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Biology

Immunohistochemical और Immunofluorescent विश्लेषण के लिए आंतों के ऊतकों तैयारी के लिए स्विस रोलिंग तकनीक में सुधार

Published: July 13, 2016 doi: 10.3791/54161
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Department of Medicine, Stony Brook University School of Medicine, 2Department of Physiology & Biophysics, Stony Brook University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

सटीक पहचान और आंतों mucosal अस्तर के साथ उपकला कोशिकाओं का स्थान अलग सेल प्रजातियों को परिभाषित करने के लिए आवश्यक हैं। आंतों के ऊतकों के समुचित इमेजिंग अधिकतम संकल्प के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न की पहचान के लिए महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन प्रसंस्करण माउस आंतों के ऊतकों के लिए इष्टतम तरीके और शर्तों को चित्रित करना है।

Introduction

स्तनधारी आंतों उपकला स्तंभ कोशिकाओं की एक परत शामिल हैं। छोटी आंत में, proliferative कोशिकाओं तहखाने तक ही सीमित हैं, जबकि विभेदित कोशिकाओं अंकुर क्षेत्र पर कब्जा। हालांकि, क्योंकि वहाँ बड़ी आंत में कोई विल्ली हैं, proliferative कोशिकाओं तहखाने के नीचे करने के लिए स्थानीय कर रहे हैं और विभेदित कोशिकाओं तहखाने के ऊपरी क्षेत्र पर कब्जा। (- 5 दिनों के बारे में 3) है कि तहखाने के भीतर proliferative कोशिकाओं की निरंतर विभाजन से प्रेरित है आंतों उपकला तेजी पुनःपूर्ति आए। तहखाने के proliferative कोशिकाओं को एक सजातीय आबादी नहीं कर रहे हैं और आगे स्टेम कोशिकाओं और पारगमन amplifying (टीए) कोशिकाओं 1 में विभाजित कर रहे हैं। बहुत नीचे 2 से 5 कोशिकाओं - स्टेम सेल, तहखाना के तल पर रहते हैं पहले 4 के भीतर। रिजर्व मौन स्टेम कोशिकाओं तहखाना आधार स्तंभ (सीबीसी) स्टेम कोशिकाओं और: मौजूदा मॉडल स्टेम कोशिकाओं के दो प्रकार के अस्तित्व का समर्थन करता है। सीबीसी रोंमंदिर की कोशिकाओं को सक्रिय रूप से फैल रहे हैं और leucine अमीर दोहराने युक्त जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर 5 (Lgr5) 3, 4 Olfactomedin (Olfm4) 4 और Achaete कछुआ की तरह 2 (Ascl2) 5 से चिह्नित कर रहे हैं। दूसरी ओर, रिजर्व मौन स्टेम कोशिकाओं बी सेल विशिष्ट Moloney murine ल्यूकेमिया वायरस एकीकरण साइट 1 (BMI1) 6, माउस टेलोमिरेज रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (mTert) 7 से चिह्नित कर रहे हैं, हॉप homeobox (Hopx) 8, Doublecortin की तरह है और सीएएम Kinase की तरह 1 (Dclk1) 9, और leucine-रिच को दोहराता है और इम्यूनोग्लोबिन-जैसे डोमेन 1 (Lrig1) 10। सक्रिय रूप से proliferating स्टेम कोशिकाओं को फिर अवशोषण कोशिकाओं (एन्तेरोच्य्तेस) और स्रावी कोशिकाओं (enteroendocrine, जाम, Paneth, और गुच्छा कोशिकाओं) में आगे भेदभाव से गुजरना टीए कोशिकाओं को जन्म दे। proliferative क्षेत्र में सतत कोशिका विभाजन तहखाना-अंकुर अक्ष के साथ उपकला कोशिकाओं के ऊपर आंदोलन में परिणाम है, जब तक वे विल्ली, जहां वे apoptosis से गुजरना और कर रहे हैं के शीर्ष तक पहुँचनेउपकला की सतह से बंद sloughed। आंतों उपकला कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के अलग प्रोटीन (जैसे, आंतों जाम कोशिकाओं लाइसोजाइम के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ Muc2 और Paneth कोशिकाओं के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ धुंधला द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है) की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। हम homeostasis और आंतों उपकला 11-13 की pathobiology में Krüppel-जैसे कारकों (KLFs) की भूमिका का अध्ययन। यहाँ प्रस्तुत एक संशोधित स्विस रोलिंग तकनीक की व्यवहार्यता का समर्थन परिणामों Krüppel-जैसे कारक के 5 (KLF5) को सक्रिय रूप proliferating आंतों उपकला स्टेम कोशिकाओं को 14 के रखरखाव में भूमिका के पिछले अध्ययनों पर आधारित हैं। KLF5 एक जस्ता उंगली प्रतिलेखन कारक है कि अत्यधिक सक्रिय आंतों स्टेम कोशिकाओं और टीए 12 में व्यक्त किया जाता है। पिछले अध्ययनों से दिखा दिया है कि KLF5 Ki-67, आंतों तहखाने में एक ज्ञात proliferative मार्कर के साथ सह व्यक्त की है।

