Summary
Este protocolo detalla los pasos importantes que se requieren para la bioconjugación de una cisteína que contiene proteína a una maleimida, incluyendo la purificación de reactivos, condiciones de reacción, purificación y caracterización bioconjugado bioconjugado.
Introduction
La bioconjugación implica la unión covalente de una biomolécula con otra o con una molécula sintética, tal como un tinte, fármaco o un polímero. Métodos bioconjugation proteína ahora se utilizan ampliamente en muchos grupos de investigación química, biología y nanotecnología con aplicaciones que van desde el etiquetado colorante fluorescente 1,2, haciendo de proteína (anticuerpo) -prodrugs 3 (conjugados de fármaco anticuerpo - ADC) síntesis de dímeros de proteína de 4,5 , a través de los híbridos de proteína-polímero auto-montaje de 6,7 utilizadas en nanomedicina 8 y 9 sistemas de la química.
La especificidad de la química utilizada para bioconjugation, aunque no siempre crítico, es de suma importancia para bioconjugados proteína más funcionales, a fin de no interferir con el sitio activo de la proteína diana. La reacción bioconjugation ideales necesita cumplir varios criterios, incluyendo: i) dirigidas a sitios raros o únicos en la proteína de interés,ii) ser selectiva hacia este objetivo, iii) proceda en condiciones no desnaturalizantes para evitar desplegamiento de la proteína y iv) ser de alto rendimiento como la proteína diana es por lo general sólo está disponible a una concentración sub-milimolar. La maleimida - cisteína adición de Michael se acerca a cumplir con todos estos criterios, y tiene por ello reclamó durante mucho tiempo un estatus especial en el campo de la química de bioconjugados 10. Esto se debe a que i) muchas proteínas que contienen residuos sólo una cisteína en su superficie pueden ser modificadas por ingeniería genética allí, ii) en el pH correcto de la reacción es altamente selectiva hacia cisteína, iii) se produce más fácilmente en tampones acuosos y iv) es muy rápido con la segunda constante de velocidad orden de maleimidas a las proteínas que contienen cisteína reportados exceda de 5.000 M -1 s -1 en algunos casos 11. Siempre que la proteína de interés puede tolerar una cantidad pequeña (≈ 5-10%) de co-disolvente orgánico 12, casi cualquier colorante de maleimida-funcionalizado, poLymer, superficie u otra proteína puede estar ligada a las proteínas. Además, maleimidas son más específicos para las cisteínas en proteínas que yodoacetamidas, que son más propensos a reaccionar con otros nucleófilos a pH elevado; y más estable que conjugaciones a base de disulfuro que deben mantenerse a un pH ácido para impedir el intercambio de disulfuro de 13.
Aquí se presenta un protocolo genérico para la conjugación de moléculas de maleimida-funcionalizado para una proteína que contiene un único residuo de cisteína mediante la reacción entre un cromóforo Ru basado en (II) y la proteína citocromo c redox como un ejemplo. Este protocolo es igualmente aplicable a la mayoría de otras proteínas que contienen un residuo de cisteína superficie accesible y el objetivo maleimida-funcionalizado correspondiente, ya sea otra proteína, un colorante fluorescente, un cromóforo o un polímero sintético.
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Protocol
Nota: El siguiente protocolo está diseñado para la síntesis de un bioconjugado de proteína-colorante como se muestra en la Figura 1 Se trata de un protocolo general para la reacción de una maleimida con las proteínas de cisteína superficie libre que contienen, con notas insertan en su caso para ayudar con la proteína de la membrana. bioconjugados, bioconjugados de proteína-polímero, y dímero de proteínas sintéticas (proteína-proteína) bioconjugados. En este caso particular, la proteína de iso-1 citocromo c tiene un residuo de cisteína de superficie disponible para reaccionar que permite un etiquetado altamente específico que se produzca. Si una proteína de interés tiene múltiples residuos de cisteína, se aplica el mismo protocolo, aunque con la pérdida de la especificidad y la homogeneidad del producto. Química de orientación residuos de lisina superficie, usando N -hydroxysuccinimidyl ésteres o isotiocianatos, pueden ser un enfoque más simple si no se requiere la especificidad.
