Introduction
Измерение электроретинограмму (ЭРГ) и вызванный потенциал зрительного нерва (ВЭП) обеспечивают полезные количественные оценки целостности зрительного пути. ERG измеряет электрические реакции сетчатки к световой стимуляции, в то время как ВЭП измеряет соответствующую функциональную целостность зрительных путей от сетчатки к первичной зрительной коре следующий же светлым событием. Эта рукопись описывает протокол для записи и анализа ЭРГ и ЗВП ответов в широко используемом лабораторной модели, крысы.
ERG обеспечивает индекс функциональной целостности ряда ключевых классов клеток сетчатки путем количественной оценки валовой электрический ответ сетчатки к вспышке света. Согласованный ряд ионных потоков, инициирована света начало и окончание, производства обнаруживаемыми изменения напряжения, которые можно измерить с помощью поверхностных электродов, размещенных вне глаза. Полученный сигнал представляет собой сочетание себеРиз хорошо определенных компонентов, отличающихся по амплитуде, времени и частоте. Значительное число исследований показало, что эти компоненты относительно хорошо сохраняются во многих позвоночной сетчатке и что компоненты могут быть отделены друг от друга. При разумном выборе стимула (вспышки стимула, фон, межстимульный интервал) условий и выбора конкретных особенностей составного сигнала для анализа можно быть уверенным в возврате меру определенной группы клеток сетчатки глаза 1,2. Эти характеристики лежат в основе полезности и, следовательно, широкое применение ЭРГ в качестве неинвазивного измерения функции сетчатки глаза. Эта рукопись посвящена методологии измерения ЭРГ и анализа своих возможностей, чтобы возвратить информацию о некоторых из основных классов клеток в сетчатке, а именно фоторецепторов (компонент PIII), биполярные клетки (компонент PII) и ганглиозных клеток сетчатки (положительный скотопическое порог срабатывания или pSTR).
3. У грызунов, большинство (90 - 95%) волокон зрительного нерва от каждого глаза 4 пересекающийся под прямым углом и иннервируют контралатеральной среднего мозга. В отличие от ERG, это еще не представляется возможным приписать различные компоненты ВЭП к конкретным классам клеток, 5 , таким образом , изменяется в любом месте вдоль зрительного пути может повлиять на форму волны ВЭП. Тем не менее, ВЭП является полезным неинвазивным мерой зрительной эффективности и целостности зрительного пути. ВЭП, при использовании в сочетании с ERG, могут обеспечить более полную оценку зрительной системы (то есть, сетчатка / визуальный путь).
ЭРГ и ЗВП записи могут проводиться отдельно или в комбинации, в зависимости от примекатион. Методология, описанная в данной статье позволяет одновременно оценить и сетчатке корковой зрительных вызванных электрофизиологии от обоих глаз и обоих полушарий у наркотизированных крыс. Это полезный способ более полно оценить функцию сетчатки глаза и вверх по течению эффекты, что изменения в функции сетчатки может иметь на зрительной функции коры головного мозга вызывала.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с австралийским Кодекса практики по уходу и использованию животных в научных целях, установленный Национальным Советом по медицинским исследованиям здравоохранения и в Австралии. Зазор этика была получена из Мельбурнского университета, факультета наук, Комитета по этике животных (номер разрешения 0911322,1).
1. предимплантационной хронического ВЭП электродах
Примечание: Если одновременно ЭРГ и ЗВП сигналы должны быть собраны животные должны быть хирургическим путем имплантировали электроды ВЭП по крайней мере за 1 неделю до сигнала сбора.
- Стерилизацию хирургического скамью перед экспериментом путем очистки с хлоргексидином (0,5% в 70% этаноле). Автоклав все хирургическое оборудование перед использованием. Накройте животное с стерилизованную хирургической простыне. Убедитесь, что все экспериментаторы носить хирургические маски, халаты и стерилизовать перчатки.
- Индуцируют анестезия с 3 - 3,5% изофлуран с O 2 , при скорости потока 3 л / мин. Поддерживать ANEsthesia на уровне 1,5% и 2 л / мин в течение всего хирургического вмешательства. Обеспечить достаточную глубину анестезии при отсутствии лапа пинч рефлекса.
- Применяют 1% карбоксиметилцеллюлозы натрия на роговице, чтобы предотвратить высыхание глаз.
- Бритье 30 мм площадь х 30 мм на лоб, кзади от глаза и впереди ушей.
- Поместите животное на площадку тепла (37 ° С) для поддержания температуры тела и стабилизации головы животных с стереотаксической рамы.
- Лечить выбритый участок с 10% повидон-йода в три раза. Избегайте употребления алкоголя на основе антисептиков для области возле глаз, будучи в соответствии со стандартом практики изложены Ассоциацией хирургических технологов.
- Сделать средний сагиттальной разрез на голове с помощью скальпеля и от этого акциза круг диаметром ~ 20 мм кожной ткани подвергать черепной кости.
