Summary
腸の粘膜内層に沿って上皮細胞の正確な同定と位置が異なる細胞系譜を定義することが不可欠です。腸組織の適切な画像化は、最大解像度でのタンパク質発現パターンの同定のために重要です。本研究では、マウスの腸組織を処理するための最適な方法および条件を線引きすることを目指しています。
Introduction
哺乳類の腸上皮は円柱細胞の単層を含みます。分化した細胞は、絨毛の領域を占有しながら、小腸において、増殖細胞は陰窩に閉じ込められます。大腸には絨毛がないのでしかし、増殖性細胞は陰窩の底に局在し、分化した細胞は陰窩の上部領域を占有しています。陰窩内の増殖細胞の連続した分割によって駆動される - （5日、約3）腸上皮は、迅速な補給を受けます。陰窩の増殖細胞は均質な集団ではなく、さらに、幹細胞とトランジット増幅（TA）のセル1に細分化されています。 2一番下から5細胞-幹細胞は、最初の4以内、陰窩の底部に存在します。陰窩ベース柱状（CBC）、幹細胞と予備静止幹細胞：現在のモデルは、2つの幹細胞の種類の存在をサポートしています。 CBCのTEM細胞が活発に増殖しているとロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体5（LGR5）3、Olfactomedin 4（Olfm4）4とAchaeteの盾板状の2（Ascl2）5でマークされています。一方、予備静止幹細胞は、B細胞特異的モロニーマウス白血病ウイルス統合部位1（BMI1）6、マウステロメラーゼ逆転写酵素（mTert）7により標識され、HOPホメオボックス（Hopx）8、ダブルコルチン様およびCAMキナーゼ様1（DCLK1）9、およびロイシンリッチリピートおよび免疫グロブリン様ドメイン1（Lrig1）10。活発に増殖している幹細胞は、次いで、吸収細胞（腸細胞）および分泌細胞（腸、杯、パネート、およびタフト細胞）へのさらなる分化を受けるTA細胞を生じます。彼らはアポトーシスを起こすとされている絨毛のトップに到達するまで増殖帯での連続的な細胞分裂は、陰窩 - 絨毛軸に沿った上皮細胞の上方への移動をもたらします上皮の表面から脱落。腸上皮細胞の異なる種類は、異なるタンパク質（ 例えば 、腸杯細胞がリゾチームに対する抗体でMUC2及びパネート細胞に対する抗体で染色することにより認識することができる）の発現によって示されています。私たちは、腸上皮11-13の恒常性と病理生物学におけるクルッペル様因子（KLFs）の役割を研究します。変形スイス圧延技術の実現可能性を支持し、ここで示された結果は、活発に増殖し、腸上皮幹細胞14の維持にクルッペル様因子5（KLF5）の役割の以前の研究に基づいています。 KLF5は、高活性腸管幹及びTAのセル12内で発現されるジンクフィンガー転写因子です。以前の研究では、KLF5はのKi-67、腸陰窩で知られている増殖マーカーと共発現していることを実証しました。
胃腸のtr行為は、構造的または機能的に均質な組織ではありません。小腸はさらに、近位、中間、および遠位の部分に分け、後者で、十二指腸、空腸、および回腸と盲腸および結腸に大腸に分割されています。これらの各セクションは、固有の組織学的特徴を有しており、別個の役割15を担っています。このように、傷害及び腸上皮の応答の程度の影響を研究した組織16の領域に依存してもよいです。さらに、種々のマウス系統は、試験16に使用される損傷の種類に基づいて、組織学的レベルでの応答の多様性を示します。これにより、組織標本にふさわしい、適切な組織学的および腸組織の分子の分析を可能にするために必要です。このように、スイスロール技術は一度に腸上皮の完全な長さの分析を許可するため、総合的な情報に基づいて、十分な情報に結論を確認します。
e_content ">スイスロールの技術は最初マグナス17言及し、MoolenbeckとRuitenbergパークらによって詳細に説明した。組織を調製し、組織を実行するための方法は、それぞれ、げっ歯類腸18,19を分析する。プロトコル診断目的のために、タイムリーかつ信頼性の高い組織調製のために許可する独自の方法の改良版は、この公報に提示描写。この修正された技術は、効率的なコレクションと、そのような免疫組織化学、免疫蛍光、ならびに普遍的に使用される技術のための腸管上皮の調製を可能にしますin situハイブリダイゼーション（蛍光及び発色20） のように。また、変更された組織標本の作製方法は、容易に入手可能で利用し、比較的安価な試薬の迅速な組織固定の方法を提供しつつ、さらなる評価のために、タンパク質、DNA、及びRNAの回収を可能にする。撮影します一緒に、THIsの技術は、腸上皮の、組織病理学的病理学、および分子的特徴を総合的に評価するための優れたです。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.マウス
