Summary
Detalhes do presente Protocolo, os passos importantes necessários para a bioconjugação de uma cisteína contendo proteína para uma maleimida, incluindo a purificação de reagentes, condições de reacção, purificação e caracterização de bioconjugados bioconjugado.
Introduction
Bioconjugação envolve a ligação covalente de biomoléculas com um outro ou com uma molécula sintética, tal como um corante, ou um polímero de drogas. Métodos bioconjugação proteína são agora amplamente utilizados em muitos grupos de pesquisa química, biologia e nanotecnologia, com aplicações que vão desde a rotulagem corante fluorescente 1,2, fazendo de proteínas (anticorpos) -prodrugs 3 (conjugados de medicamentos com anticorpos - ADCs) síntese de dímeros da proteína de 4,5 , por meio de híbridos de proteína-polímero de auto-montagem 6,7 utilizados em nanomedicina 8 e sistemas química 9.
Especificidade da química utilizada para bioconjugação, embora nem sempre seja crítica, é de extrema importância para bioconjugados proteína mais funcionais, de modo a não interferir com o local activo da proteína alvo. A reação bioconjugação ideal precisa cumprir vários critérios, incluindo: i) segmentação locais raras ou únicas sobre a proteína de interesse,ii) ser selectivo em relação a este alvo, iii) prosseguir sob condições não desnaturantes para evitar a proteína se desdobrar e iv) ser de alto rendimento como a proteína alvo está geralmente disponível apenas em concentração sub-milimolar. A maleimida - cisteína Michael disso vem perto de cumprir todos estes critérios, e tem por essa razão muito reivindicada um estatuto especial no campo da química bioconjugado 10. Isto é porque i) muitas proteínas que contenham resíduos apenas uma cisteína na sua superfície podem ser geneticamente manipulados há, ii) ao valor de pH correcto a reacção é altamente selectiva para com a cisteína, iii) prossegue suavemente em tampões aquosos e IV) é muito rápido com a segunda constante de velocidade a fim de maleimidas a proteínas contendo cisteína relatados para exceder 5000 M-1 s-1, em alguns casos 11. Desde que a proteína de interesse pode tolerar uma quantidade pequena (≈ 5-10%) de co-solvente orgânico 12, quase todo o corante funcionalizado com maleimida, poLymer, ou outra proteína de superfície pode ser ligada a proteínas. Além disso, as maleimidas são específicas para mais cisteínas em proteínas do que iodoacetamidas, que são mais propensos a reagir com outros nucleófilos a pH elevado; e mais estável do que conjugações à base de dissulfureto, que devem ser mantidos a pH ácido para impedir a permuta de dissulfureto 13.
Aqui relatamos um protocolo genérico para a conjugação de moléculas funcionalizado com maleimida para uma proteína que contém um único resíduo de cisteína utilizando a reacção entre um de Ru (II), com base na cromóforo e a proteína redox citocromo C como um exemplo. Este protocolo é igualmente aplicável para a maioria das outras proteínas contendo um resíduo de cisteína superfície acessível e o alvo funcionalizado com maleimida correspondente, seja uma outra proteína, um corante fluorescente, um cromóforo ou um polímero sintético.
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Protocol
Nota: O seguinte protocolo é concebido para a síntese de um bioconjugado de proteína-corante, como mostrado na Figura 1 É um protocolo geral para a reacção de uma maleimida com cisteína superfície livre que contêm proteínas, com as notas inseridas onde aplicável para ajudar com a proteína de membrana. bioconjugados, bioconjugados de proteína-polímero, e dímero de proteína sintética (proteína-proteína) bioconjugados. Neste caso particular, a proteína 1 de iso-citocromo C tem um resíduo de cisteína disponível para reagir superfície que permite uma marcação altamente específico para ocorrer. Se uma proteína de interesse tem múltiplos resíduos de cisteína, o mesmo protocolo aplicável, embora com a perda de especificidade e homogeneidade do produto. Resíduos de lisina superfície Química segmentação, usando n hidroxissuccinimidilo ésteres ou isotiocianatos, pode ser uma abordagem mais simples se a especificidade não é necessária.
