik antikropp färgning, bör grindar initialt dras med hänvisning till både Ofärgade kontroller (Figur 3C), liksom prover som har behandlats med fluorescerande-konjugerade isotyp-matchad (IgG2A eller IgG2b) kontrollantikroppar (ej visad). Denna senare kontroll har visat att icke-specifik färgning är minimal i detta protokoll, därför medan vi rekommenderar att isotypmatchad kontrollantikroppar (t ex., IgG2a-PE eller IgG2b-FITC) initialt användas för att optimera FACS sorteringsinställningar och bestämma gate gränser finner vi också att ofärgade kontrollerna är tillräckliga för att kontrollera grind gränser och experimentell kvalitet under rutin FACS sortering. Om portar är korrekt utformat bör observeras minimal positiv spridning i enkel- eller dubbel positiva grindar vid inspelning från ofärgade eller isotyp-matchade kontroller.
Hemogenic endotelceller från årsstämman och HSPC genomgår hematopoetisk differentiering under 14 dagar av kultur i metylcellulosa (Figur 4A). Den relativa andelen av kolonityper typiskt observeras i dessakulturer är beroende av vävnadskälla. Hemogenic endotelceller isolerade från gulesäcken vävnader vid E8.5-E9.5 ger upphov till BFU-E, CFU-GM, och få CFU-GEMM 5, medan hemogenic endotelceller som isolerats från E10.5 årsstämman ger upphov till övervägande CFU -GEMM 12, även om andra linjer fortfarande observeras, såsom visas i figur 4B (överst till vänster). HSPC isolerats från E10.5 AGM också ge upphov till övervägande del till CFU-GEMM på kultur i metylcellulosa (Figur 4B, övre mellersta panelen), även om dessa celler kommer också att differentiera till andra typer hematopoetisk koloni också. Icke-hemogenic endotelceller (CD31 + / CD45- icke-SP) har också pläterade (Figur 4B, övre högra panelen). Dessa celler visar ingen tillväxt i hematopoetisk kultur efter 14 dagar.
Analyser av hematopoetiska kapacitet på individuell ytmarkör uttryckande celltyper, inklusive celler med och utan uttryckning av hematopoetisk ennd endotelceller markörer CD31, Flk1, c-Kit, VE-cad, CD41 och CD45 inom SP bråkdel av årsstämman på E10.5 har utförts och visar att flera härstamning kolonibildande aktivitet i E10.5 AGM är begränsad till CD31 +, VE-cadherin +, c-Kit +, CD41 + och CD45 + SP cellerna 12. Intressant nog kolonibildande aktivitet noterades i både Flk-1 + och Flk-1 SP-celler, men bara Flk1 + c-Kit + CD45- SP celler gav upphov till flera härstamning kolonier via en endothelial monolager mellankännetecknas av både "kullersten "endotelceller morfologi (Figur 4B, nedre vänstra panelen) och Dil-AcLDL upptag 12. Dessutom är det nödvändigt för hematopoietisk aktivitet hos AGM SP cellerna 12 expression av c-Kit.