- Удалите основную надкостницы путем соскоба и сушки с марлей, чтобы выставить корональной и сагиттальной черепных швов.
- НасING зубной заусенцев, прикрепленного к дрели, трепанировать два отверстия (диаметр 0,7 мм, глубина ~ 1 мм) через череп на обоих полушарий на стереотаксической координат: 7 мм каудально брегмы, 3 мм сбоку от средней линии.
- Завинтить винты из нержавеющей стали (диаметр 0,7 мм, длина 3 мм, стерилизуется с хлоргексидином) в двух предварительно сделанных отверстий глубиной до ~ 1 мм (2 мм винта выставляется), чтобы позволить надежное крепление. Это связывается с Dura без повреждения основной ткани коры.
- Приготовьте хирургическую область для зубной амальгамы путем сушки черепной кости с марлей и втягивания дряблая кожа с двумя 3 - 0 наложения швов на ~ 4 и 8 часов.
- Спред зубной амальгамы над открытой черепа, чтобы закрепить винт электроды (винты из нержавеющей стали, описанные в пункте 1.10) на месте. Обеспечить ~ 1,5 мм винтов остаются открытыми для записи.
- Удалить втягивания швами.
- Вводят 0,5% карпрофен подкожно (5 мг / кг) в обезболивающих и насыщенным раствором соли (хлорида натрия 0,9%, 10,5 мл) подкожно для замены жидкости.
- Разрешить животных для восстановления в отдельных клетках. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее.
- Не вернуть животное в компании других животных, пока он не полностью восстановился после операции (минимум 5 дней).
- Продолжайте вводить 0,5% карпрофен подкожно в обезболивании (5 мг / кг) один раз в день в течение 4-х дней.
- Запись ЭРГ и ЗВП 1 неделю после операции.
2. ЭРГ и ЗВП записи
- Подготовка Сбор данных
- С помощью компьютерного программного обеспечения для одновременного запуска стимул и получать данные 2 в соответствии с настройками , рекомендуемыми ниже.
- Усилить сигналы 3 (ЭРГ: × 1000, ВЭП: x10,000) с коэффициентом усиления внутри установленного изолированной предварительного усилителя и усилителя, и с обоими глазами подобранных для импеданса.
- Установите частоту дискретизации для ЭРГ до 4 кГц в течение 650Окно записи Мс (2560 очков), Для этого нажмите на вкладку "временной базы" в программном обеспечении сбора данных (для имени и версии программного обеспечения смотрите таблицу материалов), выберите "2560" для образцов, и "500 мс" за время, которое возвратит окно записи 650 мс.
- Используйте тот же метод, чтобы установить частоту дискретизации для ППЭ до 10 кГц в течение 250 мс эпохи. Разрешить 10 мс до стимула базового уровня для обоих ЭРГ и ЗВП записей. Для этого перейдите на вкладку "Настройка"; выберите "Стимулятор", чтобы открыть новое окно диалога; В этом окне выберите "импульс" из выпадающего списка "Mode"; и установите значение "задержки" до "10 мс".
- Набор ERG полосовой фильтрации до 0,3 - 1000 Гц (- 3 дБ). Это делается, нажав кнопку "Bio Amplifier" в программном обеспечении сбора данных. Затем установите значение "High Pass" до "0,3 Гц", а значение для "низкого прохода" на "1 кГц".
- Используя метод в вышеупомянутую 2.1.1.3, установите настройки полосовых ВЭП до 0,1 - 100 Гц (- 3 дБ), а Международным обществом рекомендованной клинической электрофизиологии зрения (ISCEV) для человеческих ЗВП записей 6.
- С помощью компьютерного программного обеспечения для одновременного запуска стимул и получать данные 2 в соответствии с настройками , рекомендуемыми ниже.
- подготовка электродов
- Специально сделать ЭРГ активным / неактивным и ВЭП активный / неактивный электроды путем присоединения серебряной проволоки или зажим аллигатора к электродной свинца, соответственно 2. Коммерчески получить заземляющий электрод.
- Для 4 заказных электродов, вырезать мужской конец от расширения электрода свинца. Удалить 1 см наружного изоляционного покрытия из политетрафторэтилена с скальпелем обеспечивая внутренний провод не поврежден.
- Предварительно моды ЭРГ неактивные электроды резанием длиной 70 мм из серебряной проволоки (толщиной 0,3 мм) и образуя петлю ~ 8 мм в диаметре, чтобы окружить глаз крысы. Подготовить однородный круг, формируя петлю на пипетки 1 мл.
- Предварительно моды ЭРГ активные электроды путем разрезания длиной 30 мм серебряной проволоки и образуя небольшую петлю, чтобы аккуратно контакт с роговицей крысы (~ 1-2 мм в диаметре)
- Надежно закрепите электроды (2 ЭРГ активные, 2 ERG неактивным, 1 ВЭП неактивным) к электроду свинца переплетая серебро с открытой внутренней проволоки.
- Изолировать избыток открытых металлических частей с помощью клейкой ленты, чтобы уменьшить фотоэлектрические артефакты.