जठरांत्र टीआर अधिनियम के एक संरचनात्मक रूप से या कार्यात्मक सजातीय ऊतक नहीं है। छोटी आंत के उत्तरार्द्ध आगे समीपस्थ, मध्य, और बाहर भागों में विभाजित के साथ, ग्रहणी, सूखेपन और लघ्वान्त्र और अंधान्त्र और पेट में बड़ी आंत में बांटा गया है। इन वर्गों के प्रत्येक अद्वितीय ऊतकीय सुविधाओं की है और अलग-अलग भूमिकाओं 15 निभाता है। जैसे, अपमान का प्रभाव और आंतों उपकला की प्रतिक्रिया की डिग्री अध्ययन ऊतक 16 के क्षेत्र पर निर्भर हो सकता है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न चूहों उपभेदों के अध्ययन के 16 में इस्तेमाल किया अपमान के प्रकार के आधार पर ऊतकीय स्तर पर प्रतिक्रिया की विविधता को प्रदर्शित करता है। इस प्रकार, ऊतक तैयारी करारा उचित ऊतकीय और आंतों के ऊतकों की आणविक विश्लेषण की अनुमति के लिए आवश्यक है। जैसे, एक समय में आंतों उपकला की पूरी लंबाई के स्विस रोल तकनीक अनुदान विश्लेषण और इस प्रकार व्यापक जानकारी के आधार पर अच्छी तरह से वाकिफ निष्कर्ष ascertains।

e_content "> स्विस रोल तकनीक पहले मैगनस 17 से उल्लेख किया गया था, और Moolenbeck और Ruitenberg और पार्क एट अल द्वारा विस्तार से वर्णन किया। के रूप में ऊतकों की तैयारी कर रहा है और ऊतकीय प्रदर्शन के लिए एक विधि कृंतक आंत 18,19, क्रमशः। प्रोटोकॉल का विश्लेषण करती है इस प्रकाशन में चित्रित मूल तरीका है कि नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए समय पर और विश्वसनीय ऊतक तैयारी के लिए परमिट की एक उन्नत संस्करण प्रस्तुत करता है। इस संशोधित तकनीक कुशल संग्रह और ऐसे immunohistochemistry, immunofluorescence, साथ ही सर्वत्र इस्तेमाल की तकनीक, के लिए आंतों उपकला की तैयारी के लिए अनुमति देता है सीटू संकरण में (फ्लोरोसेंट और chromogenic 20) के रूप में। इसके अलावा, तैयारी विधि नमूना संशोधित ऊतक आसानी से उपलब्ध है और अपेक्षाकृत सस्ती अभिकर्मकों तेजी से ऊतक निर्धारण करने की एक विधि की पेशकश करते हुए अतिरिक्त मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल करता है और प्रोटीन, डीएनए की वसूली के लिए अनुमति देता है, और आरएनए। लिया एक साथ, थीतकनीक आंतों उपकला की, histopathological रोग, और आणविक सुविधाओं की व्यापक मूल्यांकन के लिए उत्कृष्ट है।

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Protocol

1. चूहे

  1. चूहों से जुड़े सभी अध्ययनों स्टोनी ब्रूक विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया। चूहों एक 0:12 मानव संसाधन प्रकाश अंधेरे चक्र पर बनाए रखा गया।
    1. व्यावसायिक रूप से C57BL / 6 चूहों प्राप्त करते हैं। C57BL / 6 Klf5 alleles loxP साइटों से घिरे (Klf5 एफ एल / एफ एल) ले जाने के लिए चूहों प्राप्त करते हैं। इन चूहों पहले 21 में वर्णित किया गया और विनय डॉ Ryozo Nagai द्वारा प्रदान की।
  2. C57BL / 6 Lgr5 प्रमोटर (Lgr5-EGFP / CreERT2 चूहों) के विनियमन के तहत inducible Cre recombinase जीन ले जाने चूहों खरीदें।
  3. Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 एफ एल / एफ एल चूहों की स्थापना करने के लिए, पार Klf5 FL / एफ Lgr5-EGFP / CreER टी 2 चूहों के साथ और फिर Klf5 FL / एफ एल संतान बैकक्रॉस एल चूहों चूहों।
  4. प्रोटोकॉल के अनुसार tamoxifen के साथ इलाज चूहों पहले 22 में वर्णित है। tamoxifen के 1 मिलीग्राम (10 मिलीग्राम / एमएल), बाँझ मक्का का तेल में भंग के साथ 8 सप्ताह पुराने प्रयोगात्मक और नियंत्रण चूहों intraperitoneally (आईपी) इंजेक्षन, लगातार 5 दिनों के लिए।
  5. पहले tamoxifen के इंजेक्शन के बाद 14 दिन पर, उन्हें 2 गैस स्रोत सीओ से जुड़े एक कक्ष में रखकर उपयोग करते हुए सीओ 2 asphyxiation चूहों बलिदान। गैस चेंबर में प्रवाह करने के लिए जब तक चूहों बेहोश कर रहे हैं और सभी आंदोलन रहता है की अनुमति दें। इच्छामृत्यु ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए।