Även om det har visat sig att vissa myeloida stamceller har liknande morfologiska egenskaper vid jämförelse med hemogenic endotelceller, myeloida progenitorceller uttrycker CD45 och kan inte generera flera härstamning kolonier
Figur 1. Totalt Workflow. I korthet är embryon avlägsnas från gravida dammar, och YS eller AGM vävnader skördas. Embryon kan eventuellt odlas för två 4-48 h ex vivo före vävnads skörd. Skördade YS eller AGM vävnader digereras till en enda cellsuspension, alikvoterades in i kontroll- och provrören, och inkuberades i närvaro av Hoechst färgämne och / eller fluorescerande-konjugerade antikroppar. Verapamil, en kalciumkanalhämmare, används också för att alstra en negativ kontroll nödvändig för verifiering av korrekt grindning av SP-fraktionen. Hemogenic endoteliala celler identifieras genom FACS som Flk1 + / ckit + / CD45- SP-celler, medan HSPC finns inuti Flk1- / ckit + / CD45 + SP fraktion av celler; båda celltyperna sorteras på metylcellulosa för att bekräfta hemogenic potential. Dessutom kan icke-hemogenic endotelceller diskrimineras (och hämtas, om så önskas) som CD31 + / CD45- icke-SP-celler. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
igure 2 "src =" / filer / ftp_upload / 54150 / 54150fig2.jpg "/>
Figur 2. Dissekering av YS och AGM vävnader. A) YS dissekeras bort från E8.5 embryon och placerades hela i steril HBSS + för efterföljande nedbrytning. B) Stammen av E10.5 embryon isoleras genom att göra horisontella nedskärningar under både forelimb och bakbenen knoppar. Stämman separeras sedan från lem knoppar och ventrala vävnad med pincett. C) ljusfält bilder visar dissektion av både YS och AGM från en E10.5 embryo (skala = 1 mm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa Tomter Demonstration Gate hierarki för diskrimineringav Hemogenic Endothelial Cell s (Flk1 + / ckit + / CD45- SP-celler), HSPC (Flk1- / ckit + / CD45 + SP-celler), och icke-hemogenic endotelceller (CD31 + / CD45- icke-SP) genom FACS från E8.5 YS eller E10.5 AGM. efter levande cell och dubb diskriminering av celler från antingen YS (vänster paneler) eller AGM (höger sida) genom framåt- och sidospridning (ej visad), A) sido befolkningen (SP) grind dras och kontrolleras av en betydande minskning av SP-fraktionen i Verapamil-behandlade negativ kontroll. Den icke-SP population identifieras som den täta kluster av celler intill den SP. I vart och ett av de presenterade tomterna 20.000 händelser visas B) Icke-hemogenic endotelceller identifieras som CD31 + / CD45- celler i icke-SP-fraktionen, och representerar två -. 5% av icke-SP celler, även erhållits från årsstämman (visas ) eller YS (ej visad). att discriminate Hemogenic EG eller HSPC, C) dotter grindar är hämtade från SP-fraktionen för att identifiera CD45 + och CD45- celler. D) För identifiering av hemogenic endotelceller från antingen AGM (visat) eller YS (ej visad), är ytterligare dotter grindar dras från CD45- fraktionen att skilja ckit + (vs cKit-) och Flk1 + (vs. Flk1-) celler. Hemogenic EG antingen YS eller AGM är typiskt ~ 1-3% av CD45- händelser E) HSPC identifieras från CD45 + fraktion som ckit + och Flk1-, och representerar vanligtvis 20 -. 30% av CD45 + celler, även sorterade från årsstämman (visas ) eller YS (ej visad). klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. videoasering av hematopoetiska differentiering efter kultur Hemogenic endotelceller och HSPC på Metylcellulosa. A) Kolonier form från sorterade enskilda celler inom 7 dagar efter plätering på metylcellulosa. Multi-härstamning hematopoetisk potential kan bekräftas genom observation av flera hematopoietiska kolonityper, som identifierats av bedömning av distinkta kolonimorfologier 11. B) Fas mikroskopisk avbildning av sorterade hemogenic EG och HSPC från årsstämman (eller YS, ej visad) visar flera härstamning hematopoetisk kolonibildning efter 7 dagars odling i metylcellulosa odlingsmedium. Icke-hemogenic EG AGM (eller YS, ej visad) inte visar tillväxt under dessa förhållanden. Vid högre förstoring, kan vidhäftande celler med klassisk "kullersten" endotelceller morfologi (vit pil) ses som ger upphov till kluster av hematopoetiska celler i Culrer av hemogenic EG; inga sådana endotelceller observeras i odlingar av sorterade HSPC (skala = 100 nm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det finns fortfarande många obesvarade frågor när det gäller hematovascular utveckling - ett område som fortfarande är i sin linda på grund av de tekniska svårigheterna att studera övergående och små cellpopulationer som uppstår endast under särskilda utvecklings fönster. De tekniker som beskrivs ovan lindra många av dessa svårigheter genom att medge isolering av även enstaka celler från hemogenic endotelceller och HSPC populationer i embryonala vävnader vid kritiska utvecklings tidpunkter med användning av reagens och utrustning som normalt finns i de flesta laboratorier. Våra protokoll möjliggör också parallell isolering av icke-hemogenic endotelceller cellfraktioner från YS och AGM, som kan användas för oberoende analyser eller som kontroller för hemogenic endotelceller fraktionen i efterföljande analyser.