1. Purificación de citocromo c
Nota: Este paso no es aplicable a todas las proteínas. Sin embargo, es importante saber que una proteína obtenida de un proveedor comercial puede contener otras isoformas de proteínas no deseadas, que pueden necesitar ser eliminado por purificación adicional 13.
- Disolver 2,4 g de dihidrogenofosfato de sodio (M w = 120 g mol -1) en 1 L de agua ultrapura a prepare una solución tampón que contiene 20 mM NaH 2 PO 4. Se ajusta el pH con NaOH 1 M a pH 7.
Nota: Los tampones de fosfato utilizados en este protocolo deben prepararse recientemente sobre una base diaria, y se filtraron a través de un filtro de membrana de 0,2 micras de celulosa antes de su uso. - Disolver 29,22 g de cloruro de sodio (M w = 58,44 g mol -1) en 500 ml de la NaH 2 PO 4 20 mM tampón para hacer una mM NaH 2 PO 4 20 y tampón M NaCl 1. Este es el tampón de elución para la purificación en el paso 1.6).
- Disolver 12,0 mg de liofilizado citocromo c (cyt c) en 6 ml de pH 7 20 mM de tampón de fosfato.
- Por separado se disuelven 14,7 mg de ditiotreitol (DTT, M w = 154,25 g / mol) en 95,3 l de agua ultrapura para preparar una solución madre 1 M.
Nota: La solución de TDT Debe prepararse, ya que este reactivo es susceptible a la desactivación oxidativa en solución acuosa. - Pepitaette 60 l de la solución 1 M de DTT en la solución de proteína para reducir el cyt c. El color de la solución cambia de color rojo oscuro a rojo claro tras la mezcla.
- Se filtra la solución de proteína reducida a través de un filtro de jeringa de PVDF de 0,22 micras de unión baja en proteínas antes de inyectar en cualquier medio cromatográfico.
- Adjuntar una columna de intercambio catiónico 3,3 ml fuerte entre el bucle de inyección y detector de UV-Vis de un instrumento de cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC).
- Equilibrar la columna con 3 volúmenes de columna de agua ultrapura, seguidos por 3 volúmenes de columna de pH 7 tampón fosfato 20 mM, utilizando una velocidad de flujo de 1 ml / min.
- Cargar 1 ml de crudo reducido cyt c en el circuito de inyección, y comenzar un método de gradiente desde 328 - 450 mM de NaCl, en 5 volúmenes de columna. Monitorear los canales de 280 nm y 410 nm del detector de UV-Vis, y recoger el pico más grande.
- Aumentar la concentración de sal de 1 M de 2 volúmenes de columna para eluir iso-2 citocromoe c, y después de la columna ha sido lavado, re-equilibrar la columna con 2 volúmenes de columna de tampón fosfato 20 mM antes de la inyección de la siguiente parte alícuota crudo.
- Repita los pasos del 01/09 a 01/10 hasta que toda la proteína cruda se ha purificado.
- Se combinan las fracciones que contienen iso-1 y concentrarlos usando un (MWCO) filtro giratorio 3.5 kDa de peso molecular de corte y centrifugación a 3.000 x g.
- Cargar la proteína concentrada en casetes de diálisis de 3,5 kDa MWCO y dializar contra ultrapura agua durante la noche, con 2 cambios de agua.
- Determinar la concentración de la solución de proteína pura, se concentró mediante la adopción de 10 l, diluir a 100 l con agua ultrapura, y teniendo un espectro de absorbancia. Use un volumen bajo, 100 l cubeta de cuarzo para obtener espectros de absorción de proteínas. Típicamente, la concentración de proteína sin diluir es del orden de 50 - 100 mM.