2. ऊतक तैयारी और स्विस रोलिंग

  1. विच्छेदन संदंश और कैंची का प्रयोग, पेट की ओर की त्वचा में एक चीरा काट दिया। संदंश की एक जोड़ी के साथ, चीरा पर त्वचा पकड़ और धीरे पेट की मांसपेशियों के ऊतकों से दूर खींच। पेट की त्वचा में कटौती और पेट की मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें।
  2. पकड़ो और पीई तक खींचसंदंश के साथ ritoneum। पकड़े जाने के लिए नहीं है और आंतों में खींच सुनिश्चित करें। ध्यान से पेरिटोनियल ऊतक में एक चीरा बनाने के लिए और त्वचा दूर काटने पेट की मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए जारी है। ध्यान से पेट की मांसपेशियों में एक चीरा बनाने और आंतों को बेनकाब करने के लिए उन्हें दूर काटने जारी है।
  3. पेट के पहचानें और बाहर का अंत जहां यह मिलती है मलाशय / गुदा के ट्रेस। कैंची की एक जोड़ी के साथ, संभव के रूप में गुदा खोलने के करीब के रूप में कटौती।
  4. पेट को पहचानें और पता लगाने के लिए जहां यह छोटी आंत के साथ जुड़ जाता है। कैंची की एक जोड़ी के साथ, आंत पेट से लगभग 1 सेमी की दूरी पर मुफ्त cut। फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) युक्त एक साफ पेट्री डिश के लिए मुक्त कर दिया छोटी आंत और पेट की पूरी लंबाई के स्थानांतरण।
  5. एक हाथ या संदंश की एक जोड़ी के साथ, पेट के बाहर का अंत पकड़ और दूसरे हाथ का उपयोग धीरे किसी भी mesenteric संयोजी और / या वसा ऊतकों से पेट के की पूरी लंबाई को जानने के लिए।
  6. अंधान्त्र पहचानें(छोटी और बड़ी आंत के बीच छोटी थैली) और कटौती जहां अंधान्त्र और पेट (पेट के समीपस्थ अंत) में शामिल होने के पेट के मुक्त करने के लिए।
  7. एक हाथ या संदंश की एक जोड़ी के साथ, छोटी आंत पकड़ और दूसरे हाथ का उपयोग धीरे किसी भी mesenteric संयोजी और / या वसा ऊतकों से छोटी आंत की पूरी लंबाई को जानने के लिए। अंधान्त्र दूर काटें और अगर वहाँ के लिए कोई जरूरत नहीं है त्यागें।
    नोट: इस प्रक्रिया में (DH 2 हे 50% इथेनॉल / 5% एसिटिक एसिड) संशोधित Bouin लगानेवाला में आंतों बाहर विच्छेदित incubating द्वारा यहां रोका जा सकता है रातोंरात और अगले दिन प्रक्रिया जारी है।
  8. आंत (छोटी आंत या पेट) का एक खंड हैंडलिंग, संशोधित Bouin लगानेवाला के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज भरने और इसे करने के लिए एक gavage सुई देते हैं। आंतों खंड के पूर्वकाल खोलने में आधा सेंटीमीटर के बारे में सुई डालें।
  9. एक साधन के साथ फर्म दबाव लागू करने से आंतों खंड के अंदर gavage सुई पकड़ोआंतों खंड पर। दूसरी ओर सिरिंज धारण के साथ, संशोधित Bouin लगानेवाला का उपयोग कर आंतों खंड की सामग्री को फ्लश करने के लिए कोमल, लेकिन लगातार दबाव लागू होते हैं। यह कदम आंतों खंड और तत्काल निर्धारण के एक साथ सफाई की अनुमति देता है। प्रवाह के माध्यम से अपशिष्ट इकट्ठा करने के लिए एक पेट्री डिश का प्रयोग करें। फिक्सेशन पेट के रंग अपारदर्शी मोड़ से मनाया जा सकता है।
    नोट: निस्तब्धता या आंतों खंड खुला फट सकता है के दौरान बहुत अधिक दबाव लागू करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें।
  10. कैंची का प्रयोग, mesenteric रेखा के साथ longitudinally आंतों खंड खोलने काटा। संदंश की एक जोड़ी के साथ यह पकड़ो और पीबीएस युक्त एक पेट्री डिश में संक्षेप में यह कुल्ला।
    1. समीपस्थ, मध्य, और बाहर: 3 बराबर खंडों में छोटी आंत कट। समीपस्थ खंड एक के तुरंत पेट पीछा कर रहा है, और बाहर का खंड पेट के पहले एक तुरंत है। समीपस्थ क्षेत्र के लिए ग्रहणी, सूखेपन के मध्य, और बाहर के बराबर हैलघ्वान्त्र।
    2. प्रत्येक खंड के लिए समीपस्थ और बाहर का अंत निशान। समीपस्थ अंत एक है कि मूल रूप से पेट की ओर इशारा कर रहा था, और बाहर का बृहदान्त्र की ओर इशारा किया है।
  11. साफ और खोला आंतों खंड जगह के लिए एक पेट्री डिश के ऊपर का प्रयोग करें। ल्यूमिनल ओर ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ आंतों खंड रखें।
    1. पेट के लिए, variegations / इसकी चौड़ाई भर में चल रहे लकीरें द्वारा ल्यूमिनल पक्ष की पहचान करने और समीपस्थ अंत में मौजूद हैं। मध्य और डिस्टल क्षेत्रों कुछ variegations कि longitudinally चला है। छोटी आंत के लिए, किसी न किसी तरह से दिखने सतह है, जो विल्ली के निशान से ल्यूमिनल पक्ष की पहचान।
