Summary
정확한 식별 및 장 점막 안감을 따라 상피 세포의 위치는 다른 세포 계보를 정의하는 것이 필수적이다. 장 조직의 적절한 촬상 최대 해상도 단백질 발현 패턴을 식별하기 위해 중요하다. 이 연구는 처리 마우스 장 조직을위한 최적의 방법과 조건을 서술하는 것을 목표로하고있다.
Introduction
포유류 장 상피 원주 세포의 단일 층을 포함한다. 분화 된 세포가 융모의 영역을 차지하면서 소장에서 증식 세포 지하실에 국한된다. 대장에는 융모 없기 때문에 그러나 증식 세포 지하실의 바닥에 지역화 및 분화 세포 소낭의 상부 영역을 차지한다. 지하실 내 증식 성 세포의 연속 분할에 의해 구동된다 - (5 일 3) 장 상피 신속한 보급을 겪는다. 지하실의 증식 성 세포는 균질 집단 아니며 상기 줄기 세포와 교통 증폭 (TA) 셀 (1)로 세분화된다. 이 바로 아래에서 5 세포 - 줄기 세포는 제 4 내 토굴 하단에 상주. 굴베이스 기둥 (CBC) 줄기 세포 및 예비 정지 줄기 세포 : 현재의 모델은 두 가지 줄기 세포 유형의 존재를 지원한다. CBC의템 세포는 활발하게 증식하고 류신이 풍부한 반복 포함하는 G 단백질 결합 수용체 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 Achaete의 방패 꼴의 뼈 조각 같은 2 (Ascl2) (5)로 표시됩니다. 한편, 예비 정지 줄기 세포는 B 세포 특이 몰 로니 뮤린 백혈병 바이러스 통합 위치 1 (BMI1) 6 마우스 텔로 머라 제 역전사 (mTert) (7)에 의해 표시되어, HOP 호 메오 박스 (Hopx) 8 Doublecortin 형 캠 키나제 -like 1 (Dclk1) (9), 및 류신이 풍부한 반복 및 면역 글로불린 같은 도메인 1 (Lrig1) 10. 능동적 증식 줄기 세포를 흡수 셀 (장 세포) 및 분비 세포 (장 내분비, 잔, Paneth 및 다발 세포)로 분화를 더 받아야 TA 세포 일으킨다. 그들은 세포 사멸을 받아야하고있는 융모의 상단에 도달 할 때까지 증식 영역에서 지속적인 세포 분열은 토굴-융모 축을 따라 상피 세포의 상향 이동 결과상피의 표면으로부터 벗겨진. 장 상피 세포의 종류 (예를 들어, 장 배 세포가 리소자임에 대한 항체 및 MUC2 Paneth 세포에 대한 항체로 염색하여 인식 할 수있다) 별개의 단백질의 발현에 의해 표시된다. 우리는 장 상피 11-13의 항상성 및 병리 생물학에서 크 룹펠 같은 요인 (KLFs)의 역할을 연구한다. 변형 스위스 - 롤링 방법의 타당성을 지원 여기에 제시된 결과는 활발히 증식 장내 상피 줄기 세포 (14)의 유지 보수 크 룹펠 형상 인자의 역할 5 (KLF5)의 이전 연구에 기초한다. KLF5는 매우 활성 장 줄기와 TA 세포 (12)로 표현된다 아연 손가락 전사 인자이다. 이전 연구는 KLF5이 기-67, 장 지하실에서 알려진 증식 마커와 공동으로 표현되는 것을 보여 주었다.
위장 TR 행위는 구조적으로 또는 기능적으로 균일 한 조직이 아니다. 소장은 근위부, 중간, 말단 부분으로 나누어 후자의 추가와 함께, 십이지장, 공장 및 회장과 맹장과 결장으로 대장으로 구분된다. 이 섹션은 각각 고유의 조직 학적 특징을 가지고 있으며, 서로 다른 역할 (15)을한다. 이와 같이, 욕설 효과 및 장 상피 세포의 반응의 정도를 연구 조직 (16)의 영역에 의존 할 수있다. 또한, 다양한 마우스 균주는 시험 16에 사용 모독의 유형에 기초하여 조직 학적 수준의 응답의 다양성을 증명한다. 따라서, 티슈 제조 어울리는하여 적절한 조직 학적 및 장 조직의 분자량 분석을 허용 할 필요가있다. 이와 같이, 스위스 롤 기술을 부여 한 번에 장 상피 세포의 전체 길이의 분석 따라서 포괄적 인 정보를 기반으로 박식 한 결론을 확인한다.