- Utilice la característica pico de 410 nm de cyt c para cuantificar el concentration utilizando la ley de Beer-Lambert con un valor de absortividad molar de 97,6 cm-1 mM -1:
A = ε × c × ι
donde A es la absorbancia, ε es la absortividad molar, c es la concentración en mM, y ι es la longitud de la trayectoria de la cubeta en cm 13.
- Utilice la característica pico de 410 nm de cyt c para cuantificar el concentration utilizando la ley de Beer-Lambert con un valor de absortividad molar de 97,6 cm-1 mM -1:
- En este punto, se divide la proteína en alícuotas de 1 ml y mantener congelada a -20 ° C hasta que se necesiten. Cyt c puede congelarse y descongelarse sin pérdida de estructura o función, pero los ciclos de repetición comenzará a desnaturalizar la proteína.
Nota: Las proteínas resiste heladas en diferentes grados. Por ejemplo, las proteínas fluorescentes verdes 5,9 no debe congelarse, ahora almacenadas en un refrigerador.
2. Síntesis de citocromo c bioconjugados
- Disolver 0,9 mg de rutenio (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (tpa) 2 maleimida, 0,975 mmol, 6 equivalentes) en 600 l de acetonitrilo.
Nota: Si la maleimida utilizado es soluble en agua, preparar una solución madre en agua en lugar de acetonitrilo. Es importante para la maleimida a ser soluble en el tampón de reacción. Dimetilsulfóxido, N, N-dimetilformamida, acetonitrilo y se utilizan todos comúnmente adyuvantes para ayudar en la disolución de bajo peso molecular 12, a menudo los reactivos de maleimida hidrófobos. - Preparar una solución tampón que contiene tampón fosfato 100 mM y 100 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, M w = 292,24 g / mol), que cuando se diluye a 20 mM está en pH 7. Añadir hidróxido de sodio sólido hasta que se disuelva el EDTA (varios gramos típicamente ) y ajustar el pH a 7.
- Disolver 2,87 mg de Tris (2-carboxietil) fosfina clorhidrato (TCEP 15, M w = 286,65 g / mol) en 1 ml de agua ultrapura para preparar una solución madre 10 mM. Este paso es la importaciónhormiga para asegurar que la cisteína en la proteína está totalmente reduce antes de maleimida de acoplamiento 15.
Nota: La solución de TCEP Debe prepararse para cada reacción, ya que este reactivo es susceptible a la desactivación oxidativa en solución acuosa. - Combinar 11,4 ml de agua ultrapura con 3 ml de solución de fosfato / EDTA de stock 100 mM en un tubo de plástico de 50 ml. Cuando se diluye aún más con las soluciones de proteínas y de existencias de maleimida la concentración del tampón será de 20 mM.
Nota: Si la proteína de ser etiquetado es una proteína transmembrana, asegurar que un detergente adecuado se añade a la memoria intermedia para solubilizar la proteína. Si no se usa un detergente la proteína de membrana puede precipitar lentamente, lo que afectará negativamente los rendimientos de reacción. Utilice el detergente en todas las etapas de purificación posteriores. - Añadir 0,15 mmol (3 ml de una solución 50 mM, 1 equivalente) de purificado cyt c en el búfer de fosfato-EDTA.
- Añadir 7,5 l de la TCEP Stock solution (0,075 mol, 0,5 equivalentes) a la solución de proteína y dejar de agitar durante 5 min para reducir cualquier proteína que pueda haber dimerizada debido a la oxidación de cisteína.
Nota: No agregue TCEP si la proteína de interés no dimerize fácilmente. Comprobarlo ejecutando un gel de proteína en condiciones no reductoras. - Añadir 600 l de la solución de acetonitrilo de Ru (II) (tpa) 2 maleimida a la solución reducida, tamponada de cyt c, y dejar la mezcla de reacción bajo agitación, en la oscuridad, a temperatura ambiente, durante 24 horas.
- Se concentra la mezcla de reacción usando filtros de giro de 3,5 kDa MWCO, centrifugación a 3.000 xg, repitiendo 2-3 veces con tampón fosfato 20 mM frescas hasta que el filtrado salga clara. Eliminar la mayor cantidad de maleimida sin reaccionar de la mezcla de reacción como sea posible antes de la siguiente etapa de purificación.