- На неактивные электроды ERG воткнуть небольшой кусочек с крючками и липучка (~ 5 мм × 20 мм) с помощью клейкой ленты, чтобы позволить стабильное крепление к ремню с грызунами шеи.
- Прикрепите крокодил к внутреннему проводу электрода приводит сделать активные электроды ВЭП.
- До начала записи, гальванизирует открытые поверхности серебряных проволок (то есть неактивный кольцо и Actiве TIP) с хлоридом с использованием источника 9 В постоянного тока в течение 20 секунд для улучшения сигнала проводимости.
- Чтобы сделать это, погрузить серебряный наконечник провода электрода ERG (действующий в качестве анода первичной ячейки) в нормальном физиологическом растворе; а другой конец этого провода электрода к положительному полюсу 9 В батареи.
- Подключите другой провод (катод) к отрицательной клемме аккумуляторной батареи, и погрузите другой конец в физиологическом растворе, а также. Отключите через 20 сек и наблюдать щепка кончик электродной проволоки ERG должна быть покрыта равномерно белого цвета.
Примечание: Подготовка новых электродов ЭРГ для каждой экспериментальной сессии (~ до 8 часов), чтобы обеспечить проходимость покрытия хлорида.
- подготовка животных
- Темно-адаптировать животных в течение ночи (≥ 8 ч) до записи в светонепроницаемый комнате. Обеспечить максимальную адаптацию к темноте, отключив комнате свет, закрыть все двери и жалюзи. Сведение к минимуму утечки света, разместив светонепроницаемыми материалы вокругстыки дверей / окон и размещение экранов компьютеров за пределами толстыми черными шторами.
- Провести подготовку животных в темной комнате с помощью тусклый красный светоизлучающий диод (LED; 17,4 cd.m -2, X макс = 600 нм) для поддержания чувствительности стержня.
- Обезболить крысе путем инъекции кетамина / ксилазина (60: 5 мг / кг) внутримышечно. Confirm достаточную глубину анестезии при отсутствии лапа пинч рефлекса.
- Для поддержания седативного эффекта, вводить дополнительную дозу анестезии (50% от начальной дозы) после того, как 50 минут, если это необходимо.
- Для получения дополнительной местной анестезии применяют одну каплю 0,5% proxymetacaine для каждого глаза, и моргания лишнюю жидкость.
- Для расширением зрачка применяют одну каплю 0,5% тропикамид для каждого глаза, а затем высушить лишнюю жидкость.
- ЭРГ и ЗВП позиционирования электрода
- Поместите животное на платформе ERG перед миской Ganzfeld, расположенной в клетке Фарадея. Не используйте электрическую грелку, поскольку Cввести электрический шум в электрофизиологических записей. Примечание: Платформа крепится к распространенной нагретой платформы воды для поддержания температуры тела.
- Безопасное животное на платформу с полосой с крючками и липучка помещенного твердо, но не плотно вокруг затылка.
- Крючок неактивный электрод ВЭП вокруг нижних резцов наркозом крыс.
- Расположите электроды неактивные ЭРГ окружив склеры кольцо неинвазивным вокруг экватора глаза. Стабилизировать это путем присоединения электродов к крючками и липучка полосы вокруг затылка. Повторите эти действия для второго глаза.
- Закрепить ВЭП активные электроды путем присоединения зажимами для нержавеющей стали винтов предварительно имплантированных на черепе.
- Поместите небольшую каплю 1% карбоксиметилцеллюлозы натрия на роговицу до размещения активного электрода ЭРГ для улучшения качества сигнала. Примечание: вискоза жидкость также помогает поддерживать гидратации роговицы на протяжении экспериментов с миниMize образование усыхание типа катаракты у грызунов 7.
- Поместите небольшую каплю 1% карбоксиметилцеллюлозы натрия на нижних резцах, чтобы улучшить контакт пассивный электрод ВЭП и, таким образом, качество сигнала.
- Расположите активные электроды ЭРГ слегка прикоснуться к центральной поверхности роговицы с помощью микроманипулятора, прикрепленный к заказного стереотаксической руку.
- Вставка 2 - 5 мм наземном игольчатого электрода (нержавеющая сталь) подкожно в хвост.
- При необходимости высушить любую лишнюю жидкость из нижнего века перед записью для улучшения качества сигнала.
- Slide платформа ближе к шару Ganzfeld обеспечивая глаза животного согласовывались с отверстием чаши, чтобы включить равномерное освещение обеих сетчаток (см шаг 2.4.1).
- Закройте клетку Фарадея, чтобы уменьшить посторонний шум.
- Сбор данных
- Используйте тусклый тест-вспышки (- 0,52 журнал cd.sm -2) , чтобы оценить , является ли электрод placemлор является удовлетворительным 2. В условиях контроля это привело бы к амплитуде эрг ~ 800 мкВ и вариабельность глаз от не более чем на 10%. При необходимости репозиции электродов.