e_content "> 스위스 롤 기법 제 매그너스 (17)에 의해 언급 한 Moolenbeck 및 Ruitenberg 및 공원 등에 의해 상세하게 설명 하였다. 조직을 준비하고 조직학을 수행하는 방법은 쥐 소장 18,19 각각. 프로토콜 분석으로 진단 목적을위한 적절하고 신뢰성있는 티슈 제조 허용 일본어 방법의 개선 된 버전이 공보에 제시 묘사. 이러한 변형 기술은 효율적인 수집 및 면역 조직 화학, 면역뿐만 아니라 세계적으로 사용되는 기술에 대한 장 상피 세포의 제조를 허용 추가 평가를 위해 (형광 및 발색 20) 현장 하이브리드에있다. 또한, 제조 방법 표본 수정 된 조직은 신속한 조직 고정하는 방법을 제공하는 동안 쉽게 사용 가능하고 상대적으로 저렴한 시약을 이용하여 단백질, DNA의 복구를 위해 수 있으며, RNA. 카메라 함께 생의 기술은 장 상피 세포의 조직 병리학 병리학, 분자 기능의 종합 평가 우수하다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 마우스
- 마우스와 관련된 모든 연구는 스토니 브룩 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 마우스는 12시 12분 시간의 명암주기를 유지 하였다.
- 상업적으로 C57BL / 6 마우스를 얻을 수 있습니다. 에 loxP 사이트에 의해 형벌 Klf5 대립 유전자 (Klf5 f를 L / F 리터)을 들고 C57BL / 6 마우스를 얻습니다. 이 마우스는 이전에 (21)을 설명하고 우아 박사 료조 나가이에 의해 제공되었다.
- Lgr5 프로모터 (Lgr5-EGFP / CreERT2 마우스)의 규정에서 유도 Cre 호텔의 재조합 효소 유전자를 운반하는 C57BL / 6 마우스를 구입하십시오.
- Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 f를 L / f를 리터 마우스를 설정하려면, 교차 Klf5 FL / F Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스와 다음 Klf5 FL / F 리터의 자손을 역 교배 리터 마우스 마우스.
- 프로토콜에 따라 타목시펜으로 치료 마우스는 이전 22 설명했다. 연속 5 일 동안 멸균 옥수수 기름에 용해 타목시펜 1 밀리그램 (10 ㎎ / ㎖) 8 주령의 실험 및 대조군 마우스의 복강 (IP)을 주입한다.
- 첫 번째 타목시펜 주사 후 14 일에서 2 가스 소스를 CO에 연결 챔버에 배치하여 CO 2 질식을 사용하여 마우스를 희생. 마우스 의식하고 모든 움직임이 중단 될 때까지 가스가 챔버로 유입 할 수 있습니다. 안락사는 자궁 경부 전위를 수행 할 수 있도록합니다.
2. 조직 준비 및 스위스 롤링
- 해부 집게와 가위를 사용하여 복부 쪽의 피부에 절개를 잘라. 포셉 한 쌍으로, 절개 부위의 피부를 잡고 부드럽게 떨어져 복부 근육 조직에서 빼냅니다. 복부 근육을 복부 피부를 잘라 노출 가위를 사용합니다.
- 잡고 흥을 끌어포셉으로 ritoneum. 잡고 창자에서 당겨 할 수 없습니다 있는지 확인하십시오. 조심스럽게 복막 조직의 절개를하고 복부 근육을 노출 피부를 멀리 절단을 계속합니다. 조심스럽게 복부 근육의 절개를하고 장을 노출을 멀리 절단을 계속합니다.
- 콜론를 확인하고는 직장 / 항문을 조인 말단부에 추적. 가위로, 가능한 한 항문에 가깝게 잘라.
- 위를 확인하고는 소장과 결합 위치를 추적. 가위로 약 1cm 떨어진 위장에서 소장 무료 잘라. 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함하는 깨끗한 페트리 접시에 해제 소장과 대장의 전체 길이를 전송합니다.
- 한 손 또는 집게 쌍으로 결장의 말단부를 잡고있는 장간막 부드럽게 결합 및 / 또는 지방 조직에서 콜론의 전체 길이를 해명 한편을 사용한다.