Nota: En este punto, la mezcla de bioconjugación crudo se puede almacenar en el refrigerador, en la oscuridad. Es importante eliminar tinte de maleimida sin reaccionar por centrifuge diálisis antes del almacenamiento como la maleimida puede reaccionar lentamente y no específicamente con residuos de lisina en la superficie de la proteína.
3. Purificación de bioconjugados citocromo C
- Disolver 2,4 g de dihidrógeno fosfato de sodio y 29,22 g de cloruro sódico en 1 L de agua ultrapura para preparar una solución tampón que contiene 20 mM NaH 2 PO 4 y 0,5 M NaCl. Este es el tampón de ejecución para la purificación cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC).
- Disolver 17 g de imidazol (M w = 68.077 g mol -1) en 500 ml de la 20 mM NaH 2 PO 4 y tampón de NaCl 0,5 M. Este es el tampón de elución para la purificación IMAC.
- Ajustar el pH de ambos tampones a pH 7 con NaOH 1 M o HCl, y filtrar a través de membranas de 0,22 micras de celulosa regenerada antes de su uso en la FPLC.
- Como las columnas IMAC comprados se envían sin ningún tipo de iones metálicos cargados en la colUMN, preparar la columna para un Ni 2+ purificación basado lavando la columna con 3 ml de agua ultrapura, 3 ml de solución de acetato de níquel 100 mM, y 6 ml de agua ultrapura. Si la columna no es para ser usado inmediatamente lavar a través de 3 ml de etanol al 20% y almacenar la columna en la nevera para evitar el crecimiento bacteriano.
- Adjuntar un 2 + Ni RESORTE 1 ml de columna IMAC a la FPLC entre el bucle de inyección y detector de UV-Vis.
- Equilibrar la columna con 3 volúmenes de columna de fosfato 20 mM, tampón NaCl 0,5 M usando una tasa de flujo de 0,5 ml / min.
- Carga de 100 l de mezcla de reacción bruta (filtrada a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras) en la columna de Ni 2+ IMAC. Lavar la columna con 3 volúmenes de columna de tampón de ejecución para eluir no reaccionado cyt C, seguido de un gradiente de imidazol 0 a 125 mM más de 3 volúmenes de columna para eluir el c bioconjugado bisterpyridine-citocromo de rutenio (Ru (II) Cyt c) .
- Se lava la cOLUMNA con tampón de imidazol 250 mM durante 5 volúmenes de columna, a continuación, volver a equilibrar la columna con fosfato 20 mM, NaCl 0,5 M y repita el paso 3.7 hasta que todo el bioconjugado bruto ha sido purificada.
- Reunir las fracciones Bioconjugate y concentrar utilizando un filtro de giro 3,5 kDa MWCO, centrifugación a 3000 x g.
- Cargar el bioconjugado se concentra en casetes de diálisis de 3,5 kDa MWCO y dializar contra ultrapura agua durante la noche, con 2 cambios de agua.
- Determinar la concentración de la solución de bioconjugado puro, se concentró por UV-Vis, usando el mismo valor de absortividad molar como iso-1 citocromo c (97,6 mM -1 cm -1) a 410 nm. Típicamente, la concentración bioconjugado es del orden de 50 - 100 mM.
- Divida el bioconjugado en 25 ml de alícuotas congeladas y mantener a -20 ° C hasta que se necesiten.
4. Caracterización de bioconjugados citocromo C
- Desalentarminación de la masa bioconjugado por MALDI-TOF MS
- Disolver 10 mg de ácido cafeico en 1 ml de una solución de ácido acetonitrilo / agua / ácido trifluoroacético (80: 20: 0,1, v / v / v).
- Diluir 5 l de solución de proteína concentrada con 5 l de solución de ácido cafeico.