- После тест-вспышки позволяют животным приспособиться к темноте в течение 10 минут в полной темноте до записи.
- Современные вспышки световых раздражителей, используя миску Ganzfeld при сборе ЭРГ и ЗВП сигналы одновременно в течение мс временного окна ~ 500. Прогресс от диммер ярче уровень света, чтобы сохранить достаточную темно-адаптации для конкретных форм сигналов.
- Сбор сигналов в диапазоне световых энергий, чтобы вызвать STR, б-волны и A / B-волновые формы волны ЭРГ. Средние больше сигналов на диммер уровня освещенности (20 повторов) и в меньшей степени на более яркую светящихся энергий (1 повтор). Постепенно удлинять интервал между стимула от 1 до 180 сек от тусклой до самого яркого уровня освещенности. Приведены в таблице 1 для примера протокола.
- Для ISOпоздно палочек и колбочек ответов ЭРГ, используют спаренных флэш парадигмы 8. Инициировать четыре вспышки в 1,52 журнала cd.sm -2 с 500 мс между стимулом интервал 2 между ними. Цифровым вычесть форму волны конуса (3 - й или 4 - й вспышки) из смешанного сигнала (1 - й вспышки) , чтобы получить предполагаемую реакцию стержня.
- Для записи ВЭП сигналов, в среднем 20 повторений на яркие светящиеся энергии (то есть, - от 0,52 до 1,52 журнал cd.sm -2, 5 сек интервал между раздражителем). Обратите внимание, что первая вспышка в этой последовательности возвращает обычный темно-адаптированный ответ ERG.
- Разрешить 1 - 3 мин для повторной адаптации после того, как (20) ВЭП подметает до следующего более ярким ЭРГ шагом, в зависимости от световой энергии.
- После завершения сбора данных, эвтаназии наркотизированных животное с инъекцией внутрисердечного натрия фенобарбитала (325 мг / мл, 3 мл).
| форма волны | Стимул световой энергии (журнал cd.sm -2) | Количество повторов | межстимульный интервал (сек) |
| STR | -6,24 | 20 | 2 |
| STR | -5,93 | 20 | 2 |
| STR | -5,6 | 20 | 2 |
| STR | -5,33 | 20 | 2 |
| Род б-волна | -4,99 | 10 | 2 |
| Род б-волна | -4,55 | 10 | 2 |
| Род б-волна | -4,06 | 5 | 5 |
| Род б-волна | -3,51 | 5 | 5 |
| Род б-волна | -3,03 | 1 | 15 |
| Род б-волна | -2,6 | 1 | 15 |
| Род б-волна | -1,98 | 1 | 15 |
| Смешанное а- / б-волна | -1,38 | 1 | 30 |
| Смешанное а- / б-волна | -0,94 | 1 | 30 |
| Вспышка 1: Смешанный A- / B-волны в среднем 20: ВЭП | -0,52 | 20 | 5 |
| (90 секунд до следующего) | |||
| Вспышка 1: Смешанный A- / B-волны в среднем 20: ВЭП | 0.04 | 20 | 5 |
| (120 секунд до следующего) | |||
| Вспышка 1: Смешанный A- / B-волны в среднем 20: ВЭП | 0,58 | 20 | 5 |
| (180 секунд до следующего) | |||
| Flasч 1: Смешанный A- / B-волны в среднем 20: ВЭП | 1.2 | 20 | 5 |
| (180 секунд до следующего) | |||
| Вспышка 1: Смешанный A- / B-волны в среднем 20: ВЭП | 1,52 | 20 | 5 |
| (180 секунд до следующего) | |||
| Конус а- / б-волна | 1,52 | 4 | 0,5 |
Таблица 1. ERG и Протокол ВЭП Запись с использованием ряда Стимул энергии. Стимул презентации прогресс от тусклого (сверху) до ярких (внизу) мигает, с достаточным интервалом между стимул для обеспечения темной адаптации. В конце протокола, повторение четырех вспышек с коротким интервалом представлен, чтобы вызвать конус опосредованной реакции.
3. Анализ ЭРГ осциллограмм
Примечание: ЭРГ и ЗВП анализ был подробно описан ранее 3,9,10 The.В следующих разделах содержится краткий обзор.
- Экспорт сигналов в цифровом формате напряжения времени в электронную таблицу программного обеспечения для анализа данных.
- Род photoreceptoral функция
- Модель передний край а-волны PIII с задержкой гауссовского (уравнение 1) 11.
PIII (я, т) = Кт PIII ∙ [1 - ехр (- я ∙ S (т - т д) 2)] при Т> d (уравнение 1) - Оптимизация подгонку по ансамблю двух ярких светящихся энергий 12,13 (т.е., 1,22 и 1,52 журнала cd.sm -2).
- Модель до 90% от амплитуды а-волны , чтобы избежать пост-receptoral интрузии 14.
Примечание: Модель возвращает насыщенную амплитуду (Кт PIII, мкВ), чувствительность (S, м 2 .cd -1 .с -3) и задержку (т д, мс) от photoreceptoral ответа.