En viktig punkt i isolering av hemogenic endotelceller med hjälp av denna multi FACS-baserad metod är lämplig spektral compensation och exakt ritning av enfärgade grindar. Som sådan, är det starkt rekommenderat att ofärgade och enfärgade kontroller ingå i alla experimentella försök, och att de - tillsammans med prover som behandlats med isotyp-matchade kontrollantikroppar - användas för att initialt fastställa korrekt spektral ersättning och ritning av grindar. Emellertid är icke-specifik färgning minimal i detta protokoll, alltså ofärgade och enfärgade kontroller är tillräckliga för rutinkontroll av grindar gång FACS sorteringsinställningar har optimerats.
Felaktigt dragna SP grindar är ett särskilt bekymmer med det tillvägagångssätt som beskrivs i denna rapport. Tidigare studier har visat att multipotenta stamceller uppvisar förmånliga utflöde av Hoechst röd 17, som bildar den fysiologiska grunden för deras utseende i SP genom FACS. Vi har visat att hemogenic endotelceller och HSPC är på liknande sätt inom SP cellfraktionen 5,11. Läkemedel såsom kalciumkanalen ihibitor Verapamil blockerar denna Hoechst färgämne efflux beteende SP celler via blockering av en mängd olika transmultiresistens transportörer. I hematopoetiska stam- och progenitorceller, sker detta i första hand via ABCG2 / BCRP1 transportör 24. Typiskt verapamil inducerar> 50% blockering av SP, men den totala graden av Hoechst utflöde och dess efterföljande blockering av Verapamil sett har visat sig påverkas av utvecklings timing, förmodligen på grund av förändrade uttryck av flera multiresistenta transportörtyper med differentiell Hoechst utflödesförmåga och känslighet för Verapamil 5. Således är det starkt rekommenderas att Verapamil behandlade Hoechst-färgade negativ kontroll vara standardmässigt inkluderas för att säkerställa korrekt SP grind: Om en SP grind är korrekt utformat, bör en märkbar minskning av antalet SP celler detekteras i prover färgade med Hoechst i närvaro av Verapamil.
Vi har tidigare visat att sorterasSP-celler från E9.5 murina gulesäcken har en ~ 80-90 gånger större förmåga att generera HSPC i metylcellulosa-baserade hematopoetisk odling jämfört med en matchad antal E9.5 ofraktionerat, icke-Hoechst färgade hela YS vävnadsceller 5. Ytterligare karakterisering av SP har visat att den murina gulesäcken under tidig hematopoetisk och vaskulär utveckling på E8.0, det är märkbar uttryck av VE-cadherin och Flk-1, men låg expression av spindeln (c-Kit) och hematopoetiska markörer (CD45). Således, i denna utvecklings tidpunkt, primordial (icke-hemogenic) EG, definierad som Flk-1 + / CD31 + / CD45- icke SP celler dominerar. Detta uttryck profil förändringar som endotel markör uttryck minskar och CD45 och c-Kit uttryck ökar, samtidigt med en ökande förmåga att generera HSPC in vitro mellan E9.5 och E11.5 5. Detta tyder på hematopoetisk aktivitet YS vävnad som finns i SP, blir tydligast mellan E9.5 och E11.5 och occurrning genom en tidsförlust endotelceller egenskaper och gradvis förvärvet av hematopoetisk kapacitet. Som sådan, uttryck av de multiläkemedelsresistens transportörer som ger upphov till SP-fenotypen är en viktig fenotypisk markör för hemogenic endotel 5; i själva verket har icke-SP-celler från årsstämman inte uppvisar blodbildande potential 12. Således, framgångsrik isolering av SP via Hoechst färgning i både YS och AGM säkerställer att cellerna ska sorteras från hematopoetisk stamcellstransplantation facket i en given vävnad och efterföljande färgning av celler antikropp i denna fraktion kommer att tillåta diskriminering av hemogenic (Fik -1 + / c-kit + / CD45-) kontra HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) populationer 5,11,12. Vidare har det varit tidigare konstaterat att CD41 + -celler inom SP av gulesäcken och AGM vävnader är i stånd att flera härstamning kolonibildning i metylcellulosa baserad kultur 11,12. Vi definierar hemogenic endotelceller som Flk1 + c-Kit + CD45- SP cells med hjälp av CD45 som en utsedd markör för hematopoetisk härstamning snarare än CD41 med tanke på vår finna att uttryck av Flk1 och CD45 är praktiskt taget utesluter 5,11. Detta möjliggör en ren isolering av celler i SP som har både endotel (Flk-1) och stam egenskaper (c-Kit) som är nödvändiga för endotel till hematopoetisk övergång men som ännu inte har genomgått denna förändring, som bestäms av frånvaron av CD45 i dessa celler. Det skulle vara lämpligt att överväga underfraktionering av HSPC befolkningen, definierad som Flk-1- / c-Kit + / CD45 + / SP-celler, i Csf1r + (vävnadsmakrofager) och Csf1r- (HSC) fraktion som nyligen rapporterades av Gomez och kollegor 25, eftersom detta skulle ge större upplösning av den sanna HSPC mot vävnadsmakrofager föregångarpopulationer, men detta bör inte påverka integriteten för hemogenic endotelcell fraktion vars isolering vi har beskrivit sedan Csf1r är en markör för macrophage stamceller 26.
HemogENIC endotelceller är en sällsynt subpopulation i både YS och AGM (bestående av 1-3% av endotelceller), och därför en stor utmaning i sin studie är otillräcklig cellutbyte för senare ansökningar. Detta protokoll resulterar vanligen i 70-80% av cellerna återstående livsdugliga vid tiden för sortering och en typisk hemogenic endotelceller sort från poolade vävnader som erhållits från flera embryon kan ge endast ett par hundra celler även under optimala förhållanden med endast 10-20% för tillvaratagna cellerna inbäddade i metylcellulosa producerande kolonier. För att maximera sorterade cellantal, rekommenderas det starkt att utredarna vidta åtgärder för att säkerställa vävnad och cellviabilitet under varje steg av förfarandet: vävnader bör snabbt dissekeras och slogs samman och prover bör hållas på is när det är möjligt. Prover bör beredas på nytt omedelbart före FACS sortering, och sorteras i insamlings rör innehållande höga seruminnehåll eller direkt i metylcellulosa kultur som beskriverd ovan. Om lönsamhetsproblem kvarstår, uppsamlingsrör kan också i förväg belagd med serum för att ytterligare förbättra sorterade cellöverlevnad. Om hemogenic endotelceller avkastning är fortfarande låg, kan vuxen benmärg eller kommersiellt tillgängliga fluoroforen-konjugerade pärlor användas för spektral ersättning i stället för de embryonala vävnads härrör enda färgkontroller som beskrivs häri. Om sorterade celler är avsedda för kultur, bör hemogenic endotelceller och HSPC sorteras direkt i vävnadsodlingsbrunnar. Om sorterade celler är avsedda för DNA eller RNA relaterade genexpressionsanalys, hemogenic och icke-hemogenic endotelceller och HSPC kan sorteras direkt i uppsamlingsrören innehållande prov lysbuffert för att minimera cellförlust.
Den skisserade tekniken medger framgångsrik (och samtidigt) isolering av hemogenic och icke-hemogenic endotelceller, liksom HSPC och mogna blodcellfraktioner från samma embryonala vävnader. På så sätt kan ytterligare study av de molekylära grunderna för de kritiska övergångar som uppstår endotelceller genererar blod. Insikter från dessa utvecklingsstudier kan sedan användas för att optimera genereringen av humana hemogenic endotelceller och HSPC avkomma från pluripotenta, och potentiellt autologa stamceller för behandling av förekommande hematopoetiska störningar.