- Punto de 0,5 l de solución de ácido cafeico en la placa de MALDI objetivo y permita que la solución se seque.
- Punto 0.5 l de la solución de la muestra / de la matriz en la parte superior de este punto de ácido cafeico, permita que el punto de que se seque. Detectar otros 0,5 l de matriz de la muestra en la parte superior de este a "sándwich" la muestra entre las capas de la matriz, y dejar secar.
- Adquirir los espectros de masas en modo lineal utilizando los ajustes del instrumento adecuados para las proteínas 16.
- Investigación de bioconjugados por electroforesis en gel
- Preparar 10 l de cada muestra de proteína que se ejecutan mediante la dilución de las muestras de proteínas con sulfato dodecil premezclada de litio (LDS, pH 8,4) tampón (4x) tOA concentración final de aproximadamente 20 mg por pocillo. Para los pozos que requieren condiciones reductoras, añadir 1 l de ditiotreitol 500 mM (DTT) agente (10x) reducir.
- muestras de calor a 70 ° C durante 10 min.
- Añadir 50 ml de premezcla 1 M MES, base de 1 M Tris, 2% de SDS, EDTA 20 mM (pH 7,7) que se ejecuta mezcla tampón (20x) de una fuente comercial a 950 ml de agua ultrapura para preparar el tampón de gel en funcionamiento.
- Retire el peine de plástico a partir del gel y colocar el gel en el depósito de gel en marcha. Llenar el tanque con tampón de gel de ejecución, por lo que los pozos se cubren con tampón.
- Cargar las muestras con cuidado en un prefabricado 12% Bis-Tris, 1 mm, gel de 10 pocillos usando puntas de pipeta largos para ayudar en la carga. Cargar el prestained proteína 10 peso molecular marcador (3-188 kDa) en un pozo medio del gel para ayudar a análisis.
- Correr el gel a 200 V de tensión constante durante 35 min.
- Teñir el gel con una solución de azul de Coomassie comercial durante 2 horas, y lavar con ultrapUre agua durante 48 horas.
- Determinación de la pureza bioconjugado mediante espectroscopía de UV-Vis
- Preparar 120 l de 5 M soluciones de Ru (II) (tpa) 2 maleimida, iso-1 cyt c, y Ru (II) Cyt c.
- Medir el espectro de línea base de la cubeta de cuarzo que contiene sólo agua ultrapura, de 250 nm a 650 nm.
- Medir el espectro de cada componente, garantizando la cubeta se enjuaga y se seca entre cada medición.
- Trazar la absorbancia de cada componente como una función de longitud de onda, y comparar la suma lineal de los materiales de partida con el producto final para determinar si una relación 1: 1 de Ru (II) (tpa) 2 maleimida a cyt c ha reaccionado.
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Representative Results
La síntesis de bioconjugados se confirma por tres métodos principales: Matrix-Assisted Laser Desorption ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS), electroforesis en gel de poliacrilamida, y ultravioleta-visible espectroscopia (UV-Vis), como se muestra en las figuras 2, 3 y 4. Un aumento de la masa correspondiente a la masa de la molécula pequeña anexa, y la falta de una proteína sin reaccionar demuestra la exitosa unión covalente de Ru (II) (tpa) 2 maleimida a cyt c y la posterior purificación del bioconjugado. El espectro UV-Vis del bioconjugado permite que el rendimiento que se calculó con la absorbancia a 410 nm, y comparando el espectro a un 1 predicho: espectro de 1 Además de los materiales de partida de la composición del bioconjugado puede inferir. En el ejemplo anterior, el rendimiento varía un poco de lote a lote, pero generalmente entre 15 a 27% después de FPLC Purifica15 ción.
Además, la aparición de un nuevo pico en el cromatograma durante la purificación confirma la síntesis de una nueva especie. Esto se ejemplifica en la figura 5, donde el análisis de las diferentes trazas UV-Vis puede indicar si o no una especie contiene el componente maleimida Ru (II) (tpa) 2.