- Модель передний край а-волны PIII с задержкой гауссовского (уравнение 1) 11.
- Род биполярная клетка функцион
- Цифровым вычесть модель PIII (см выше) из смешанных форм волны, чтобы вернуть смешанную PII с вышележащих колебательные потенциалов.
- Для извлечения PII стержня из смешанного PII, в цифровой форме вычитают ответ конуса (3 - й или 4 - й вспышки в 1,52 журнала cd.sm -2) из смешанного PII (1 - й вспышки на 1,52 журнала cd.sm -2).
- Затем примените фильтр низких частот, а в форме волны (46,9 Гц, -3 дБ, окно Blackman), чтобы удалить колебательные потенциалы. Оставшийся сигнал жезла ответ PII 10.
- Извлечь максимальную амплитуду стержень PII и построить его против всех интенсивностей стимула (ниже -2 журнала cd.sm -2 и стержневой изоляции на 1,52 PII журнала cd.sm -2) 10.
- Модель этих данных с помощью гиперболической функции (уравнение 2), который обеспечивает измерение внутренней целостности ретинальных клеток.
V (I) = V макс (я п / (я п+ К п)) (уравнение 2)
Примечание: Это уравнение возвращает максимальный ответ PII (V макс, мкВ), 1 / чувствительность (к, журнал cd.sm-2) и наклон функции (п) 15.
- Конус функция биполярная ячейка
Примечание: В ответ конус берется при одной интенсивности (1,52 журнал cd.sm -2) амплитуда и сроки будут перенастроены на этом уровне света.- Извлечь максимальный конус PII ответ 2,16.
- Экстракт неявный , к которому этот максимальный ответ соответствует 2,16.
- Функция ганглиозных клеток
- Поскольку STR является небольшой сигнал, применить фильтр нижних частот с частотой 50 Гц с выемкой формы сигнала для устранения высокой частоты и шумов на линии (46,9 Гц, -3 дБ, окно Blackman).
- Извлечь ответ максимальное pSTR 3,17.
- Экстракт неявный , к которому этот максимальный ответ соответствует 3,17.
4. Анализис ЗВП осциллограмм
- Извлечение максимальных и минимальных компонентов ВЭП (P1, N1 и P2). Для подробно ссылки см 3,6.
- Экспресс амплитуды как корыто до пика амплитуд от их предыдущего пика или корыто (p1n1 и N1P2). 3,6
- Выдержка времени неявное (это) , к которому эта максимальная соответствует ответ (P1 это, N1 это, P2 она) 3,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ERG а-волна (> -1,38 журнал cd.sm -2), б-волны (> - 4,99 журнал cd.sm -2) о подозрительных операциях (<- 4,99 журнал cd.sm -2) и вепсы (> - 0,52 журнал cd.sm -2) записывались одновременно (рис 1 и 3). При очень тусклые вспышки, положительная СТР (pSTR) рассматривается приблизительно 110 мс после вспышки, а отрицательное СТР (НСТР) приблизительно при 220 мс (фиг.1 и 2). ЭРГ с большим б-волны, пики от 50 до 100 мс после начала умеренной вспышки , которая может быть проанализирован на его реакции PII (фиг.1 и 2). На этот стимул энергии, отрицательное а-волны до пика незначительна. При ярче светящихся энергиях отрицательное отклонение а-волна становится более заметным , которая может быть определена количественно с ответом PIII (рисунок 2). Скотопическое ВЭП сигнал показывает отрицательный ответ (p1n1, 15 - 70 мс окна), а затем положительное отклонение (N1P2; 30 - 100 мс) (3 и 4).