- 맹장을 식별(작은 크고 작은 창자 사이 파우치)과 맹장과 결장은 대장을 무료로 (콜론의 기단부)에 가입 위치를 잘라.
- 한 손이나 집게 한 쌍으로, 소장을 잡고 조심스럽게 모든 장간막 결합 및 / 또는 지방 조직에서 소장의 전체 길이를 해명하기 위해 다른 손을 사용합니다. 맹장을 절취하고 필요가없는 경우 버린다.
밤새 처리가 DH (2 O 50 % 에탄올 / 5 % 아세트산)의 변형 Bouin 정착액의 밖으로 해부 창자 배양하여 여기에 정지 될 수 있고, 다음 날의 절차를 계속 참고. - 소장 (소장 또는 대장)의 하나의 세그먼트를 처리, 수정 Bouin의 정착과 함께 10 ML의 주사기를 작성하고 그것에 위관 바늘을 연결합니다. 장 세그먼트 (segment)의 전방 구멍에 반 센티미터에 대해 바늘을 삽입합니다.
- 악기에 확실히 압력을인가함으로써 장 구간 안에 위관 니들을 잡아장 세그먼트. 한편 주사기 채 수정 Bouin의 정착액을 이용하여 장 구간의 내용을 플러시 완만하지만 일관된 압력을 적용한다. 이 단계는 장 세그먼트 즉시 고정 동시에 청소를 할 수 있습니다. 플로우를 통해 폐기물을 수집하는 페트리 접시를 사용합니다. 고정 불투명 선회 결장 색으로 관찰 할 수있다.
참고 : 세척하거나 장 세그먼트가 오픈 버스트 수있는 동안 너무 많은 압력을 가하지 않도록해야합니다. - 가위를 사용하여 장간막 라인을 따라 길이 방향으로 장 세그먼트를 열 잘라. 한 쌍의 겸자로 잡아하고 PBS를 함유하는 페트리 접시에 간단히 린스.
- 근위부, 중간 및 원위부 : 3과 동일 세그먼트로 소장을 잘라. 근위 세그먼트는 위 다음 바로 하나이며, 말단 부분은 콜론 전에 즉시 하나입니다. 근위 세그먼트에 십이지장, 소장의 중간 및 말단에 해당회장.
- 각 세그먼트의 근위 및 원위 단부를 표시한다. 선단부는 원래 위를 향해 가리키는 된 하나는 콜론으로 지적 말단이다.
- 세정 및 열 장 세그먼트를 배치하는 페트리 접시의 상단을 사용합니다. 내강면이 위를 향하도록 장 세그먼트를 배치합니다.
- 콜론의 경우, 그것의 폭을 가로 질러 실행 variegations / 능선에 의해 내강면을 식별하고 기단부에 존재한다. 중간 및 말단 영역은 길이 방향으로 실행 일부 variegations 있습니다. 소장의 경우, 융모를 표시하는 거친 나타나는 표면에 의해 내강 측을 식별합니다.
참고 : 작은 창자를 들어, 근위부, 중간 및 말단 영역의 외부 육안 해부학 적 경계가 없습니다. 그러나이 지역은 현미경 섹션에서 확인 할 수있다. 그들이 곳 융모는 말단 점차 짧아 인접 지역에서 가장 오래되고이 될길이가 짧은. 미시적으로는 결장 음와은 리지의 존재에 의해 식별 될 수있는 인접 영역의 최단이다. 대장 지하실 아직 인접 지역에 비해 여전히 키가 말초 지역의 중앙부에서 가장 높은 짧은이다.
- 콜론의 경우, 그것의 폭을 가로 질러 실행 variegations / 능선에 의해 내강면을 식별하고 기단부에 존재한다. 중간 및 말단 영역은 길이 방향으로 실행 일부 variegations 있습니다. 소장의 경우, 융모를 표시하는 거친 나타나는 표면에 의해 내강 측을 식별합니다.
- 스위스 결장 롤링 진행합니다 :
- 평면 오픈 콜론을 유지하고 페트리 접시의 가장자리를 향해 그 기단부에서 집게로 잡아 당깁니다.
- 이 위를 향하도록 내강면을 유지하고 한 손으로 집게로 근위 끝을 잡고 다른 손으로 이쑤시개를 개최합니다.