      नोट: छोटी आंत के लिए, वहाँ समीपस्थ, मध्य और डिस्टल क्षेत्रों में से कोई बाहरी स्थूल शरीर रचना सीमांकन कर रहे हैं। हालांकि इन क्षेत्रों खुर्दबीन के नीचे वर्गों में पहचान सकते हैं हो सकता है। वे कहाँ हैं विल्ली distally समीपस्थ क्षेत्र में सबसे लंबे समय तक रहे हैं और धीरे-धीरे कम होलंबाई में कम से कम। सूक्ष्म, colonic तहखाने समीपस्थ क्षेत्र में जो भी लकीरें की मौजूदगी से पहचाना जा सकता है में कम से कम कर रहे हैं। colonic तहखाने बाहर का क्षेत्र में midsection में सबसे बड़ा और छोटा अभी तक अभी भी समीपस्थ क्षेत्र की तुलना में लम्बे हैं।
  12. स्विस पेट के रोलिंग के साथ आगे बढ़ें:
    1. पेट के फ्लैट खुला रखें और पेट्री डिश के किनारे की ओर अपने समीपस्थ अंत से संदंश के साथ इसे खींच।
    2. ल्यूमिनल पक्ष का सामना करना पड़ रखें और एक हाथ से संदंश के साथ समीपस्थ अंत पकड़ और दूसरे हाथ से एक दंर्तखोदनी पकड़ो।
    3. दंर्तखोदनी के आसपास समीपस्थ अंत के किनारे लपेटें संदंश का उपयोग कर और थोड़ा दंर्तखोदनी के खिलाफ लपेटा बढ़त चुटकी यह जगह में पकड़ करने के लिए।
    4. और धीरे धीरे उंगलियों के साथ दंर्तखोदनी रोलिंग एक स्विस रोल के लिए फार्म दंर्तखोदनी चारों ओर पेट के रोल करने के लिए शुरू करते हैं।
    5. एक बार पूरे बृहदान्त्र लंबाई तक लुढ़का कर दिया गया है, ध्यान से ग स्लाइड करने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करेंOlon दंर्तखोदनी बंद और एक ऊतक प्रसंस्करण / -embedding कैसेट में स्विस रोल। रात भर कमरे के तापमान पर 10% बफर formalin में कैसेट रखें।
  13. स्विस छोटी आंत रोलिंग के साथ आगे बढ़ें:
    1. एक समय में एक खंड हैंडलिंग, ऊपर फ्लैट ल्यूमिनल पक्ष के साथ खुला खंड रखने के लिए और पेट्री डिश के किनारे की ओर अपने समीपस्थ अंत से संदंश के साथ इसे खींच।
    2. के रूप में पेट के लिए वर्णित स्विस रोलिंग के साथ आगे बढ़ें।
  14. आयल embedding के लिए formalin तय ऊतकों के प्रसंस्करण के साथ आगे बढ़ें। निम्नलिखित के रूप में आगे बढ़ें:
    नोट: एक स्वचालित प्रोसेसर का उपयोग करें (सामग्री और उपकरणों के विवरण के लिए)।
    1. जबकि ऊतक कैसेट में है, पीबीएस के साथ ऊतक कुल्ला जब तक लगानेवाला पूरी तरह से हटा दिया जाता है।
    2. 10 मिनट के लिए 10 मिनट, 10 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, 10 मिनट के लिए 100% इथेनॉल, 100% इथेनॉल के लिए 10 मिनट, 80% इथेनॉल के लिए 10 मिनट, 70% इथेनॉल के लिए 50% इथेनॉल: ऊतक निम्न क्रम में इथेनॉल का उपयोग निर्जलीकरण , और 110 मिनट के लिए 00% इथेनॉल।
    3. निम्नलिखित क्रम में xylene के साथ एक्सचेंज इथेनॉल: 2: 1 इथेनॉल: 10 के लिए xylene - 15 मिनट, 1: 1 इथेनॉल: 10 के लिए xylene - 15 मिनट, 1: 2 इथेनॉल: 10 के लिए xylene - 15 मिनट, 100% 10 के लिए xylene - 15 मिनट, 10 के लिए 100% xylene - 15 मिनट और 10 के लिए 100% xylene - 15 मिनट। चेतावनी: ज़ाइलीन स्वास्थ्य के लिए खतरा है, इस प्रकार कार्यस्थल एक उचित डाकू और उचित सुरक्षा उपकरण कर्मियों द्वारा पहनी जानी चाहिए के साथ एक स्थानीय निकास वेंटिलेशन के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए है।
    4. आयल के साथ एक्सचेंज xylene। : 2: 1 xylene: 30 मिनट के लिए आयल, 1: 1 xylene: 30 मिनट के लिए आयल, 1: 2 xylene: 30 मिनट के लिए आयल, 100% आयल के लिए 58 डिग्री सेल्सियस - ओवन 54 के लिए सेट एक निर्वात में निम्न चरणों का प्रदर्शन 1 - 2 घंटा, और 1 के लिए 100% आयल - 2 घंटा या रात।
      नोट: मत देना आयल समय की लंबी अवधि के लिए 60 डिग्री सेल्सियस से अधिक है क्योंकि इस आयल पॉलिमर नीचा और यह कठिन और भंगुर कर देगा।
    5. डे के रूप में नए नए आयल और ओरिएंट के ऊतकों में एम्बेडजन्म से पहले आयल मज़बूत बनाता है। स्विस रोल के लिए, ऊतक paraffinization के बाद, यह महत्वपूर्ण आयल embedding के दौरान अपने पक्ष पर प्रत्येक रोल का स्थान है। यह सुनिश्चित करता है कि काटने के दौरान, प्रत्येक रोल की पूरी लंबाई के वर्गों का उत्पादन किया जाएगा।
  15. धुंधला के लिए, microtome का उपयोग कर 5 माइक्रोन मोटी वर्गों में कटौती। आरोप लगाया स्लाइड पर वर्गों लीजिए और उन्हें (सेंकना) ओवन रात भर एक 65 डिग्री सेल्सियस में सूखे; कमरे के तापमान को शांत और बाद में उन्हें धुंधला के लिए इस्तेमाल करते हैं।
    नोट: पकाना समय 1 से छोटा किया जा सकता है - कैसे ताजा कटौती स्लाइड कर रहे हैं पर निर्भर करता है 2 घंटा। अगर सेक्शनिंग के बाद से एक महीने से भी कम है, तो यह रातोरात सेंकना करने के लिए सलाह दी जाती है। यह एक महीने से भी अधिक हो गया है, तो 1 - पाक के 2 घंटा समय बचाने के लिए पर्याप्त है। अगर समय से बाहर चल रहे हैं, रात भर समर्थन हमेशा इस्तेमाल किया जा सकता है।