1. A purificação do citocromo C
Nota: Este passo não é aplicável para todas as proteínas. No entanto, é importante saber que uma proteína obtida a partir de um fornecedor comercial, pode conter outras isoformas de proteínas não desejadas que podem necessitar de ser removido por purificação adicional 13.
- Dissolve-se 2,4 g de di-hidrogenofosfato de sódio (M w = 120 g mol-1) em 1 L de água ultrapura ao PRepare uma solução tampão contendo 20 mM de NaH 2 PO 4. Ajustar o pH com NaOH 1 M para pH 7.
Nota: Os tampões de fosfato utilizados no presente protocolo deve ser preparado de fresco numa base diária, e filtrada através de um filtro de membrana de celulose de 0,2 um antes da utilização. - Dissolve-se 29,22 g de cloreto de sódio (M w = 58,44 g mol-1) em 500 ml de tampão de NaH 2 PO 4 20 mM para fazer uma mM de NaH 2 PO 4 20 e tampão de NaCl 1 M. Este é o tampão de eluição para a purificação no passo 1.6).
- Dissolve-se 12,0 mg de liofilizado de citocromo C (cyt C) em 6 ml de pH 7 a 20 mM de tampão de fosfato.
- Separadamente dissolver 14,7 mg de ditiotreitol (DTT, M w = 154,25 g / mol) em 95,3 ul de água ultrapura para preparar uma solução de reserva 1 M.
Nota: A solução de estoque de DTT deve ser preparado de fresco, quando o reagente é susceptível a desactivação oxidativa em solução aquosa. - Pipette 60 ul de solução de 1 M DTT para a solução de proteína para reduzir o citocromo c. A cor da solução muda de vermelho escuro para vermelho claro após a mistura.
- Filtrar a solução de proteína reduzida através de um filtro de seringa PVDF de ligação 0,22 baixa proteína antes de injetar em qualquer mídia cromatográfica.
- Anexar uma coluna de troca catiônica 3,3 ml forte entre o septo de injecção e detector UV-Vis de um Cromatografia Líquida (FPLC) instrumento rápido Protein.
- Equilibrar a coluna com 3 volumes de coluna de água ultrapura, seguido por 3 volumes de tampão fosfato pH 7 a 20 mM de coluna, utilizando uma taxa de fluxo de 1 ml / min.
- Carga 1 ml de reduzida cit bruto c para o ciclo de injeção, e iniciar um método de gradiente de 328-450 mM de NaCl, ao longo de 5 volumes de coluna. Monitorar os 280 nm e 410 nm canais do detector UV-Vis, e recolher o maior pico.
- Aumentar a concentração de sal a 1 M para 2 volumes de coluna para eluir iso-2 citocromoe C, e depois a coluna foi lavada, re-equilibrar a coluna com 2 volumes de tampão fosfato 20 mM de coluna antes de injectar o próximo aliquota em bruto.
- Repita os passos 1,9-1,10 até que toda a proteína em bruto foi purificado.
- Reunir as fracções contendo iso-1 e concentrá-los usando um 3,5 kDa de peso molecular de corte (MWCO) filtro de centrifugação e centrifugação a 3.000 x g.
- Carregar a proteína concentrada em 3,5 cassetes de diálise kDa MWCO e diálise contra ultrapura água durante a noite, com 2 mudanças de água.
- Determinar a concentração da solução de proteína pura, concentrou-se, tendo de 10 ul, diluindo-a com 100 ul de água ultrapura, e tendo um espectro de absorvância. Use um volume baixo, 100 ul cuvette de quartzo para obter espectros absorção de proteínas. Tipicamente, a concentração de proteína não diluído é da ordem de 50 - 100 pM.