- 집게를 사용하여 이쑤시개 주위의 기단부의 가장자리를 감싸 약간 제자리에 고정하기 위해 이쑤시개에 랩 가장자리를 끼.
- 부드럽게 천천히 스위스 롤을 형성하기 위해 이쑤시개 주위에 결장 롤 손가락으로 이쑤시개를 압연 시작합니다.
- 전체 대장의 길이가 겹쳐서되면, 조심스럽게 C를 슬라이드 집게 한 쌍을 사용하여이쑤시개 오프 및 조직 처리 / -embedding 카세트에 olon 스위스 롤. 실온에서 하룻밤 동안 10 % 포르말린에 카세트를 놓습니다.
- 스위스 소장 롤링 진행합니다 :
- 한 번에 하나의 세그먼트를 처리, 내강면이 평면 오픈 세그먼트를 주기적으로 업데이트하여 페트리 접시의 가장자리를 향해 그 기단부에서 집게로 잡아 당깁니다.
- 대장에 기재 한 바와 같이 스위스 압연을 진행합니다.
- 파라핀 삽입에 대한 포르말린 고정 조직을 처리를 진행합니다. 다음과 같이 진행하십시오 :
참고 : (자세한 내용은 자재 및 장비의 참조) 자동화 된 프로세서를 사용합니다.- 조직 카세트 중일 고착성이 완전히 제거 될 때까지, PBS로 조직을 헹군다.
- 다음 순서에 따라 에탄올을 이용하여 조직을 탈수 : 50 %의 에탄올을 10 분, 70 % 에탄올에서 10 분, 80 % 에탄올에서 10 분, 10 분, 95 % 에탄올, 10 분 동안 100 % 에탄올, 100 % 에탄올 10 분간 , 110 분 00 % 에탄올.
- 다음 순서 자일 렌과의 교류 에탄올 : 2 : 1의 에탄올 : 10 자일 렌 - 15 분, 1 : 1 에탄올 : 10 자일 렌 - 15 분, 1 : 2 에탄올 : 10 자일 렌 - 10 15 분, 100 % 크실렌 - 15 분 10 100 % 크실렌 - 15 분 10 100 % 크실렌 - 15 분. 주의 : 크실렌 따라서 직장이 적절한 후드와 직원이 착용해야 적절한 보호 장비와 국소 배기 장치가 장착되어 있어야 건강에 유해하다.
- 파라핀과의 교류 크실렌. 2 : 1 크실렌 30 분간 파라핀, 1 : 1 크실렌 30 분간 파라핀, 1 : 1 크실렌 30 분간 파라핀, 100 % 파라핀 58 °의 C - 오븐 (54)에 설정된 진공에서 다음 단계를 수행 1 - 2 시간, 1 100 % 파라핀 - 2 시간 또는 하룻밤.
참고 :이 파라핀 중합체를 분해하고 단단하고 부서지기 쉬운 것 때문에 파라핀 시간의 연장 기간 동안 60 ° C를 넘지 않도록하십시오. - 드 신선한 새로운 파라핀과 동양 조직에 포함파라핀이 경화되기 전에 희망하는. 스위스 롤의 경우, 조직 paraffinization 다음, 파라핀 삽입하는 동안 옆에 각 롤의 위치를 변경하는 것이 중요합니다. 이 절단시 각 롤의 전체 길이의 부분이 생성 될 것임을 보장한다.
- 염색의 경우, 마이크로톰을 사용하여 5 μm의 두께 부분을 잘라. ; 충전 슬라이드에 섹션을 수집하고 오븐에서 밤새 65 ° C에서 그 (빵)을 건조 실온에 시원하고 연속적으로 염색을 위해 그들을 사용 할 수 있습니다.
주 : 소성 시간은 1로 단축 할 수있다 - 슬라이드 얼마나 갓 절단에 따라 2 시간. 절편 이후 한 달 미만의 경우는 하룻밤 구워하는 것이 좋습니다. 한 달 이상 되었다면, 1 - 2 시간의 소성 시간을 저장하기에 충분하다. 시간이 부족하면, 밤새 백업은 항상 사용할 수 있습니다.
3. 조직 학적 분석 및 면역 형광 염색법
조직 학적 분석 및 immunoflu를 수행orescence 염색은 이전의 수정, 23, 24을 설명했다. 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 면역의 경우 :
- 1 시간 동안 65 ° C 오븐에서 슬라이드 구워 내생 알칼리 포스 파타 아제 활성을 비활성화하고 이후 자일 렌에 deparaffinize.