Figura 2. MALDI-TOF Los espectros de masas de las proteínas. Los espectros de masas de pura iso-1 citocromo c (negro) y Ru (II) Cyt c (rojo). Peaks se pueden observar que corresponden a las masas calculadas de iso-1 cyt c (12.706 Da) y Ru (II) Cyt c (13.559 Da) con un aducto de ácido cafeico visible a 179 Da. Este aducto se ve en mayores cantidades en el cyt c s sin reaccionarPECTRA debido a una reacción entre el α, β-insaturados de carbonilo de ácido cafeico y el tiol libre de la proteína en condiciones de MALDI de alta energía. aductos de matriz se observan con frecuencia en MALDI-MS y pueden ser tanto covalente y no covalente en la naturaleza. Los espectros de línea de base son corregidas, el ruido se filtra, y se normalizó para la comparación. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. SDS-PAGE de las proteínas. 12% de gel de Bis-Tris de reducido y no reducido cyt c y Ru (II) c Cyt. El carril 3 contiene un patrón de proteína pre-manchado, con una masa polipéptido anotado a la derecha de cada banda (kDa). Por favor, haga clic aquí para ver una versio más granden de esta figura.
Figura 4. UV-Vis Spectra de proteínas: El espectro de absorbancia de Ru (II) Cyt c (verde) se corresponde estrechamente con la adición lineal (línea de puntos azul) de puro, sin reaccionar cyt c (rojo) y sin reaccionar Ru (II) ( tpa) 2 maleimida (negro). Esto demuestra que el bioconjugado se compone de una mezcla 1:. Anexo 1 de la maleimida a la proteína favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Cromatograma de la purificación de Ni-IMAC de bioconjugados: IMAC rastro de Ru (II) Cyt c purificación. UV-Vis traza: 410 nm corresponde a la banda de Soret de CYt c, 280 nm corresponde tanto cyt c y Ru (II) (tpa) 2 maleimida y 475 nm corresponde a la banda de transferencia de carga de metal a ligando de la (II) complejo de rutenio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La purificación de los materiales de partida antes de una bioconjugation es de suma importancia. Las proteínas obtenidas a partir de fuentes recombinantes comerciales contienen a menudo otras isoformas de la proteína de interés, que puede tener diferente química de la superficie y reactividad. Por ejemplo, en la bioconjugación descrito, el cyt c comercialmente disponible contiene una mezcla de ambos cyt c 12,14,17 iso-1 e iso-2. Iso-2 y las formas de citocromo c 1 Iso-son en gran medida homóloga, con la principal diferencia es la presencia de un residuo de cisteína libre cerca de la C-terminal de la norma ISO-1 citocromo c. En el ejemplo aquí, la purificación se consigue con fuerte acuoso de intercambio catiónico FPLC, sin embargo, otras formas de FPLC como de intercambio aniónico, de afinidad, hidrofóbica o cromatografía de exclusión por tamaño puede ser más aplicable. La proteína también se reduce en este paso para asegurarse de que el residuo de cisteína en la proteína de interés (aquí citocromo c) es fuLLY reducida antes de la bioconjugación con el objetivo maleimida ligado. Además, es útil para determinar si la molécula pequeña maleimida anexa a ser utilizado con una cisteína que contiene proteína es puro y que la maleimida no se ha sometido a una reacción en el almacenamiento, como maleimidas son ligeros y sensibles a la temperatura. Esto puede ser rápida y fácilmente revisado por 1 H NMR, como los protones vinílicos de una maleimida intacta aparecerá como un singlete a 6-6,5 ppm, mientras que los protones de una maleimida abierto se desplazará fuera del campo; y también la espectrometría de masas, con un anillo de maleimida abierta correspondiente a un aumento de masa 18 Da.