- Use a característica de pico 410 nm de cit c quantificar o Concentraçãn usando a lei de Beer-Lambert com um valor de absortividade molar de 97,6 cm -1 mM -1:
A = ε × c × ι
em que A é a absorvância, ε é a absortividade molar, c é a concentração de mM, e ι é o comprimento do percurso da tina em 13 cm.
- Use a característica de pico 410 nm de cit c quantificar o Concentraçãn usando a lei de Beer-Lambert com um valor de absortividade molar de 97,6 cm -1 mM -1:
- Neste ponto, a proteína dividir em alíquotas de 1 ml e manter congelados a -20 ° C até serem necessárias. Cit c podem ser congeladas e descongeladas sem perda da estrutura ou função, mas os ciclos de repetição irá começar a desnaturar a proteína.
Nota: Proteínas tolerar o congelamento em graus diferentes. Por exemplo, proteínas fluorescentes verdes 5,9 não deve ser congelado, em vez armazenada no frigorífico.
2. Síntese de citocromo c bioconjugados
- Dissolve-se 0,9 mg de ruténio (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (tpa) 2 -maleimida, 0,975 mol, 6 equivalentes) em 600 ul de acetonitrilo.
Nota: Se a maleimida usado é solúvel em água, preparar uma solução de reserva em água em vez de acetonitrilo. É importante para a maleimida para ser solúvel no tampão de reacção. Dimetilsulfóxido, N, N-dimetilformamida, acetonitrilo e são comumente utilizados adjuvantes para auxiliar na dissolução de baixo peso molecular de 12, muitas vezes os reagentes de maleimida hidrofóbicos. - Prepara-se uma solução tampão contendo tampão fosfato 100 mM e 100 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, M w = 292,24 g / mol), que, quando diluídas para 20 mM a pH 7. Adiciona-se hidróxido de sódio sólido até que o EDTA é dissolvido (tipicamente vários gramas ) e ajustar o pH a 7.
- Dissolve-se 2,87 mg de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP 15, M w = 286,65 g / mol) em 1 ml de água ultrapura para preparar uma solução stock de 10 mM. Esta etapa é a importaçãoformiga para assegurar que a cisteína na proteína é completamente reduzido antes da maleimida acoplamento 15.
Nota: A solução stock de TCEP deve ser preparada de fresco para cada reacção, quando o reagente é susceptível a desactivação oxidativa em solução aquosa. - Combine 11,4 ml de água ultrapura com 3 ml de solução de partida de fosfato / EDTA 100 mM num tubo de plástico de 50 ml. Quando diluída ainda mais com soluções de proteína e banco de maleimida a concentração do tampão será de 20 mM.
Nota: Se a proteína a ser marcado é uma proteína transmembranar, assegurar que um detergente adequado é adicionado ao tampão para solubilizar a proteína. Se um detergente não é utilizada a proteína de membrana pode-se lentamente precipitar, o que terá um impacto negativo rendimentos da reacção. Usar o detergente em todos os passos de purificação subsequentes. - Adicionar 0,15 umol (3 ml de uma solução a 50 ^ M, 1 equivalente) de purificado cit c para o tampão de fosfato-EDTA.
- Adicionar 7,5 mL do estoque solut TCEPde iões (0,075 mol, 0,5 equivalentes) à solução de proteína e deixar de se agitar durante 5 minutos para reduzir qualquer proteína que pode ter dimerizado devido à oxidação de cisteína.
Nota: Não adicione TCEP se a proteína de interesse não dimerize prontamente. Verifique isto executando um gel de proteína, sob condições não redutoras. - Adicionar 600 ul da solução de acetonitrilo de Ru (II) (tpa) 2 -maleimida para a solução reduzida, tamponada de citocromo C, e deixar a mistura reaccional sob agitação, no escuro, à TA, durante 24 h.