3. histological विश्लेषण और immunofluorescence धुंधला

ऊतकीय विश्लेषण और immunoflu प्रदर्शन करनाorescence धुंधला के रूप में पहले 23,24 वर्णित है, संशोधनों के साथ। बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) immunofluorescence के लिए:

  1. 1 घंटे के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में सेंकना स्लाइड अंतर्जात क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि को निष्क्रिय करने के लिए और बाद में xylene में deparaffinize।
  2. अंतर्जात ऊतक पराक्सिडेजों ब्लॉक करने के लिए मेथनॉल में 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के एक स्नान में वर्गों सेते हैं; तो ऊष्मायन से 10 मिनट के लिए 125 डिग्री सेल्सियस पर (10 मिमी सोडियम साइट्रेट, 0.05% बीच 20, पीएच 6.0) एक कम शराब स्नान श्रृंखला (100%, 95%, 70%) साइट्रेट बफर समाधान में प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के द्वारा पीछा में rehydrate एक decloaking कक्ष का उपयोग।
  3. ऊतक वर्गों के चारों ओर एक चक्र ड्रा कलम कि हाइड्रोफोबिक बाधा प्रदान करता है अंकन का उपयोग और बफर (2.5% गोजातीय सीरम albumin [बीएसए] टीबीएस-बीच में), 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ EGFP के खिलाफ (अवरुद्ध और फिर कमजोर पड़ने 1 के साथ वर्गों सेते : 4 डिग्री सेल्सियस पर 500) रातोंरात एक humidified कक्ष में जबकि धीरे मिलाते हुए।
  4. वर्गों धो लें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए उचित एकाग्रता में फ्लोरोसेंट टैग माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं।
  5. Hoechst के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी उपचार और दाग नाभिक के बाद स्लाइड्स धो लें और बढ़ते मीडिया के साथ माउंट।
    1. Klf5 / EGFP / Ki-67 सह-धुंधला के लिए, प्रक्रिया स्लाइड कदम 3.1 में वर्णित के रूप में - 3.3 और Klf5 एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने 1: 150) के साथ incubating द्वारा Klf5 धुंधला प्रदर्शन रात भर।
    2. प्रोटोकॉल के अनुसार स्लाइड करने के लिए खरगोश एपी बहुलक का पता लगाने को लागू करें।
    3. Klf4 निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार वर्णकोत्पादक प्रतिरक्षाऊतकरसायन धुंधला का उपयोग धुंधला हो प्रकट करते हैं।
    4. पहले से वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर 25 एंटीबॉडी क्षालन प्रदर्शन करना। ग्लाइसिन-एसडीएस में 50 डिग्री सेल्सियस (पीएच 2.0) 1 घंटे के लिए आंदोलन के साथ समाधान पर स्लाइड सेते हैं।
    5. धो आसुत पानी से अच्छी तरह स्लाइड और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए (टीबीएस-बीच में 2.5% बीएसए) बफर रोकने के साथ सेते हैं।
    6. की-67 जोड़े (कमजोर पड़ने 1: 500) और EGFP (कमजोर पड़ने 1:500) एक साथ एंटीबॉडी और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    7. (नहीं दिखाया डेटा) Hoechst साथ धुंधला से पहले उचित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ फ्लोरोसेंट का पता लगाने के प्रदर्शन और बढ़ते मध्यम के साथ माउंट।
  6. Hematoxylin और eosin (एच एंड ई), 26 के साथ 5 माइक्रोन वर्गों धुंधला पर ऊतकों के histological आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें। फ्लोरोसेंट छवियों के लिए, क्रमशः EGFP, Klf5, और की-67 धुंधला कल्पना करने के लिए, 535, 646, और 700 के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें।