Elección Buffer, pH, y la inclusión de adyuvantes tales como detergentes, disolventes orgánicos, y agentes reductores tendrán un profundo efecto en los rendimientos bioconjugation 5,15. En el caso de una adición de Michael de una maleimida y un tiol, el pH debe ser superior a 6 aún por debajo de 8 para una, reacción específica rápido que se produzca. Por debajo de pH 6, la especificidad es alta comola maleimida no será capaz de reaccionar con cualquier amina, pero el tiol es protonado y por lo tanto es un nucleófilo pobre para la adición de Michael que conduce a una reacción lenta. Por encima de pH 8, residuos de lisina de la superficie puede llegar a ser desprotonado y reaccionar con maleimidas disponibles, lo que lleva a una unión covalente no específica del componente maleimida a la proteína. El tampón fosfato se utiliza en este bioconjugation porque es un fuerte tampón en este intervalo de pH y no interactúa con cualquiera de los reactivos. Tris (hidroximetil) aminometano (Tris) tampón, por ejemplo, sería una opción pobre como el grupo amina en este tampón potencialmente podrían reaccionar con la maleimida, lo que conduciría a pobres rendimientos. La solubilidad de todos los reactivos es también clave para altos rendimientos. La adición de pequeñas cantidades (<10% v / v) de disolvente orgánico puede ayudar en la disolución de los componentes no polares, mientras que el pH correcto y la concentración de sal son esenciales para mantener las proteínas en solución y dobladas 12. Para grandes protei membranans con residuos superficiales hidrófobas significativas, será necesario un agente tensioactivo para impedir la proteína a partir de la precipitación de 18.
Si la proteína en la bioconjugación es propenso a la oxidación y la dimerización, la adición de un agente reductor tal como TCEP se ha demostrado que mejora los rendimientos de bioconjugation 15. La reducción in situ de la proteína a su forma monomérica, libre de tiol permite una mayor proporción de sitios tiol activos para ser accedido por el maleimida. Sin embargo, el orden de adición y la estequiometría es la clave del éxito de un aumento de los rendimientos como TCEP también reaccionará con maleimida. Mediante la adición de la maleimida después de TCEP, el TCEP será consumido por la reducción de la proteína primero. La mitad de un equivalente de TCEP a la proteína se usa por la misma razón, por lo que el exceso de TCEP no está disponible para reaccionar desfavorablemente con la maleimida libre. puentes disulfuro estructurales en el interior de la proteína no son propensos a ser afectados por la adición de TCEPu otros agentes reductores tales como la TDT, siempre que la proteína no se lleva a cabo en condiciones de desnaturalización tales como alta temperatura o una alta concentración de urea. Por ejemplo, la adición de un gran exceso de DTT a cyt c antes de la FPLC de purificación no tiene un efecto significativo en la cantidad de proteína recuperada después de la purificación. Si se sospecha que la reducción de los puentes de cisteína estructurales por TCEP, esto puede ser confirmado mediante la ejecución de un gel de proteína en condiciones nativas, de no desnaturalización.
El Ru (II) bisterpyridine marcado con citocromo c sintetizado en este método se purifica a través de Ni 2+ metálico inmovilizado para cromatografía de afinidad 14. Existen otros métodos de purificación, tales como cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de aniones / intercambio catiónico y cromatografía de afinidad específica tal como una fase estacionaria de anticuerpos. En general, el método sigue siendo el mismo que el descrito anteriormente, con la concentración y de diálisis pasos siguientes caracteresg cromatográfico de purificación para regresar el producto bioconjugado a un tampón adecuado para el almacenamiento.