Disclosures
Detta arbete stöddes byNIH bidrag HL128064, HL096360, EB017103 och CT Innovations ger 15-RMB-Yale-04, till KKH, och NICHD / NIH T32HD007094.
Acknowledgments
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) | Sigma | D5942 | TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling. |
| Absorbent bench underpad | Covidien | 7134 | |
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | TOXIC inhalant: Use in fume hood. |
| 100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000 U/ml Penicillin, 10,000 mg/ml Streptomycin, 29.2 mg/ml L-glutamine) | Invitrogen | 10378016 | |
| Type II Collagenase | Worthington | LS004174 | |
| Falcon 70 μM nylon cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| Anti-Mouse CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
| Anti-Mouse CD31 - PE | eBioscience | 12-0311-81 | |
| Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 561259 | |
| Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma | 14533 | TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25 mg/ml in distilled H2O, store aliquots at -20 °C until ready for use. |
| Verapamil Hydrochloride | Sigma | 1711202 | TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling. Prepare stock solution of 5 mM (100x) in 95% ethanol. Store at -20 °C until ready for use |
| Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| MethoCult GF M3434 | Stem Cell Technologies | 3434 | Thaw and aliquot per manufacturer's instructions |
| Modified Giemsa Stain | Sigma | GS500 | TOXIC: Contains Methanol - use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution. |
| Cytospin Centrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Clipped Funnel Starter Kit | Thermo Scientific | 3120110 | Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge |
| Anti-Mouse B-220 - FITC | BD Pharmingen | 553088 | |
| Anti-Mouse Gr-1-FITC | eBioscience | 11-5931-85 | |
| Anti-Mouse Ter-119-FITC | eBioscience | 11-5921-85 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 10437-077 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5 g/L) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate | EMD Millipore | PIFB24P05 | |
| IgG2A-PE | BD Pharmingen | 553930 | |
| IgG2B-FITC | BD Pharmingen | 556923 |
References
- Hirschi, K. K. Hemogenic endothelium during development and beyond. Blood. 119 (21), 4823-4827 (2012).
- Boisset, J. C., et al. et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464 (7285), 112-115 (2010).
- Nadin, B. M., Goodell, M. A., Hirschi, K. K. Phenotype and hematopoietic potential of side population cells throughout embryonic development. Blood. 102 (7), 2436-2443 (2003).
- Nakano, H., et al. Haemogenic endocardium contributes to transient definitive haematopoiesis. Nat Commun. 4, 1564 (2013).
- Li, Z., et al. Mouse embryonic head as a site for hematopoietic stem cell development. Cell Stem Cell. 11 (5), 663-675 (2012).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- de Bruijn, M. F., Speck, N. A., Peeters, M. C., Dzierzak, E. Definitive hematopoietic stem cells first develop within the major arterial regions of the mouse embryo. Embo J. 19 (11), 2465-2474 (2000).
- Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
- Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-Kit, Notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Dev Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
- Tavian, M., et al. Aorta-associated CD34+ hematopoietic cells in the early human embryo. Blood. 87 (1), 67-72 (1996).
- Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21 (1), 31-41 (2004).
- Kelly, M. A., Hirschi, K. K. Signaling Hierarchy Regulating Human Endothelial Cell Development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 718-724 (2009).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), (2010).
- Bohnsack, B. L., Lai, L., Dolle, P., Hirschi, K. K. Signaling hierarchy downstream of retinoic acid that independently regulates vascular remodeling and endothelial cell proliferation. Genes Dev. 18 (11), 1345-1358 (2004).
- Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of the T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
- Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151 (5), 2399-2408 (1993).
- Kina, T., et al. The monoclonal antibody TER-119 recognizes a molecule associated with glycophorin A and specifically marks the late stages of murine erythroid lineage. British Journal of Haematology. 109 (2), 280-287 (2000).
- Jackson, K. A., et al. Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. J Clin Invest. 107 (11), 1395-1402 (2001).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