- 내인성 퍼 옥시다아제 조직을 차단 메탄올 중 3 % 과산화수소 욕 섹션을 인큐베이션; 다음 10 분 동안 125 ° C에서 구연산 완충액 항원 회수 하였다 감소 알코올 욕 시리즈 (100 %, 95 %, 70 %)에서 배양 (10 mM의 시트르산 나트륨, 0.05 % 트윈 20, pH를 6.0) 재수 decloaking 챔버를 사용하여.
- 소수성 장벽을 제공 펜을 표시하여 조직 섹션 주위에 원을 그리고 (EGFP에 대한 일차 항체로 다음 희석 한을 37 ° C에서 30 분 동안 (TBS-트윈 2.5 % 소 혈청 알부민 [BSA]) 버퍼를 차단과 함께 섹션을 품어 : 밤새 가습 실에서 4 ° C에서 500) 부드럽게 흔들어 섞으면.
- 부분을 세척하고 37 ℃에서 30 분 동안 적절한 농도로 형광 표지 된 이차 항체와 함께 품어.
- 훽스트 2 차 항체 처리 및 얼룩 핵 후 슬라이드를 세척하고 설치 미디어를 탑재합니다.
- Klf5 / EGFP / 기-67 공동 염색의 경우, 프로세스 슬라이드 단계 3.1에 설명 된대로 - 3.3 Klf5 항체 (희석 1 : 150)을 배양하여 Klf5 염색을 수행 하룻밤.
- 프로토콜에 따라 슬라이드에 토끼 AP 폴리머 검출을 적용합니다.
- Klf4는 제조 업체의 프로토콜에 따라 발색 면역 조직 화학 염색을 이용하여 염색 알 수있다.
- 이전에 기술 된 프로토콜 25을 사용하여 항체 용출을 수행합니다. 글리신 - SDS에서 50 ° C (산도 2.0) 1 시간 동안 교반 솔루션에서 슬라이드를 품어.
- 세척하고 증류수로 충분히 슬라이드 및 37 ° C에서 30 분 동안 (TBS 트윈 - 2.5 %의 BSA) 블로킹 완충액으로 배양한다.
- 기-67 추가 (희석 1 : 500)와 EGFP (희석 1시 50분0) 동시에 항체 및 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
- (데이터는 도시하지 않음) 훽스트 염색하기 전에 적절한 보조 항체와 형광 검출을 수행하고 매체를 장착 마운트.
- 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 26 5 μm의 섹션을 염색에 조직의 조직 학적 형태를 관찰한다. 형광 이미지의 각각 EGFP, Klf5 및 기-67 염색을 시각화 535, 646, 700의 방출 파장을 사용합니다.
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Representative Results
면역 조직 화학 염색과 함께 스위스 압연 기술은 작거나 큰 장 조직의 포괄적 인 분석이 가능합니다. C57BL / 6 마우스 (그림 1)의 대장의 H & E 염색의 예는 타당성의 그림과이 기술의 효과이다. 근위, 중간 및 말단도 1에 도시 된 바와 같이, 화상이 대장 모든 부분을 캡쳐 할 수있다. 따라서, 광범위한 조직 학적 평가를 허용한다. 스위스 롤과 크고 작은 창자 조직의 전체 길이를 캡처하는 능력은 이종 유전자 발현 마커 염색 또는 모욕 장 조직의 가변 응답 매우 유용하다.
예 Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스에서 EGFP 염색 패턴이다. 이 마우스 모델에서, EGFP의 발현에 의해 구동되고만 활발하게 증식 장 지하실에서 활성 Lgr5 프로모터,. 유전자의 발현 - (10 % 대략 5) 침투 또한이 마우스 모델은 낮은 것을 특징으로한다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 장 조직의 EGFP 발현 패턴은 가변적이다. 따라서, 조직의 큰 뷰를 캡처하는 능력은 관심 영역을 식별하는 것을 돕는다.