Рисунок 1. Группа Средние ERG осциллограмм. ЭРГ изменяет с увеличением интенсивности стимула. Цифры слева от сигнала указывают световой экспозиции, используемый для выявления формы сигнала. Обратите внимание на различные амплитуды и временные шкалы для каждой панели. При тусклых светящихся энергий положительные и отрицательные компоненты скотопического порога реакции может быть вызвана (pSTR, НСТР). Как энергии стимула получить ярче, а и Ь-волны ответ может быть проанализирована и парный вспышка парадигма позволяет ответ конуса необходимо измерить. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
pload / 54158 / 54158fig2.jpg "/>
Рисунок 2. ERG анализ. (A) Rod функция фоторецепторов может быть проанализирована с помощью PIII для моделирования на волну. A-волны в 1,22 и 1,52 журнала cd.sm -2 (незаполненные кружки, ○) подходят как ансамбль с PIII (серые линии, уравнение 1) до 90% от минимума , который возвращает Rm PIII (насыщенный амплитудой, мкВ) S (чувствительность, м 2 .cd -1 .с -3) и тд (задержка синхронизации, мс) параметры. (B) Rod функцию биполярного клеток (среднее ± SEM) могут быть проанализированы с помощью моделирования серии отклика интенсивности на PII стержня (незаполненные кружки ○) с функцией Нака-Раштон (серая линия). Это возвращает V макс (насыщенный амплитуду, мкВ), к (1 / чувствительность, бревенчатый кд см -2) и п (наклон). (С) Ретинальная функция ганглиозных клеток анализируют при тусклом светящихся энергий и количественно пиковой амплитудой pSTR (pSTR ампер) и времени (pSTR него (D) Конус биполярное функции клеток выявляется с парного флэш парадигмы количественно конуса PII пиковой амплитуды (конус PII ампер) и времени (конус PII его). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Группа ВЭП Среднее осциллограмм. Форма сигнала ВЭП изменяет с увеличением энергии стимула. Числа слева от сигнала указывают световой экспозиции , используемый для выявления формы сигнала. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
FIGURe 4. ВЭП анализа и функции интенсивности отклика. (A) Amplitude анализ ВЭП берется в качестве пика до корыта (p1n1) и впадины до пика (N1P2) амплитуды. Неявные раз (она) этих ответов также возвращается (P1 это, N1 это, P2 это). (В) Амплитуда ВЭП p1n1 (среднее ± SEM) возрастает с увеличением энергии стимула. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ЭРГ и ЗВП объективные показатели зрительной функции от сетчатки и коры головного мозга, соответственно. Преимущество одновременной записи является то, что более полное представление всего зрительного пути, обеспечивает ее. В частности, дополнительная информация от их одновременной оценки могли бы обеспечить более четкое разграничение места повреждения в зрительного пути (например, для лечения расстройств с перекрытием ERG еще отличаются ВЭП проявлений 18, когда оптическая невропатия может сосуществовать с первичной атрофии головного мозга 19, 20, или когда потеря ВЭП могут быть искажены проявления травм в нескольких местах в зрительного пути 21,22). Путем измерения ЭРГ и ЗВП одновременно, показатель усиления между сетчатке и корковом ответ также может быть получена. Это может стать полезным инструментом для выявления тонких патологических изменений. Текущий протокол позволяет ЭРГ и ЗВП измерения в наиболее часто используемых лабораторных крыс, но может быть легко объявленияЭптед для других видов млекопитающих 23-25. ЭРГ и ЗВП сигналы от грызунов обеспечивают достаточную доклинические суррогат ответов , наблюдаемых в человеческих глазах 26-28.
При разработке конкретного протокола стимула, как ЭРГ и ЗВП ответ может быть получен в течение одного сеанса записи. Таблица 1 показывает прогрессию в легких уровнях с соответствующим учетом времени восстановления между последовательными вспышками. Этот протокол обеспечивает баланс между необходимостью максимального сигнала к шуму характеристики и ограничения времени записи в окне анестетика, предоставленной одной дозы кетамина: ксилазина. Следовательно, этот метод может быть полезен для объективной количественной меры зрительной функции для исследований в области основы физиологии и болезней.
Комплексная оценка зрительной системы может быть достигнуто при одновременном оценке двусторонних ответов сетчатки глаза и визуально навеянные корковых ответов, Тем не менее, каждый метод может быть также проведена в изоляции и монокулярно вместо бинокулярно для упрощения процедуры. Текущий протокол описывает скотопическими ЭРГ и ЗВП сигналы, выбранные для изоляции и стержневые пути при условии, что у крыс есть стержень с преобладанием сетчатку. Если свет адаптированный ответы больший интерес к изучению, можно также проводить Фотопическое ЭРГ и ЗВП сигналы путем предварительной адаптации к фоновым светом.
Одним из основных ограничений этого метода является необходимость проводить процедуру под наркозом условий для того, чтобы стабильное размещение электрода. Тем не менее этот подход обеспечивает устойчивые характеристики сигнала к шуму позволяет обнаружить тонкие изменения лечения.
Из-за малой амплитуды НТР и ее чувствительности к световой адаптации, несколько шагов, которые должны быть внимательно следили, чтобы обеспечить успешную запись этого ответа. Во-первых, достаточно, темная адаптация должна быть реализована, которая включает в себяночи адаптация к темноте (≥ 8 часов), размещение электродов при слабом красном освещении (17,4 cd.m -2, λ макс = 600 нм), и вновь адаптация к темноте после тусклом тест-вспышки (10 мин для - 0,52 кд журнал. см -2). Кроме того, характеристики сигнал-шум НТР может быть улучшена путем усреднения по множеству сигналов (то есть, 20 сигналов) , собранных с короткими интервалами между раздражитель (то есть, 2 сек). Одним из преимуществ этой комплексной оценки обоих глаз и кортикальных является , чтобы позволить сравнение с контрлатеральной 3 записи. Таким образом , особое внимание должно быть принято в электродной решений (то есть, те же размеры и форму электродов), чтобы обеспечить минимальный среди глаз и между корковой изменчивость.