- Concentra-se a mistura de reacção usando filtros de spin 3,5 kDa MWCO, centrifugação a 3000 xg, repetindo-se 2-3 vezes com tampão fosfato 20 mM fresco até que o filtrado corre claro. Remover o máximo de maleimida que não reagiu a partir da mistura reaccional quanto possível antes que a próxima etapa de purificação.
Nota: Neste ponto, a mistura de bioconjugação em bruto pode ser armazenado no frigorífico, no escuro. É importante remover a tintura maleimida que não reagiu por centrifuge diálise antes da armazenagem como a maleimida pode-se lentamente e de forma não específica reagir com resíduos de lisina na superfície da proteína.
3. Purificação de citocromo c bioconjugados
- Dissolve-se 2,4 g de di-hidrogenofosfato de sódio e 29,22 g de cloreto de sódio em 1 L de água ultrapura para preparar uma solução tampão contendo 20 mM de NaH 2 PO 4 e NaCl 0,5 M. Este é o tampão de corrida para a purificação por cromatografia de afinidade de metal-imobilizado (IMAC).
- Dissolve-se 17 g de imidazol (M w = 68,077 g mol-1) em 500 ml de 20 mM de NaH 2 PO 4 e tampão de 0,5 M de NaCl. Este é o tampão de eluição para a purificação IMAC.
- Ajustar o pH de ambas as memórias intermédias para pH 7 utilizando 1 M de NaOH ou HCl, e filtrá-los através de membranas de 0,22 um antes da utilização de celulose regenerada na FPLC.
- Como as colunas IMAC comprados são enviados sem quaisquer iões metálicos carregados no colUMN, preparar a coluna para um de Ni 2+ com base na purificação por lavagem da coluna com 3 ml de água ultrapura, 3 ml de solução de acetato de níquel de 100 mM, e 6 ml de água ultrapura. Se a coluna não é para ser utilizada imediatamente através de lavar 3 ml de etanol a 20% e armazenar a coluna no frigorífico para prevenir o crescimento bacteriano.
- Anexar uma Ni 2+ -loaded 1 ml coluna IMAC ao FPLC entre o septo de injecção e detector UV-Vis.
- Equilibrar a coluna com 3 volumes de coluna de fosfato de 20 mM, tampão de NaCl 0,5 M utilizando uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min.
- Carga de 100 ul de mistura de reacção em bruto (filtrado através de um filtro de seringa de 0,22? M) na coluna de Ni 2+ IMAC. Lavar a coluna com 3 volumes de coluna de tampão de corrida para eluir não reagiu cyt C, seguido por um gradiente de imidazole 0-125 mM ao longo de 3 volumes de coluna para eluir o ruténio bisterpyridine-citocromo c bioconjugado (Ru (II) -CYT c) .
- Lavou-se a column com tampão de imidazole 250 mM para 5 volumes de coluna, em seguida, re-equilibrar a coluna com fosfato 20 mM, NaCl 0,5 M e repetir o passo 3.7 até que todo o bioconjugado em bruto foi purificado.
- Reunir as fracções Bioconjugate e concentrá-los usando um kDa MWCO filtro de rotação 3.5, centrifugação a 3.000 x g.
- Carregar o bioconjugado concentrado em 3,5 cassetes de diálise kDa MWCO e diálise contra ultrapura água durante a noite, com 2 mudanças de água.
- Determinar a concentração da solução bioconjugado puro, concentrou-se por UV-Vis, utilizando o mesmo valor de absortividade molar de iso-1 citocromo C (97,6 mM -1 cm -1) a 410 nm. Tipicamente, a concentração bioconjugado é da ordem de 50 - 100 pM.
- Divida bioconjugado em 25 mL alíquotas e mantenha congelado a -20 ° C até serem necessárias.
4. Caracterização do citocromo C bioconjugados
- dissuadirminação da massa bioconjugado por MALDI-TOF MS
- Dissolve-se 10 mg de ácido cafeico, em 1 ml de uma solução de acetonitrilo / água / ácido trifluoroacético (80: 20: 0,1, v / v / v).