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Representative Results

immunohistochemical धुंधला के साथ संयोजन में स्विस रोलिंग तकनीक छोटी या बड़ी आंतों के ऊतकों का व्यापक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। एक C57BL / 6 माउस (चित्रा 1) की एक बड़ी आंत के एच एंड ई धुंधला के उदाहरण व्यवहार्यता का रेखांकन और इस तकनीक के प्रभाव है। समीपस्थ, मध्य, और बाहर: जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, छवि पेट के सभी भागों पर कब्जा करने में सक्षम है। इस प्रकार, यह व्यापक ऊतकीय मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। स्विस रोलिंग और छोटी या बड़ी आंतों के ऊतकों की पूरी लंबाई कब्जा करने की क्षमता विषम जीन अभिव्यक्ति और मार्कर धुंधला या अपमान करने के लिए आंतों के ऊतकों की एक चर प्रतिक्रिया के लिए अत्यंत उपयोगी है।

एक उदाहरण Lgr5-EGFP / CreER टी 2 चूहों में EGFP धुंधला पैटर्न है। इस माउस मॉडल में, EGFP की अभिव्यक्ति के द्वारा संचालित हैLgr5 प्रमोटर, जो केवल सक्रिय रूप से proliferating आंतों तहखाने में सक्रिय है। (10% - लगभग 5) transgene अभिव्यक्ति की penetrance साथ ही, इस माउस मॉडल कम की विशेषता है। चित्रा 2 में दिखाया गया है, आंतों के ऊतकों में EGFP अभिव्यक्ति पैटर्न चर रहा है। नतीजतन, क्षमता ऊतक का एक बड़ा दृश्य पर कब्जा करने के लिए ब्याज के क्षेत्र की पहचान करने में मदद करता है।

तकनीक यहाँ वर्णित विशेष रूप से multifluorophore धुंधला के आवेदन के साथ शक्तिशाली है। यहाँ, हम आंतों के ऊतकों कि स्विस रोल तकनीक का उपयोग कर तैयार किया गया था की trifluorophore धुंधला का एक उदाहरण दिखा। इस अध्ययन का मुख्य उद्देश्य आंतों स्टेम कोशिकाओं Lgr5 मार्कर व्यक्त करने का रखरखाव में Klf5 की भूमिका की जांच करने के लिए किया गया था। इसलिए, हम Lgr5-EGFP / CreER टी 2 चूहों में Lgr5 पॉजिटिव आंतों स्टेम सेल से Klf5 नष्ट कर दिया और दिन पर आंतों के ऊतकों एकत्र14 पहले tamoxifen के इंजेक्शन के बाद। immunohistological विश्लेषण के लिए, ऊतकों EGFP (Lgr5 मार्कर), Klf5, और की-67 के लिए इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल, और धुंधला प्रदर्शन किया गया था के अनुसार तैयार किए गए थे। चूहों पर नियंत्रण, Lgr5-EGFP / CreER टी 2 के रूप में चिह्नित है, दोनों EGFP पॉजिटिव (नीले तीर के साथ चिह्नित) और EGFP नकारात्मक तहखाने (सफेद तीर के साथ चिह्नित) का प्रदर्शन किया दो की जांच की समय बिंदुओं पर Klf5 और की-67 के लिए सह-धुंधला में के रूप में चित्रा 3 डी में दिखाया गया है। इसके विपरीत, Lgr5-EGFP / CreER टी 2 में / Klf5 FL / FL छोटी आंतों के ऊतकों, Klf5 / Ki-67 सह-धुंधला EGFP पॉजिटिव सीबीसी स्टेम कोशिकाओं से लापता था (नीले तीर से चिह्नित), लेकिन वर्तमान EGFP नकारात्मक तहखाने, हरे तहखाने (सफेद तीर से चिह्नित) सटे रूप में चित्रा 3H में दिखाया गया है। यह एक उत्कृष्ट उदाहरण है कि ऊतक तैयारी यहाँ प्रस्तुत तकनीक नकारात्मक धुंधला गुणवत्ता को प्रभावित नहीं करता है।