- マウスを含むすべての研究は、ニューヨーク州立大学ストーニーブルック校施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。マウスは、12：12時間の明暗サイクルで維持しました。
- 商業的にC57BL / 6マウスを得ます。 loxP部位（L / F リットル F KLF5）によって隣接KLF5対立遺伝子を運ぶC57BL / 6マウスを入手します。これらのマウスは、以前に21を説明し、優雅博士良三永井によって提供されました。
- LGR5プロモーター（LGR5-EGFP / CreERT2マウス）の調節下に誘導性Creリコンビナーゼ遺伝子を有するC57BL / 6マウスを購入します。
- LGR5-EGFP /クレエT2 / KLF5 のF リットル / f が リットルマウスを確立するために、交差KLF5 FL / F LGR5-EGFP /クレエT2マウスで、次いでKLF5 FL / F リットルの子孫を戻し交配リットルマウス マウス。
- プロトコルに従って、タモキシフェンで処理したマウスは、以前に22を説明しました。 5日間連続して、滅菌コーン油に溶解したタモキシフェンの1ミリグラム（10ミリグラム/ミリリットル）で、8週齢の実験及び対照マウスの腹腔内（IP）を注射します。
- 最初のタモキシフェン注射後14日目に、CO 2ガス源に接続されたチャンバ内にそれらを配置することにより、CO 2窒息を使用して犠牲マウス。マウスは無意識であり、すべての動きが停止するまでガスが室内に流入することを可能にします。安楽死を確実にするために、頸椎脱臼を行います。
2.組織調製およびスイスのローリング
- 解剖鉗子とハサミを使用して、腹側の皮膚に切開をカット。鉗子のペアで、切開で皮膚を保持し、静かに腹部の筋肉組織から引き出します。腹部の皮膚をカットし、腹部の筋肉を露出するようにハサミを使用してください。
- 保留とPEをプルアップ鉗子でritoneum。保持や腸で引っ張ることがないようにしてください。慎重に腹膜組織の切開を行い、腹部の筋肉を露出させるために皮膚を切り取る続けます。慎重に腹部の筋肉の切開を行い、腸を露出するために、それらを切り取る続けます。
- それは直腸/肛門に参加する遠位端にコロンとトレースを特定します。はさみのペアで、できるだけ肛門開口部に近いカット。
- それは小腸と合流胃およびトレースを特定します。はさみのペアで、約1cm離れて胃から腸を解放カット。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含有する清潔なペトリ皿に解放された小腸および結腸の全長を転送します。
- 1手や鉗子のペアで、結腸の遠位端を保持し、静かに任意の腸間膜の結合および/または脂肪組織からの結腸の全長を解明するためにもう一方の手を使用しています。
- 盲腸を特定（小腸および大腸の間に小さなポーチ）と盲腸および結腸にコロンを解放するために（コロンの近位端）に参加ここでカット。
- 1手や鉗子のペアで、小腸を保持し、穏やかに任意の腸間膜の結合および/または脂肪組織から小腸の全長を解明するためにもう一方の手を使用しています。盲腸を離れてカットし、それのための必要がない場合は破棄します。
注：このプロセスは一晩修正ブアン固定液（DH 2 O中の50％エタノール/ 5％酢酸）で切り出し腸をインキュベートすることによって、ここで停止し、次の日の手順を続行することができます。 - 腸（小腸または結腸）の1セグメントを取り扱い、修正ブアン固定液で10 mlの注射器を記入し、それに強制経口投与針を取り付けます。腸セグメントの前方開口部に半分センチ程度の針を挿入します。
- 楽器でしっかりと圧力を加えることによって、腸のセグメントの内側胃管栄養針を保持します腸セグメント上。一方は注射器を保持すると、修正されたブアン固定液を使用して、腸のセグメントの内容をフラッシュする優しいが、一貫性のある圧力をかけます。このステップは、腸のセグメントと直接固定を同時に洗浄することができます。フロースルー廃棄物を収集するために、ペトリ皿を使用してください。固定は不透明回し大腸色によって観察することができます。
注意：洗浄または腸のセグメントが破裂かもしれない間、あまりにも多くの圧力を適用していないことを確認してください。 - はさみを使用して、腸間膜ラインに沿って長手方向に腸のセグメントを切り開きます。ピンセットでそれを保持し、PBSを含むペトリ皿に簡単にそれをすすいでください。