- Dilui-se 5 ul de solução de proteína concentrada com 5 ul de solução de ácido cafeico.
- Ponto de 0,5 uL de solução de ácido cafeico na placa alvo de MALDI e permitir que a solução seque.
- Ponto de 0,5 ul da solução da amostra / matriz em cima deste local ácido cafeico, permitir que o local para secar. Manchar mais 0,5 ul de matriz da amostra no topo desta para "sanduíche" a amostra entre as camadas de matriz e deixar secar.
- Adquirir espectros de massa no modo linear usando as configurações de instrumento adequado para proteínas 16.
- Investigação de bioconjugados por electroforese em gel
- Preparar 10 ul de cada amostra de proteína para ser executado por diluição de amostras de proteína pré-misturados com sulfato de dodecilo de lítio (LDS, pH 8,4) tampão (4x) tOA concentração final de aproximadamente 20 ug por poço. Para poços que requerem condições de redução, adicionar 1 ul de ditiotreitol 500 mM (DTT) agente (10x) de redução.
- amostras de calor a 70 ° C durante 10 min.
- Adicionar 50 ml da pré-mistura 1 M de MES, 1 de base Tris, 2% de SDS, 20 mM de EDTA (pH 7,7) executando mistura tampão (20x) de uma fonte comercial e 950 ml de água ultrapura para preparar o tampão de gel de escoamento.
- Remover o pente de plástico a partir do gel e colocar o gel no tanque de gel de corrida. Encher o tanque com tampão de gel de corrida de modo que as cavidades são cobertas com tampão.
- amostras de carga com cuidado sobre a pré-moldado 12% Bis-Tris, de 1 mm, gel de 10 poços utilizando pontas de pipeta longos para ajudar no carregamento. Carregar o prestained 10 proteína marcador de peso molecular (3-188 kDa) num poço de meio do gel para auxiliar a análise.
- Submeter o gel a 200 V de voltagem constante durante 35 min.
- Corar o gel com uma solução de azul de Coomassie comercial durante 2 horas, e lava-se com ultrapágua ure por 48 hr.
- Determinação da pureza bioconjugado por espectroscopia UV-Vis
- Prepare a 120 ul de 5 uM soluções de Ru (II) (tpa) 2 -maleimida, iso-cit c 1, e Ru (II) -CYT C.
- Medir o espectro de linha de base da cuvete de quartzo contendo apenas água ultrapura, de 250 nm a 650 nm.
- Medir o espectro de cada componente, garantindo a cuvete é enxaguado e seco entre cada medição.
- Traça-se a absorvância de cada componente como uma função do comprimento de onda, e comparar a soma linear dos materiais de partida com o produto final para determinar se uma proporção de 1: 1 de Ru (II) (tpa) 2 -maleimida para cit c reagiu.
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Representative Results
A sintese de bioconjugados é confirmada por três métodos principais: laser assistida por matriz de Dessorção Ionização Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS), electroforese em gel de poliacrilamida, e no ultravioleta-visível de espectroscopia (UV-VIS), como mostrado nas Figuras 2, 3 e 4. Um aumento de massa correspondente à massa da molécula pequena anexado, e a falta de uma proteína que não reagiu demonstra o êxito da ligação covalente de Ru (II) (tpa) 2 -maleimida para cyt C e subsequente purificação do bioconjugado. O espectro de UV-Vis do bioconjugado permite a produção a ser calculada com a absorvância a 410 nm, e por comparação do espectro a um 1 predito: espectro de uma adição dos materiais de partida da composição do bioconjugado pode ser inferida. No exemplo acima, o rendimento varia um pouco de lote-a-lote, mas geralmente entre 15-27% após FPLC Purificação 15.
Além disso, o aparecimento de um novo pico no cromatograma durante a purificação confirma a síntese de uma nova espécie. Isto é exemplificado na Figura 5, onde a análise das diferentes traços de UV-vis pode indicar se ou não uma espécie contém o Ru (II) componente de maleimida (tpa) 2.