चित्रा 1. एच ई एक C57B एल / 6 माउस। दिखाया से एक बड़ी आंत का धुंधला बड़ी आंत की पूरी लंबाई के समग्र छवि है। काला तीर और काला लाइन के बीच भाग, समीपस्थ हिस्सा निशान काले और नारंगी लाइनों के बीच बीच के निशान, और नारंगी लाइन और नारंगी तीर के बीच बड़ी आंत के बाहर का हिस्सा निशान। स्केल बार = 1,000 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक Lgr5-EGFP / CreER टी 2 माउस की एक छोटी आंत का धुंधला हो जाना। ई के समग्र छविGFP (लेबलिंग Lgr5 पॉजिटिव उपकला कोशिकाओं) एक Lgr5-EGFP / CreER टी 2 माउस की छोटी आंत वर्गों के धुंधला हो जाना। प्रोटीन मार्कर (EGFP) कि Lgr5-EGFP / CreER टी 2 माउस के तहखाने में Lgr5-postive उपकला कोशिकाओं लेबल की विषम immunofluorescence धुंधला का उदाहरण है। नाभिक Hoechst के साथ कल्पना कर रहे हैं। व्हाइट तीर EGFP अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक तहखाने निशान। स्केल बार = 500 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
Lgr5-EGFP / CreER टी 2 में चित्रा 3. Klf5 विलोपन / Klf5 FL / FL चूहे Lgr5-EGFP पॉजिटिव तहखाने में दीर्घकालिक बनी रहती है। टी 2 नियंत्रण और Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 FL / FL दिन पर चूहों 14 दिन पहले tamoxifen के इंजेक्शन के बाद क्रमश: से प्रतिनिधि छोटी आंतों के ऊतकों हैं। पैनलों ईस्वी, Lgr5-EGFP / CreER टी 2 नियंत्रण चूहों से एकत्र ऊतक से धुंधला के प्रतिनिधि हैं, जबकि Lgr5-EGFP / CreER टी 2 के पैनल एह शो धुंधला प्रतिनिधि / Klf5 FL / FL चूहों। पैनलों ए और लाल रंग में ई प्रदर्शन Klf5 immunofluorescent धुंधला; पैनलों बी और एफ हरे रंग में EGFP धुंधला दिखाने; पैनलों सी और पीले रंग में जी शो Ki-67 धुंधला; और पैनलों डी और एच शो Klf5, EGFP और की-67 के दाग की छवियों विलय कर दिया। नीले तीर हरी तहखाने को इंगित; सफेद तीर मर्ज किए गए चित्र में nongreen तहखाने को इंगित करें। Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 FL / एफएल चूहों केवल EGFP लेबल सीबीसी 14 कोशिकाओं में Klf5 के दीर्घकालिक नुकसान दिखाया। स्केल बार = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

स्विस रोलिंग तकनीक बड़े पैमाने पर ऊतकीय और रूपात्मक मूल्यांकन के लिए आंतों के ऊतकों की तैयारी के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। पहले से वर्णित स्विस रोलिंग तकनीक है, जो मूल रूप से जमे हुए वर्गों 18,19 की तैयारी के लिए विकसित किया गया था के विपरीत, यहाँ प्रस्तुत की प्रक्रिया formalin निर्धारण और आयल एम्बेडिंग (FFPE) के लिए शीघ्र आंतों ऊतक तैयारी और निर्धारण की अनुमति देता है। जमे हुए ऊतक की तुलना में, FFPE ऊतक बहुत लंबे समय तक शैल्फ जीवन है और बेहतर ऊतक अखंडता की वजह से ऊतकीय विश्लेषण के लिए ऊतक के पसंदीदा प्रकार है। स्विस रोलिंग प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण भागों रोलिंग और स्विस रोल अखंडता और धुंधला postfixation के लिए ऊतक गुणवत्ता को बनाए रखने के लिए ऊतक लचीलापन शामिल है। आंतों के ऊतकों की FFPE के लिए मानक स्विस रोल तकनीक को आम तौर पर कठिन और समय लेने वाली (2 दिन) 18,19 है। साथ ही, इस मानक विधि आमतौर पर आंतों के ऊतकों है कि अनुसंधान है पैदावारelatively कठोर और आसान नहीं एक स्विस रोल में के रूप में। इसका कारण यह है 10% बफर formalin में विच्छेदित आंतों के ऊतकों की रात ऊष्मायन ऊतक रोलिंग से पहले आवश्यक है। FFPE प्रयोजनों के लिए तकनीक के अन्य संशोधनों को भी विकसित किया गया है, लेकिन वे आंतों के ऊतकों की प्रवृत्ति का एक प्रमुख समस्या उतारना और / या के लिए रोल के केंद्र विकृत किया जा करने के लिए किया है। इस वजह से इन तकनीकों में इस्तेमाल ऊतक ताजा unfixed ऊतक, जो बलगम आंत द्वारा उत्पादित से फिसलन है है। नए संशोधित यहाँ दिखाया तकनीक Bouin लगानेवाला का एक संशोधित फार्म का उपयोग करके इन समस्याओं पर काबू। मूल Bouin लगानेवाला एसिटिक एसिड, इथेनॉल, रंगाई एसिड और paraformaldehyde (या formalin) का एक मिश्रण के होते हैं। दो सबसे खतरनाक घटकों, रंगाई एसिड और paraformaldehyde (या formalin), एक एसिटिक एसिड / इथेनॉल मिश्रण के साथ लगानेवाला की ज्यादा सुरक्षित उपयोग की अनुमति के लिए समाप्त कर दिया गया है। रंगाई एसिड एक विस्फोट खतरा है, और parafor प्रस्तुतmaldehyde (या formalin) एक कैंसर खतरा है। संशोधित Bouin लगानेवाला का उपयोग करने का महत्व यह है कि यह (1) अपने मूल सूत्र की तुलना में कम खतरनाक है, (2) अपेक्षाकृत nonexpensive अभिकर्मकों कि ज्यादातर प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध हैं के साथ तैयार करने के लिए आसान है, और (3) जल्दी के लिए अनुमति देता है, लगभग तुरंत, निस्तब्धता के लिए इस्तेमाल किया जब ऊतक का निर्धारण। जानकारी के लिए, वहाँ इस संशोधित तकनीक का उपयोग करने के लिए कोई ज्ञात सीमाएं हैं। साथ ही, इस मिश्रण के साथ त्वरित निर्धारण बेहद, आंतों के ऊतकों की slipperiness कम कर देता है बहुत तेज और आसान ऊतक रोलिंग की इजाजत दी। इस लगानेवाला भी ऊतकीय और immunostaining विश्लेषण के लिए ऊतक और सेल अखंडता के उत्कृष्ट संरक्षण के लिए अनुमति देता है। इस प्रकार, आंतों ऊतक तैयारी के अन्य तरीकों की तुलना में, इस तकनीक में सुधार के लिए कई तकनीकी मुद्दों और अनुदान बहुत बढ़ाया गति और उपयोग में आसानी काबू।