El principal método de determinar si un bioconjugation tiene éxito es a través de MALDI-TOF MS. Es la forma más exacta para determinar la pequeña diferencia de masa entre la proteína nativa y proteína marcada covalentemente con una molécula pequeña, una diferencia a menudo menos de 1000 Da. La parte más difícil de ejecutar un experimento de MALDI-TOF MS es la elección de la matriz y la detección de la técnica; sin embargo el ácido cafeico se ha encontrado para ser una matriz propósito fiable, en general para el análisis de las proteínas y bioconjugados utilizados en este trabajo. Como una alternativa potencial, ácido sinapínico es otra matriz MALDI comúnmente utilizado para el análisis de proteínas. Análisis de los datos de MALDI-TOF MS es relativamente sencillo. Figura 2 muestra el espectro típico MALDI-TOF MS de ambos puro iso-1 cyt c (M w = 12706 Da) y puro Ru (II) Cyt c (Mw = 13559 Da), ambos de los cuales estrechamente corresponde a la masa molecular calculada. La pureza también se puede observar, tomando nota de la falta de un pico de iso-2 citocromo c (M w = 12.532 Da) en el espectro sin reaccionar y la falta de un citocromo c pico iso-1 en el espectro de bioconjugado. La masa bioconjugado también se puede estimar usando electroforesis en gel. La figura 3, un gel de proteína de Bis-Tris 12%, proporciona dos elementos de prueba para la bioconjugación. En primer lugar, la ausencia de una banda de dímero en condiciones no reductoras para Ru (II) Cyt c indica que ya no hay una cisteína libre, y segundo, el ligero desplazamiento de la banda se traduce bioconjugado hacia arriba a un aumento del peso molecular. Geles de proteínas son de gran valor y definitivamente puedan justificar la bioconjugation éxito no sólo para las pequeñas moléculas adjuntos, sino también para la síntesis de dímeros de proteínas o 5 bioconjugados de proteína-polímero 9.
Para las proteínascromóforos que contienen tales como la proteína fluorescente verde o citocromos que contienen hemo, la espectroscopia UV-Vis se utiliza para determinar la composición y el rendimiento del bioconjugado. El 1: adición 1 lineal de los espectros de materiales de partida permite la construcción de un espectro de UV-Vis hipotética del bioconjugado, como se muestra en la Figura 4 Mediante la comparación del espectro de bioconjugado real a este 1:. Espectro adición 1, la composición puede ser inferido . Por ejemplo, si dos o más de Ru (II) (tpa) 2 -maleimides habían unido no específicamente a la proteína, la banda 480 nm del bioconjugado sería mayor que el espectro predicho. Además, la concentración del bioconjugado se puede aproximar mediante el valor de absortividad molar nm 410 de 97,6 cm -1 mM -1. Esto se supone que es el mismo para el bioconjugado porque el Ru (II) (tpa) 2 maleimida tiene absorbancia mínima en esta región.
Cabe señalar that bioconjugation a través de la química de la cisteína-maleimida tiene varias limitaciones. En primer lugar, la proteína de interés debe tener un único residuo de cisteína accesible, o la ingeniería de proteínas demás deben llevarse a cabo para introducir uno. En segundo lugar, el lazo cisteína-maleimida es susceptible de intercambiar con otros tioles libres, tales como albúmina y el glutatión en el contexto de aplicaciones de plasma 19. Dicho intercambio depende de la accesibilidad de disolvente y carga local en la superficie de la proteína altamente. vínculos maleimida tiol todavía pueden ser adecuados para aplicaciones de plasma, pero la estabilidad a largo plazo se controlen mediante espectrometría de masas y electroforesis en gel.
A pesar de esto, la alta unión altamente específicos, rendimiento de nuevas moléculas, tales como colorantes fluorescentes, centros redox, polímeros y otras proteínas a proteínas a través de la química de la cisteína-maleimida es una técnica poderosa que permite una gama de construcciones macromoleculares interesantes para ser unaccessed. Tener grandes cantidades de bioconjugados de proteínas químicamente bien definidas es clave para futuros estudios que implican la proteína de unión, auto-ensamblaje, la cinética enzimática y la localización de la proteína. Como se demostró anteriormente, a partir de la purificación de material, la elección del medio de reacción, y la adición de reactivos suplementarios tales como agentes reductores o tensioactivos que tienen un impacto significativo en el rendimiento bioconjugation. La purificación se logra más fácilmente mediante cromatografía compatible proteína, y la caracterización se lleva a cabo utilizando una combinación de MALDI-TOF MS, electroforesis en gel, y la espectroscopía UV-Vis.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 ml strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 ml IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | Extremely corrosive! Use caution. |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
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