Figura 2. MALDI-TOF Espectros de Massa de proteínas. Os espectros de massa de puro iso-1 citocromo c (preto) e Ru (II) -CYT c (vermelho). Os picos podem ser observado que correspondem às massas calculadas de iso-1 citocromo C (12.706 Da) e Ru (II) -CYT C (13559 Da) com um produto de adição de ácido cafeico visível a 179 Da. Este aducto é visto em quantidades mais elevadas na citocromo c s que não reagiupectra devido a uma reacção entre o α, β carbonil-insaturado do ácido cafeico e o tiol livre da proteína sob condições de MALDI-alta energia. aductos de matriz são geralmente vistos em MALDI-MS e pode ser tanto covalentes e não-covalentes na natureza. Spectra são linha de base corrigido, o ruído filtrado, e normalizados para comparação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. SDS-PAGE de proteínas. 12% de gel de Bis-Tris de reduzida e não reduzida cit c e Ru (II) c -CYT. Pista 3 contém um padrão de proteína pré-manchado, com a massa polipeptídeo anotados à direita de cada banda (kDa). Por favor clique aqui para ver uma versio maiorn desta figura.
Figura 4. espectros UV-Vis de Proteínas: O espectro de absorção de Ru (II) c -CYT (verde) corresponde estreitamente à adição linear (azul tracejada) de pura, que não reagiu cit c (vermelho) que não reagiu e de Ru (II) ( tpa) 2 maleimida (preto). Isso demonstra que o bioconjugado consiste em um 1:. Anexo 1 da maleimida à proteína Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Cromatograma da purificação Ni-IMAC de bioconjugates: trace IMAC de Ru (II) -CYT c purificação. UV-Vis traça: 410 nm corresponde à banda de Soret do CYt c, 280 nm corresponde a ambos cit c e Ru (II) (tpa) 2 maleimida, e 475 nm corresponde à banda de transferência de carga metal-ligante do (II) complexo de ruténio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Purificação das matérias-primas antes de uma bioconjugação é de extrema importância. As proteínas obtidas a partir de fontes recombinantes comerciais muitas vezes contêm outros isoformas da proteína de interesse, que pode ter a química de superfície e reactividade diferente. Por exemplo, no bioconjugação descrito, o cit disponível comercialmente c contém uma mistura de ambos iso-1 e iso-2 cit c 12,14,17. Iso-2 e as formas de citocromo c 1 iso-são em grande parte homóloga, com a principal diferença sendo a presença de um resíduo cisteína livre próximo do terminal C da norma ISO-1 citocromo C. No exemplo aqui, a purificação é conseguida com uma solução aquosa forte FPLC de permuta catiónica, no entanto, outras formas de FPLC de permuta aniónica tal como, de afinidade, hidrófoba ou cromatografia de exclusão de tamanho podem ser mais aplicável. A proteína também é reduzida neste passo para garantir que o resíduo de cisteína na proteína de interesse (aqui citocromo c) é fully reduzido antes da bioconjugação com o alvo ligado a maleimida. Além disso, é útil para determinar se a molécula pequena anexado-maleimida para ser usado com uma cisteína contendo proteína é pura e que a maleimida não foi submetido a uma reacção em armazenagem, como maleimidas são leves e sensível à temperatura. Isto pode ser rápida e facilmente verificados por 1 H NMR, como os protões vinílicos de uma maleimida intacta aparece como um singuleto a 6-6,5 ppm, ao passo que os protões de uma maleimida aberta irá deslocar bem distante; e também espectrometria de massa, com um anel de maleimida aberto correspondendo a um aumento de massa 18 Da.