इसके अलावा, इस संशोधित लगानेवाला अन्य मोटी के साथ उपयोग करने के लिए उपयोगी हैऊतकों कि त्वरित निर्धारण की आवश्यकता है। एसिटिक एसिड के और इथेनॉल की प्रकृति, एक ही समय के दौर से गुजर निर्धारण पर जबकि मोटी ऊतक के त्वरित प्रवेश की क्षमता है की वजह से। हम इसे सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया है जल्दी से इस तरह यकृत, प्लीहा और गुर्दे के रूप में मोटी ऊतक ठीक करने के लिए। 20 मिनट - उदाहरण के लिए, संशोधित Bouin लगानेवाला का उपयोग कर एक वयस्क चूहे पूरे जिगर का निर्धारण आमतौर पर 15 के भीतर हासिल की है। यह आसानी से जिगर में एक क्रॉस सेक्शन काटने और देख रहा है जिगर की गहरी क्षेत्रों के खून से लाल से रंग धूसर करने के लिए बदल गया था द्वारा न्याय किया जा सकता है। रंग में परिवर्तन निर्धारण का संकेत है। के रूप में ऊतक को पहले से ही इस बिंदु पर तय हो गई है, बदल सेलुलर / ऊतक रचना का कोई डर नहीं के साथ 48 घंटा - यह निर्धारण तो 24 के लिए बफर formalin का उपयोग कर crosslinking द्वारा पीछा किया जाता है।

गहरी ऊतक fixati प्राप्त करने के लिए 48 घंटा - तुलना करके, उपयोग पारंपरिक बफर-formalin निर्धारण एक वयस्क चूहे पूरे जिगर पर अकेले विधि 24 की आवश्यकता होगीपर, गहरी ऊतक की बदल सेलुलर संरचना के जोखिम के साथ। मोटी ऊतकों की त्वरित प्रतिक्रिया निर्धारण के तरीकों में एक न्यूनतम करने के लिए सेलुलर घटकों के परिवर्तन को कम करने में इस तरह के हाइपोक्सिया के रूप में की स्थिति, तनाव के शरीर से अंग / ऊतक को हटाने के बाद, का बेहतर लाभ दिया है। हम आशा करते हैं कि संशोधित लगानेवाला मोटी ऊतक / अंगों फिक्सिंग वांछित है की एक भी तेजी से रास्ते के रूप में पशु छिड़काव में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रकार, अंत में, इस विधि और संशोधित लगानेवाला कई फायदे आंतों के ऊतकों कटाई और निर्धारण और संशोधित लगानेवाला के लिए इस्तेमाल परंपरागत तरीकों पर जल्दी से अन्य मोटी ऊतकों / अंगों को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान करते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stainless Steel Dissecting Kits VWR 25640-002
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012
Syringe 10 ml VWR 89215-218
Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid Simport M515
Superfrost Plus Slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR 48311-703
Manual Slide Staining Set Tissue-Tek/Sakura 4451
Staining Dish Green Tissue-Tek/Sakura 4456
Staining Dish White Tissue-Tek/Sakura 4457
24-Slide Slide Holder with Detachable Handle Tissue-Tek/Sakura 4465
Oven Thermo Scientific 6243 for baking slides at 65 degree
Dissection microscope Zeiss Stemi 2000C
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X
PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Ethanol 200 proof AAPR 111000200
Methanol VWR BDH1135-4LP
Glacial acetic acid AAPR 281000ACS
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL
Hydrogen peroxide 25% solution in water ACROS 202465000
10% bufered formalin Fisher Scientific 22-026-213
Bovine serum fraction V, heat shock Roche 3116956001
Tween 20 Sigma Aldrich P7949
Sodium citrate Fisher Scientific S279
Gavage needle VWR 20068-624
Rabbit anti Klf5 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-22797 Dilution 1:150
Chicken anti EGFP antibody Millipore AB16901 Dilution 1:500
Rabbit anti Ki67 antibody Biocare Medical CRM325B Dilution 1:500
Mach3 rabbit AP polymer detection kit Biocare Medical M3R533L
Warp red chromogen kit Biocare Medical WR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 mice  Jackson labs 008875 
Automated processor Leica Leica TP1020

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References

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बुनियादी प्रोटोकॉल अंक 113, स्विस रोल आंतों उपकला कोशिकाओं स्टेम सेल immunohistochemistry इम्यूनोफ्लोरेसेंस
Immunohistochemical और Immunofluorescent विश्लेषण के लिए आंतों के ऊतकों तैयारी के लिए स्विस रोलिंग तकनीक में सुधार
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Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J. Vis. Exp. (113), e54161, doi:10.3791/54161 (2016).

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