여기에 설명 된 기술은 특히 multifluorophore 염색의 응용 프로그램과 함께 강력하다. 여기서는 스위스 롤 기술을 사용하여 제조 된 장 조직 trifluorophore 얼룩의 예를 보여준다. 본 연구의 주된 목적은 Lgr5 마커를 발현하는 장 줄기 세포의 유지에 Klf5의 역할을 조사 하였다. 따라서, 우리는 Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스의 Lgr5 양성 장 줄기 세포에서 Klf5을 삭제 날에 장 조직을 수집첫 번째 타목시펜 주사 후 14. 면역 조직 학적 분석을 위해, 조직은 수행 된 EGFP (Lgr5 마커) Klf5 및 기-67에 대해,이 논문에서 제시된 프로토콜 및 염색에 따라 제조 하였다. Lgr5-EGFP / CreER T2로 표시 제어 마우스, 두 조사 시점에서 Klf5 및 기-67 EGFP 양성 (파란색 화살표로 표시) 및 EGFP 음성 지하실 (흰색 화살표로 표시) 전시 공동 염색 모두에서 도 3D에 도시 된 바와 같이. 반면, Lgr5-EGFP / CreER T2에서 / Klf5는 FL / FL 소장 조직, Klf5는 / 기는-67 공동 염색에서 EGFP 양성 CBC 줄기 세포에서 누락 (파란색 화살표로 표시) 만 존재 한 EGFP 음성 도 3H에 도시 된 바와 같이, (흰색 화살표로 표시됨) 녹색 지하실 인접 지하실. 이것은 여기에 제시된 티슈 제조 기술을 염색 품질에 부정적인 영향을주지 않는 우수한 예이다.
C57B의 L / 6 마우스. 표시됨에서 대장 그림 1. H & E 염색은 대장의 전체 길이의 복합 이미지입니다. 검은 색과 오렌지색 선이 중간을 표시하고, 오렌지 라인과 오렌지 화살표 사이에 대장의 말단 부분을 표시 사이의 검은 색 화살표와 검은 선 사이의 부분은 근위 부분을 표시합니다. 스케일 바 = 1000 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스의 소장 그림 2. 면역 형광 염색. E의 합성 이미지Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스의 소장 섹션의 GFP (라벨 Lgr5 양성 상피 세포) 염색. Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스의 지하실에 Lgr5-에 postive 상피 세포 레이블 단백질 마커 (EGFP)의 이종 면역 형광 염색의 예. 핵 훽스트와 시각입니다. 흰색 화살표는 EGFP 발현에 대한 긍정적 인 지하실을 표시합니다. 스케일 바 = 500 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Lgr5-EGFP / CreER T2 그림 3. Klf5 삭제는 / Klf5는 FL / 플라이 마우스는 Lgr5-EGFP 양성 납골당에서 장기 지속. T2 제어 및 Lgr5-EGFP / CreER T2 날에 / Klf5는 FL / FL 마우스를 각각 첫 번째 타목시펜 주사 후 십사일, 대표 소장 조직이다. 패널 AD는 동안은 Lgr5-EGFP / CreER T2의 패널 EH 쇼 염색 담당자 / Klf5는 FL / FL 마우스 Lgr5-EGFP / CreER T2 제어 마우스에서 수집 한 조직에서 염색의 대표입니다. 빨간색 패널 A와 E 표시 Klf5의 면역 염색; 패널 B와 F는 녹색 EGFP 염색을 보여; 노란색 패널 C와 G 쇼 기-67 염색; 및 패널 D와 H 쇼 Klf5, EGFP 및 기-67 얼룩의 이미지를 합병했다. 파란색 화살표가 녹색으로 지하실을 가리; 흰색 화살표는 병합 된 이미지에서 nongreen 지하실을 가리 킵니다. Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 FL / FL 마우스 만 EGFP 표지 CBC 셀 14 Klf5 장기 손실을 보였다. 스케일 바 = 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