Принимая во внимание широкое использование обоих методов ЭРГ и ЗВП , чтобы обеспечить в естественных условиях мер зрительного пути и ее процессов , связанных с болезнью, было бы полезно для сопоставления Другой путь конкретного рrotocols (например, ON / OFF или конусной подтипу конкретного), а также одновременно выполнять записи ERG / ВЭП с различными условиями стимулирования (например, мерцание, картины, пилообразных) , чтобы расширить применение этой методики в клинических диагнозов. Еще одним логическим шагом этого приложения в будущем будет также записывать ЭРГ и ЗВП одновременно с осознанной 29, свободно движущихся животных , чтобы избежать влияния на анестезирующие нервной физиологии 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alligator clip | generic brand | HM3022 | Stainless steel 26 mm clip for connecting VEP screw electrodes to cables |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML 135 | For amplifying ERG and VEP signals |
| Carboxymethylcellulose sodium 1.0% | Allergan | CAS 0009000-11-7 | Viscous fluid for improving signal quality of the active ERG electrode |
| Carprofen 0.5% | Pfizer Animal Health Group | CAS 53716-49-7 | Proprietary name: Rimadyl injectable (50 mg/ml). For post-surgery analgesia, diluted to 0.5% (5 mg/ml) in normal saline |
| Chlorhexadine 0.5% | Orion Laboratories | 27411, 80085 | For disinfecting surgical instruments |
| Circulating water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | For maintaining body temperature of the anesthetized animal during surgery and electrophysiological recordings |
| Dental amalgam | DeguDent GmbH | 64020024 | For encasing the electrode-skull assembly to make it more robust |
| Dental burr | Storz Instruments, Bausch and Lomb | #E0824A | A miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws |
| Drill | Bosch | Dremel 300 series | An automatic drill for trepanning |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier |
| Faraday Cage | custom-made | Ensures light proof to maintain dark adaptation. Encloses the Ganzfeld setup to improve signal to noise ratio | |
| Gauze swabs | Multigate Medical Products Pty Ltd | 57-100B | For drying the surgical incision and exposed skull surface during surgery |
| Ganzfeld integrating sphere | Photometric Solutions International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size | |
| Velcro | VELCRO Australia Pty Ltd | VELCRO Brand Reusable Wrap | Hook-and-loop fastener to secure the electrodes and the animal on the recording platform |
| Isoflurane 99.9% | Abbott Australasia Pty Ltd | CAS 26675-46-7 | Proprietary Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery |
| Ketamine | Troy Laboratories | Ilium Ketamil | Proprietary name: Ketamil Injection, Brand: Ilium. Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording |
| Luxeon LEDs | Phillips Lighting Co. | For light stimulation twenty 5 W and one 1 W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the ERG active electrode during recordings |
| Needle electrode | Grass Telefactor | F-E2-30 | Subcutaneously inserted in the tail to serve as the ground electrode for both the ERG and VEP |
| Phenylephrine 2.5% minims | Bausch and Lomb | CAS 61-76-7 | Instilled with Tropicamide to achieve maximal dilation for ERG recording |
| Povidone iodine 10% | Sanofi-Aventis | CAS 25655-41-8 | Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML 785 | Controls the LEDs |
| Proxymetacaine 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 5875-06-9 | For corneal anaesthesia during ERG recordings |
| Saline solution | Gelflex | Non-injectable, for electroplating silver wire electrodes | |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus via the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make active and inactive ERG electrodes, and the inactive VEP electrode |
| Stainless streel screws | MicroFasterners | 0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length to be implanted over the primary visual cortex and serve as the active VEP electrodes | |
| Stereotaxic frame | David Kopf | Model 900 | A small animal stereotaxic instrument for locating the primary visual cortices according to Paxinos & Watson's 2007 rat brain atlas coordinates |
| Surgical blade | Swann-Morton Ltd. | 0206 | For incising the area of skin overlaying the primary visual cortex to implant the VEP electrodes |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,Ltd | 3-0 silk braided suture non-absorbable, for skin retraction during VEP electrode implantation surgery | |
| Tobramycine eye ointment 0.3% | Alcon Laboratories | CAS 32986-56-4 | Proprietary name: Tobrex. Prophylactic antibiotic ointment applied around the skin wound after surgery |
| Tropicamide 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 1508-75-4 | Proprietary name: 0.5% Mydriacyl eye drop, Instilled to achieve mydriasis for ERG recording |
| Xylazine | Troy Laboratories | Ilium Xylazil-100 | Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording |
| Pipette tip | Eppendorf Pty Ltd | 0030 073.169 | Eppendorf epTIPS 100 - 5,000 ml, for custom-made electrodes |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | spreadsheet software for data analysis |
| Lethabarb Euthanazia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | LETHA450 | 325 mg/ml pentobarbital sodium for rapid euthanazia |
References
- Nguyen, C. T. O., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Dietary omega-3 fatty acids and ganglion cell function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3586-3594 (2008).
- Weymouth, A. E., Vingrys, A. J. Rodent electroretinography: methods for extraction and interpretation of rod and cone responses. Prog Retin Eye Res. 27, 1-44 (2008).