Escolha tampão, pH, e a inclusão de adjuvantes, tais como detergentes, solventes orgânicos, agentes redutores e irá ter um efeito profundo sobre os rendimentos bioconjugação 5,15. No caso de uma adição de Michael de um tiol e uma maleimida, o pH deve ser superior a 6 ainda abaixo de 8 para uma rápida reacção, específica para a ocorrer. Abaixo de pH 6, a especificidade é tão altaa maleimida não será capaz de reagir com quaisquer aminas, mas o tiol é protonado e, portanto, é um nucleófilo fraco de adição de Michael que conduz a uma reacção lenta. Acima de pH 8, resíduos de lisina de superfície pode tornar-se desprotonada e maleimidas reagem com disponíveis, conduzindo a uma ligação covalente não específica do componente maleimida com a proteína. tampão de fosfato é utilizado neste bioconjugação porque é um forte tampão neste intervalo de pH e não interactue com qualquer dos reagentes. Tris (hidroximetil) aminometano (TRIS), por exemplo, seria uma escolha pobre como o grupo amina na presente memória intermédia podem potencialmente reagir com a maleimida, o que conduziria a fraco rendimento. Solubilidade de todos os reagentes também é fundamental para altos rendimentos. A adição de pequenas quantidades (<10% v / v) de solvente orgânico pode ajudar na dissolução dos componentes não-polares, enquanto que o pH e concentração de sal correcta são essenciais para manter as proteínas na solução e dobrado 12. Para grandes protei membranaNS com resíduos superficiais hidrófobos significativas, um agente tensioactivo irá ser necessário para evitar que a proteína de precipitação 18.
Se a proteína na bioconjugação é propenso a oxidação e a dimerização, tem sido mostrado a adição de um agente redutor tal como TCEP para melhorar o rendimento de bioconjugação 15. A redução in situ da proteína na sua forma monomérica, livre de tiol permite uma maior proporção de sítios activas de tiol para ser acedida pela maleimida. No entanto, a ordem de adição e a estequiometria é a chave para o sucesso de um aumento no rendimento de TCEP como também irão reagir com maleimida. Ao adicionar a maleimida após TCEP, o TCEP irá ser consumido através da redução da primeira proteína. A metade de um equivalente de TCEP a proteína é usada para o mesmo motivo, de modo que o excesso de TCEP não está disponível para reagir desfavoravelmente com a maleimida livre. pontes dissulfureto estruturais no interior da proteína não são susceptíveis de ser afectadas pela adição de TCEPou outros agentes redutores, tais como DTT, desde que a proteína não é realizada em condições desnaturantes, tais como a alta temperatura ou uma elevada concentração de ureia. Por exemplo, a adição de um grande excesso de DTT para CYT C antes da purificação por FPLC não tem um efeito significativo sobre a quantidade de proteína recuperada após purificação. Se se suspeita de redução das pontes de cisteína por TCEP estruturais, isto pode ser confirmado pela execução de um gel de proteína em condições nativas, não desnaturante.
O Ru (II) marcado com bisterpyridine citocromo c sintetizado no presente método é purificado através de Ni 2+ Cromatografia de Afinidade de Metal Imobilizado 14. Existem outros métodos de purificação, tais como cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia / anião de permuta catiónica, e cromatografia de afinidade específica, tal como uma fase estacionária anticorpo. Em geral, o método continua a ser o mesmo como descrito acima, com a concentração e a diálise passos following purificação cromatográfica para voltar o produto bioconjugado a um tampão adequado para o armazenamento.