- 近位、中間、および遠位：3つの等しいセグメントに小腸をカット。近位セグメントは、胃の直後一つであり、及び遠位セグメントはコロンの直前1です。近位セグメントは、十二指腸、空腸半ば、および遠位にすることと同じです回腸。
- 各セグメントについて、近位端および遠位端をマーク。近位端は、もともと胃に向かって指したものであり、遠位結腸に向かって指摘しました。
- 洗浄し、開かれた腸セグメントを配置するために、ペトリ皿の上部を使用してください。上向きに腔側と腸のセグメントを配置します。
- コロンの場合は、その幅を横切って実行variegations /畝によって腔側を識別し、近位端に存在しています。中間領域と遠位領域は、長手方向に実行するいくつかのvariegationsを持っています。小腸は、絨毛をマークラフに見える表面で腔側を識別します。
注：小腸のために、近位、中間及び遠位領域の外部肉眼解剖学的境界はありません。しかしながら、これらの領域は、顕微鏡下のセクションで同定することができることができます。絨毛は、近位領域で最長であり、彼らがどこにある遠位徐々に短くなって長さが短いです。顕微鏡、結腸陰窩はまた、リッジの存在によって同定することができる近位領域に最短です。結腸陰窩は、近位領域よりも、まだ、まだ背の高い中央部で最も高いと遠位領域で短くなっています。
- コロンの場合は、その幅を横切って実行variegations /畝によって腔側を識別し、近位端に存在しています。中間領域と遠位領域は、長手方向に実行するいくつかのvariegationsを持っています。小腸は、絨毛をマークラフに見える表面で腔側を識別します。
- スイスは、コロンをローリングして進みます。
- フラットオープンコロンを維持し、ペトリ皿の縁に向かって、その近位端からピンセットでそれを引っ張ります。
- 上を向い腔側を維持し、片手で鉗子と近位端を保持し、もう一方の手で爪楊枝を保持します。
- 鉗子を使用して、つまようじの周りの近位端の縁をラップし、少しの場所でそれを保持するためにつまようじに対して包まれたエッジをはさみます。
- ゆっくり、ゆっくりとスイスロールを形成するためにつまようじの周りにコロンをロール指でつまようじを転がり始めます。
- 結腸全体の長さがロールアップされた後、慎重にCをスライドするようにピンセットを使用しつまようじオフと組織処理/ -EmbeddingカセットにOLONスイスロール。室温で一晩、10％緩衝ホルマリン中にカセットを置きます。
- スイスは、小腸をローリングして進みます。
- 一度に一つのセグメントを取り扱い、腔側とフラットオープンセグメントを維持し、ペトリ皿の縁に向かって、その近位端からピンセットでそれを引っ張ります。
- コロンで説明したようにスイスのローリングを続行します。
- パラフィン包埋のためにホルマリン固定組織の処理に進みます。以下のように実行します。
注：（詳細は材料および機器のを参照してください）自動化されたプロセッサを使用してください。- 組織は、カセットにある間は固定液が完全に除去されるまで、PBSで組織をすすぎます。
- 以下の順序でエタノールを用いて組織を脱水：10分間、50％エタノール、10分間、70％エタノール、10分間、80％エタノール、10分間、95％エタノール、10分間100％エタノール、10分間100％エタノール、および110分間の00パーセントエタノール。
- 次の順序でキシレンとの交流のエタノール：2：1のエタノール：10キシレン - 15分、1：1のエタノール：10キシレン - 15分、1：2のエタノール：10キシレン - 10で15分間、100％キシレン - 15分、10、100％キシレン - 15分、および10のための100％のキシレン - 15分。注意：キシレンは、このように職場が適切なフードと担当者が身に着けていたしなければならない適切な保護具で局所排気装置を装備する必要があり、健康被害です。
- パラフィンとの交流キシレン。オーブン54に設定し、真空中で次の手順を実行 - 58°C：1キシレン：2 30分間パラフィン、1：1キシレン：30分間パラフィン、1：2キシレン：30分間パラフィン、100％のパラフィン1から2時間、および1のための100％のパラフィン - 2時間または一晩。
注：これはパラフィンポリマーを低下させ、それが硬くて脆いようになりますので、パラフィンが長期間60℃を超えないようにしてください。 - デ新鮮な新しいパラフィンおよび配向組織に埋め込みますパラフィンが硬化する前に産ま。スイスロールのために、組織のパラフィン除去以下は、パラフィン包埋の間、その側に各ロールの位置を変更することが重要です。これは、切断中に、各ロールの全長のセクションが生成されることを保証します。