- Tsai, T. I., Bui, B. V., Vingrys, A. J. Effect of acute intraocular pressure challenge on rat retinal and cortical function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 1067-1077 (2014).
- Cowey, A., Franzini, C. The retinal origin of uncrossed optic nerve fibres in rats and their role in visual discrimination. Exp Brain Res. 35, 443-455 (1979).
- Weinstein, G. W., Odom, J. V., Cavender, S. Visually evoked potentials and electroretinography in neurologic evaluation. Neurol Clin. 9, 225-242 (1991).
- Odom, J. V., et al. Visual evoked potentials standard (2004). Doc Ophthalmol. 108, 115-123 (2004).
- Ridder, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).
- Nixon, P. J., Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. The contribution of cone responses to rat electroretinograms. Clin Experiment Ophthalmol. 29, 193-196 (2001).
- Bui, B. V., et al. Using the electroretinogram to understand how intraocular pressure elevation affects the rat retina. J Ophthalmol. 2013, 262467 (2013).
- Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Dietary omega-3 fatty acids and ganglion cell function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3586-3594 (2008).
- Hood, D. C., Birch, D. G. A quantitative measure of the electrical activity of human rod photoreceptors using electroretinography. Vis Neurosci. 5, 379-387 (1990).
- Birch, D. G., Hood, D. C., Locke, K. G., Hoffman, D. R., Tzekov, R. T. Quantitative electroretinogram measures of phototransduction in cone and rod photoreceptors - Normal aging, progression with disease, and test-retest variability. Arch Ophthalmol. 120, 1045-1051 (2002).
- Bui, B. V., Vingrys, A. J. Development of receptoral responses in pigmented and albino guinea-pigs (Cavia porcellus). Doc Ophthalmol. 99, 151-170 (1999).
- Robson, J. G., Saszik, S. M., Ahmed, J., Frishman, L. J. Rod and cone contributions to the a-wave of the electroretinogram of the macaque. J Physiol. 547, 509-530 (2003).
- Severns, M. L., Johnson, M. A. The care and fitting of Naka-Rushton functions to electroretinographic intensity-response data. Doc Ophthalmol. 85, 135-150 (1993).
- Bui, B. V., Fortune, B. Origin of electroretinogram amplitude growth during light adaptation in pigmented rats. Vis Neurosci. 23, 155-167 (2006).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. J Physiol. 555, 153-173 (2004).
- Tremblay, F., Laroche, R. G., Debecker, I. The Electroretinographic Diagnosis of the Incomplete Form of Congenital Stationary Night Blindness. Vision Res. 35, 2383-2393 (1995).
- Bayer, A. U., Keller, O. N., Ferrari, F., Maag, K. P. Association of glaucoma with neurodegenerative diseases with apoptotic cell death: Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Am J Ophthalmol. 133, 135-137 (2002).
- Wostyn, P., Audenaert, K., De Deyn, P. P. An abnormal high trans-lamina cribrosa pressure difference: A missing link between Alzheimer's disease and glaucoma. Clinical Neurology and Neurosurgery. 110, 753-754 (2008).
- Yucel, Y. H., Zhang, Q. A., Weinreb, R. N., Kaufman, P. L., Gupta, N. Effects of retinal ganglion cell loss on magno-, parvo-, koniocellular pathways in the lateral geniculate nucleus and visual cortex in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 22, 465-481 (2003).
- Gupta, N., Yucel, Y. H. What changes can we expect in the brain of glaucoma patients. Survey of Ophthalmology. 52, 122-126 (2007).
- Kong, Y. X., et al. Impact of aging and diet restriction on retinal function during and after acute intraocular pressure injury. Neurobiol Aging. 33, 1115-1125 (2012).
- Bui, B. V., Sinclair, A. J., Vingrys, A. J. Electroretinograms of albino and pigmented guinea-pigs (Cavia porcellus). Aust N Z J Ophthalmol. 26, Suppl 1 98-100 (1998).
- Jobling, A. I., Wan, R., Gentle, A., Bui, B. V., McBrien, N. A. Retinal and choroidal TGF-beta in the tree shrew model of myopia: isoform expression, activation and effects on function. Exp Eye Res. 88, 458-466 (2009).
- Robson, J. G., Frishman, L. J. Dissecting the dark-adapted electroretinogram. Doc Ophthalmol. 95, 187-215 (1998).
- Robson, J. G., Frishman, L. J. The rod-driven a-wave of the dark-adapted mammalian electroretinogram. Prog Retin Eye Res. 39, 1-22 (2014).
- Hudnell, H. K., Boyes, W. K. The comparability of rat and human visual-evoked potentials. Neurosci Biobehav Rev. 15, 159-164 (1991).
- Charng, J., et al. Conscious wireless electroretinogram and visual evoked potentials in rats. PLoS One. 8, e74172 (2013).
- Hetzler, B. E., Berger, L. K. Ketamine-Induced Modification of Photic Evoked-Potentials in the Superior Colliculus of Hooded Rats. Neuropharmacology. 23, 473-476 (1984).