스위스의 압연 기술은 대규모 조직 학적 및 형태 학적 평가 소장 조직을 제조하기위한 강력한 방법이다. 원래 동결 절편 (18, 19)의 제조를 위해 개발 된 전술 스위스 압연 기술과는 대조적으로, 여기에서 제시된 방법은 포르말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직에 대한 신속한 장 준비 및 고정 할 수있다. 냉동 된 조직과 비교 FFPE 조직 훨씬 긴 수명을 갖고 있기 때문에 더 조직 무결성 조직 학적 분석을 위해 조직의 바람직한 형태이다. 스위스 압연 프로토콜의 중요한 부분은 압연 및 염색 postfixation의 스위스 롤 무결성 및 조직의 품질을 유지하기위한 조직의 유연성을 포함한다. 장 조직 FFPE 표준 스위스 롤 기법은 일반적 힘들고 시간 소모적 (2 일) (18, 19)이다. 또한,이 표준 방법은 일반적으로 R은 소장 조직을 수득elatively 뻣뻣하고 쉽게되지는 스위스 롤에 형성한다. 10 % 포르말린에서 장 해부 조직 밤새 인큐베이션 조직 압연 전의 요구되기 때문이다. FFPE 목적 기술의 다른 변형도 개발되었지만, 이들은 장 조직의 경향이 큰 문제가 겹쳐서 및 / 또는 롤의 중심이 왜곡 될 때까지한다. 이 기술에 사용 된 조직은 소장에 의해 생성 된 점액으로부터 미끄러 미 정착 신선한 조직이기 때문이다. 여기에 도시 된 수정 된 새로운 기술 Bouin의 정착액의 변형 형태를 사용하여 이러한 문제점을 극복한다. 원래의 Bouin 고정액 아세트산, 에탄올, 피크르산 및 파라 포름 알데히드 (또는 포르말린)의 혼합물로 구성된다. 두 개의 가장 유해 성분 피크르산 및 파라 포름 알데히드 (또는 포르말린), 아세트산 / 에탄올 믹스 정착액 훨씬 안전한 사용을 허용하기 위해 제거되었다. 피크르산은 폭발 위험 및 parafor를 제공합니다maldehyde (또는 포르말린)는 암의 위험이 있습니다. 개질 Bouin의 정착액을 사용하는 의의는 (1) 원래의 식에 비해 덜 위험하다는 것이다, (2) 대부분의 실험실에서 쉽게 사용할 수있는 비교적 nonexpensive 시약 제조 용이하고, (3) 신속 허용, 거의 즉시, 조직의 고정은 세척을 위해 사용될 때. 지식이 수정 된 기술을 사용하여 알려진 제한이 없습니다. 또한,이 혼합물과 빠른 정착은 대단히 훨씬 빠르고 쉽게 조직 압연을 허용, 장 조직의 미끄러짐을 줄일 수 있습니다. 이 정착은 조직 학적 및 면역 염색 분석을위한 조직과 세포 무결성의 우수한 보존 할 수 있습니다. 따라서, 장내 티슈 제조하는 다른 방법에 비해이 개선 된 기술은 크게 속도 및 사용 용이성을 향상 여러 가지 기술적 인 문제와 보조금을 극복한다.
또한,이 수정 정착 다른 두께로 사용하는 것이 유용하다빠른 고정을 필요로 조직. 때문에하면서 동시에 진행 정착시 두꺼운 조직의 빠른 침투 능력을 갖고, 아세트산 및 에탄올의 특성 중. 우리는 신속하게 간, 비장, 신장으로 두꺼운 조직을 해결하기 위해 성공적으로 사용하고 있습니다. 20 분 - 예를 들어, 변성 Bouin의 정착액을 이용하여 성인 마우스 전체 간 고정술은 보통 15에서 이루어진다. 이것은 쉽게 간으로 단면을 절단 간 깊은 영역은 회색으로 혈액 - 붉은 색으로 변화했는지 관찰하여 판단 할 수있다. 색의 변화는 정착 나타낸다. 조직이 이미이 시점에서 고정 된 바와 같이, 변형 된 세포 / 조직 구성의 두려움과 48 시간 -이 고정 후 (24)에 대한 완충 포르말린을 사용하여 가교옵니다.
깊은 조직 fixati을 달성하기 위해 48 시간 - 비교함으로써, 전체 성인 마우스 간에서 단독으로 사용하는 기존 완충 포르말린 고정 방법 24을 필요에 깊은 조직의 변형 된 세포 조성물의 위험. 두꺼운 조직의 빠른 정착 방법은 신체로부터 장기 / 조직의 제거에 이어 저산소증과 같은 조건, 스트레스에 응답하여 최소한으로 세포 성분의 변화를 감소시키는 우수한 장점을 갖는다. 우리는 수정 정착이 요구되는 두께의 조직 / 기관의 고정 더 빠른 방법으로 동물의 혈류에서 사용할 수 있음을 예상하고있다. 따라서, 결론에서,이 방법을 수정 정착 신속하게 다른 두께의 조직 / 장기를 해결하는 데 사용할 수있는 장 조직 수확 및 고정 및 수정 정착에 사용되는 기존의 방법에 비해 여러 장점을 제공한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10 ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1:150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1:500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
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