- 染色のために、ミクロトームを用いて5μmの厚さの切片を切りました。 65℃のオーブンで一晩中（焼く）に帯電したスライド上のセクションを収集し、それらを乾燥させ;室温まで冷却し、その後、染色のためにそれらを使用してみましょう。
注： - 新たにスライドしている切断方法に応じて、2時間の焼成時間は、1に短縮することができます。切片以来1カ月未満ならば、一晩焼くことをお勧めします。それはヶ月以上されている場合は、1 - ベーキングの2時間は、時間を節約するのに十分です。時間が不足している場合は、一晩のバッキングは常に使用することができます。
3.組織学的分析および免疫蛍光染色
組織学的分析およびimmunofluを実行しますorescence染色は、以前に変更を加えて、23,24について説明しました 。強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）免疫蛍光のために：
- 1時間65℃のオーブンで焼くスライド内因性アルカリホスファターゼ活性を不活性化し、続いてキシレンで脱パラフィン。
- 内因性組織ペルオキシダーゼを遮断するために、メタノール中の3％過酸化水素の浴のセクションをインキュベート。その後、10分間125℃でクエン酸緩衝液中で抗原回復が続く減少アルコール浴シリーズ（100％、95％、70％）（10 mMクエン酸ナトリウム、0.05％のTween-20、pH6.0）ででインキュベートすることによって再水和decloakingチャンバを使用。
- 疎水性の障壁を提供するペンマーキング用いて組織切片の周りに円を描くと（EGFPに対する一次抗体と共に、次に希釈1を37℃で30分間（TBS-Tween中で2.5％ウシ血清アルブミン[BSA]）をブロッキング緩衝液とを用いて切片をインキュベート：500）、加湿チャンバー内で4℃で一晩穏やかに振とうしながら。
- 切片を洗浄し、37℃で30分間、適切な濃度の蛍光タグ付き二次抗体と共にインキュベートします。
- ヘキストと二次抗体処理および染色核後、スライドを洗浄し、取り付けメディアでマウントします。
- KLF5 / EGFP /のKi-67共染色のために、ステップ3.1で説明したように、プロセスのスライド - 3.3およびKLF5抗体（希釈1：150）とインキュベートすることにより、KLF5染色を行い、一晩。
- ウサギAPポリマーの検出は、プロトコルに従って、スライドに適用されます。
- Klf4のは、製造業者のプロトコルに従って色原体の免疫組織化学染色を用いて染色を明らかにしました。
- 以前に記載されたプロトコル25を用いて抗体の溶出を実行します。 1時間撹拌しながらグリシンSDS（pHは2.0）溶液中で50℃でスライドをインキュベートします。
- 洗浄を蒸留水で徹底的にスライドし、37℃で30分間（TBS-Tween中の2.5％BSA）をブロッキング緩衝液と共にインキュベートします。
- Ki-67を追加（希釈1：500）およびEGFP（希釈1：500）を同時に抗体と1時間37℃でインキュベートします。
- ヘキストで染色する前に、適切な二次抗体を用いて蛍光検出を行った（データは示していない）とマウンティング培地でマウント。
- ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）26と5μmのセクションを染色する上で、組織の組織学的形態を観察します。蛍光画像は、それぞれ、EGFP、KLF5、およびKi-67染色を視覚化するために535、646、および700の発光波長を使用します。
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Representative Results
免疫組織化学染色と組み合わせたスイスの圧延技術は、小規模または大規模な腸組織の総合的な分析を可能にします。 C57BL / 6マウス（図1）の大腸のH＆E染色の例は、実現可能性と、この技術の有効性を示す図です。近位、中間、および遠位： 図1に示すように 、画像は、結腸の全ての部分をキャプチャすることが可能です。これにより、総合的な組織学的評価を可能にします。スイスのローリングおよび小規模または大規模な腸組織の全体の長さを捕捉する能力は、異種遺伝子発現およびマーカー染色または傷害への腸組織の可変応答のための非常に有用です。