O método principal de determinar se um bioconjugação é bem sucedido é através de MALDI-TOF MS. É a maneira mais precisa de determinar a pequena diferença de massa entre a proteína nativa e a proteína covalentemente marcada com uma molécula pequena, uma diferença de frequência inferior a 1.000 Da. A parte mais difícil de executar um experimento MALDI-TOF MS é a escolha da matriz e manchando técnica; No entanto ácido cafeico foi encontrado para ser um efeito fiável matriz, em geral para a análise das proteínas e bioconjugados utilizados neste trabalho. Como uma alternativa potencial, o ácido sinapinico é uma outra matriz MALDI comumente utilizado para a análise de proteínas. Análise dos dados de MALDI-TOF MS é relativamente simples. A Figura 2 mostra o espectro típico de MALDI-TOF MS de ambos puro iso-cit c 1 (M w = 12.706 Da) e Ru puro (II) -CYT C (HW = 13.559 Da), os quais correspondem de perto com a massa molecular calculada. A pureza pode ser também observado, indicando a falta de um iso-2 citocromo c pico de (M w = 12532 Da) no espectro que não reagiu e a falta de um iso-1 citocromo c pico no espectro bioconjugado. O bioconjugado de massa também pode ser estimada utilizando electroforese em gel. A Figura 3, um gel de Bis-Tris de proteína de 12%, proporciona duas evidências para bioconjugação. Em primeiro lugar, a ausência de uma banda de dimero sob condições não redutoras para Ru (II) -CYT C indica que já não é uma cisteína livre, e segundo, o ligeiro deslocamento da banda bioconjugado traduz para cima, para um aumento do peso molecular. Os geles de proteína são inestimáveis e pode definitivamente fornecer a prova de bioconjugação bem sucedida, não só para as pequenas anexos molécula, mas também para a síntese de dímeros de Proteína A de 5 ou bioconjugados de proteína de polímero-9.
para proteínascontendo cromóforos, tais como proteína fluorescente verde ou citocromos contendo heme, espectroscopia UV-Vis é utilizado para determinar a composição e rendimento do bioconjugado. O 1: adição 1 linear do espectros de materiais de partida permite a construção de um espectro de UV-Vis hipotética do bioconjugado, tal como mostrado na Figura 4 por comparação do espectro bioconjugado real para este 1:. Espectro de adição 1, a composição pode ser inferida . Por exemplo, se dois ou mais Ru (II) (tpa) 2 -maleimides tinha não especificamente ligadas à proteína, a banda de 480 nm do bioconjugado seria maior do que o espectro previsto. Além disso, a concentração do bioconjugado pode ser aproximado utilizando a 410 nm, valor de absortividade molar de 97,6 cm -1 mM -1. Isto é assumido ser a mesma para o bioconjugado porque o Ru (II) (tpa) 2 -maleimida tem absorvância mínimo nesta região.
Deve notar-se THAt bioconjugação através de química de cisteína-maleimida tem várias limitações. Em primeiro lugar, a proteína de interesse deve ter um único, resíduo de cisteína acessível, ou outra proteína de engenharia devem ser realizados para introduzir um. Em segundo lugar, a ligação cisteína-maleimida é susceptível de trocar com outros tióis livres, tais como albumina e glutationa no contexto de aplicações de plasma 19. Essa troca é altamente dependente da acessibilidade do solvente e taxa local na superfície da proteína. ligações maleimida-tiol pode ainda ser adequado para aplicações de plasma, mas a estabilidade de longa duração deve ser verificada utilizando espectroscopia de massa e de electroforese em gel.
Apesar disso, a elevada ligação altamente específica, dando origem a novas moléculas de corantes fluorescentes, tais como, os centros redox, polímeros, outras proteínas e de proteínas através de química de cisteína-maleimida é uma técnica poderosa que permite que uma série de construções macromoleculares interessantes para ser umccessed. Tendo grandes quantidades de bioconjugates proteína quimicamente bem definidas é fundamental para estudos futuros que envolvem localização de proteínas ligação às proteínas, a auto-montagem, cinética enzimática e. Como demonstrado acima, a partir de materiais de purificação, a escolha do meio de reacção, e a adição de reagentes suplementares, tais como agentes redutores ou agentes tensioactivos têm um impacto significativo sobre o rendimento de bioconjugação. A purificação é mais facilmente conseguida por cromatografia de proteína-compatível, e caracterização é realizada usando uma combinação de MALDI-TOF MS, electroforese em gel, e espectroscopia de UV-Vis.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 ml strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 ml IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | Extremely corrosive! Use caution. |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
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