例では、LGR5-EGFP /クレエT2マウスにおけるEGFPの染色パターンです。このマウスモデルにおいて、EGFPの発現は、以下によって駆動されますのみ活発に増殖腸陰窩において活性であるLGR5プロモーター 、。導入遺伝子発現の浸透度 - さらに、このマウスモデルは、低い（10％約5）によって特徴付けられます。 図2に示されるように 、腸組織におけるEGFPの発現パターンは可変です。その結果、組織の大きな視野を捕捉する能力は、関心領域を識別するのに役立ちます。
ここで説明する手法は、特にmultifluorophore染色のアプリケーションに強力です。ここでは、スイスロール法を用いて調製した腸組織のtrifluorophore染色の例を示します。本研究の主な目的は、LGR5マーカーを発現する腸の幹細胞の維持におけるKLF5の役割を調査することでした。したがって、我々はLGR5-EGFP /クレエT2マウスにおけるLGR5陽性の腸管幹細胞からKLF5を削除し、日に腸組織を収集します最初のタモキシフェン注射後14。免疫組織学的分析のために、組織はこの原稿に提示プロトコールに従って調製し、EGFP（LGR5マーカー）、KLF5、およびKi-67についての染色を行いました。 LGR5-EGFP /クレエT2と表記対照マウス、2調べた時点でのKLF5およびKi-67のためのEGFP陽性（青矢印でマークされている）とEGFP陰性陰窩（白矢印でマーク）を示した同時染色の両方で図3（d）に示すように 。これとは対照的に、LGR5-EGFP /クレエT2 / KLF5 FL / FL小腸組織において、KLF5 /のKi-67同時染色は、（青矢印でマークされている）EGFP陽性CBCの幹細胞から欠落していましたが、EGFP陰性に存在します図3Hに示すように、（白矢印で示される）緑色の陰窩に隣接陰窩。これは、ここで提示組織調製技術は負染色品質に影響しないという優れた例です。
C57B L / 6マウス から大腸の 図1 のH＆E染色 。示さ大腸の全体の長さの合成画像です。黒い矢印と黒線の間の部分が黒とオレンジのラインの間の近位部は、中央をマークし、オレンジ色の線とオレンジ色の矢印の間に大腸の末端部をマークマーク。スケールバー=1000μmで。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
LGR5-EGFP /クレエ T2 マウス の小腸の図2.免疫蛍光染色 。Eの複合画像GFP（LGR5陽性上皮細胞を標識する）LGR5-EGFP /クレエT2マウスの小腸切片の染色。 LGR5-EGFP /クレエT2マウスの陰窩におけるLGR5-ポジティブ上皮細胞を標識タンパク質マーカー（EGFP）の異種の免疫蛍光染色の例。核はヘキストで可視化されています。白矢印は、EGFPの発現について陽性陰窩をマーク。スケールバー=500μmの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
LGR5-EGFP /クレエ T2 / KLF5 FL / FL マウス における 図 3. KLF5 削除は LGR5-EGFP陽性陰窩に長期に持続します。 T2制御とLGR5-EGFP /クレエT2 / KLF5 FL / FLマウスからの代表的な小腸組織です。 LGR5-EGFP /クレエT2 / KLF5 FL / FLマウスの一方のパネルEHショー染色の代表的なパネルADは 、LGR5-EGFP /クレエT2対照マウスから採取した組織から染色の代表的なものです。赤でパネルAおよびE表示KLF5の免疫蛍光染色。パネルBおよびFは緑色でEGFP染色を示します。黄色のパネルCおよびGショーのKi-67染色;そしてパネルDおよびHのショーは、KLF5、EGFPおよびKi-67の汚れの画像を統合しました。青い矢印は緑色の陰窩を指します。白い矢印は、マージされた画像内の緑でない陰窩を指します。 LGR5-EGFP /クレエT2 / KLF5 FL / FLマウスは、EGFP標識CBCセル14にKLF5の長期的な損失を示しました。スケールバー=50μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
スイスの圧延技術は、大規模で組織学的および形態学的評価のための腸組織を調製するための強力な方法です。もともと凍結切片18,19の製造のために開発された、以前に記載スイス圧延技術とは対照的に、ここで紹介する手順は、ホルマリン固定およびパラフィン包埋（FFPE）のプロンプト腸組織の準備と固定を可能にします。凍結組織と比較して、FFPE組織は、はるかに長い貯蔵寿命を有しており、なぜなら、より良い組織の完全性の組織学的分析のために組織の好ましいタイプです。スイス・ローリングプロトコルの重要な部分は、圧延および染色かん流後スイスロールの整合性と組織の品質を維持するための組織の柔軟性を必要とします。腸組織のFFPEのための標準的なスイス・ロール方式では、面倒で時間がかかる（2日）18,19です。また、この標準的な方法は、通常、rと腸組織をもたらしますelatively硬いとスイスロール状に形成することは容易ではありません。 10％緩衝ホルマリン中で切開腸組織の一晩のインキュベーションが組織圧延前に必要とされるからです。 FFPE目的のための技術の他の修飾も開発されているが、それらは腸組織の傾向の主要な問題は、アンロールおよび/またはロールの中心が歪んされるためにする必要があります。これらの技術で使用される組織は、腸によって産粘液から滑りやすい新鮮未固定組織からです。ここに示されている新しい修正された技術は、ブアン固定液の改変形態を使用することによって、これらの問題を克服します。オリジナルブアン固定液は、酢酸、エタノール、ピクリン酸およびパラホルムアルデヒド（またはホルマリン）の混合物からなります。 2ほとんどの有害成分、ピクリン酸およびパラホルムアルデヒド（またはホルマリン）は、酢酸/エタノール混合と固定剤のより安全な使用を可能にするために排除されています。ピクリン酸は、爆発の危険を提示し、paraformaldehyde（またはホルマリン）は、癌の危険性です。改変ブアン固定液を用いての重要性は、それが（1）元の式と比較してより少ない有害であることである（2）ほとんどの研究室で容易に入手可能である比較的nonexpensive試薬を用いて調製することが容易であり、（3）、迅速にすることが可能洗浄に使用した組織のほぼ瞬時に、固定。知る限りでは、この修正された技術を使用する既知の制限はありません。さらに、この混合物を用いた迅速な固定は非常にはるかに迅速かつ容易に組織圧延を可能にする、腸組織の滑りを軽減します。この固定剤はまた、組織学的および免疫染色分析のための組織および細胞の完全性の優れた保存を可能にします。したがって、腸組織の調製の他の方法と比較して、この改善された技術は、いくつかの技術的な問題とグラント大幅に向上速度と使いやすさを克服します。
また、この修正された固定剤は、他の厚さで使用すると便利です迅速な固定を必要とする組織。酢酸の性質及びエタノールのため、同時に定着を受けながら、厚い組織の迅速な浸透能力を持っています。私たちはすぐに、肝臓、脾臓、腎臓などの厚い組織を固定するために成功裏にそれを使用しています。 20分 - 例えば、修飾ブアン固定液を用いて、成体マウス肝臓全体の固定は、通常、15以内に達成されます。これは、簡単に肝臓への断面を切断し、肝臓の深い領域がグレーに血のように赤いから色を変更したかどうかを観察することによって判断することができます。色の変化は、固定の指標です。組織がすでにこの時点で固定されているように、変化した細胞/組織組成の無い恐怖に48時間 - この固定は、その後24緩衝ホルマリンを使用して架橋することによって続いています。
深部組織fixatiを達成するために48時間 - 比較すると、成体マウス肝臓全体に、単独で使用する従来のバッファリングされ、ホルマリン固定法は24を必要とします、上の深部組織の変化した細胞組成の危険を伴います。厚い組織の迅速な固定方法は、身体からの器官/組織を除去した後、例えば、低酸素症のような状態を、ストレスに応答して最小限に細胞成分の変化を低減する優れた利点を有します。私たちは、修正された固定剤が望まれている厚い組織/臓器を固定するさらに高速な方法として、動物の灌流に使用することができることを期待しています。したがって、結論として、この方法および修正された固定剤はすぐに他の厚い組織/臓器を固定するために用いることができる腸組織の収穫と固定し、変更された固定剤に使用される伝統的な方法を介して複数の利点を提供します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10 ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1:150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1:500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
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