Summary
Nøyaktig identifikasjon og plassering av epitelceller langs intestinal mucosal fôr er viktig å definere ulike celle linjene. Riktig avbildning av intestinal vev er avgjørende for identifisering av protein uttrykk mønstre med maksimal oppløsning. Denne studien tar sikte på å avgrense de optimale metoder og forhold for prosessering musetarmvevet.
Introduction
Pattedyr tarmepitelet omfatter et enkelt lag av søyleceller. I tynntarmen, blir de proliferative cellene begrenset til krypter mens differensierte cellene opptar villus-regionen. Imidlertid, fordi det ikke er noen villi i tykktarmen, er de proliferative cellene lokalisert til bunnen av kryptene og differensierte celler opptar det øvre område av kryptene. Tarmepitelet gjennomgår hurtig etterfylling (ca 3 - 5 dager) som er drevet ved kontinuerlig oppdeling av proliferative celler i kryptene. De proliferative celler av krypter er ikke en homogen populasjon, og er videre delt inn i stamceller og transitt-amplifisering (TA) celler 1. Stamcellene ligge på bunnen av krypten, i løpet av de første 4 - 5 celler fra bunnen 2. Den nåværende modellen støtter eksistensen av to typer stamceller: krypten basen søyle (CBC) stamceller og reserve stille stamceller. CBC stem celler er aktivt prolifererende og er merket med leucine-rik gjenta holdige G-proteinkoblet reseptor 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 og Achaete scute lignende 2 (Ascl2) 5. På den annen side, er reserve stille stamceller merket med B-celle-spesifikke Moloney murine leukemi virus integrering for 1. (Bmi1) 6, mus telomerase revers transkriptase (mTert) 7, HOP Homeobox (Hopx) 8, Doublecortin-aktig og CAM Kinase -lignende 1 (Dclk1) 9, og leucin-rich gjentar og immunoglobulin-lignende domener 1 (Lrig1) 10. De aktivt prolifererende stamceller gir opphav til TA cellene deretter gjennomgå ytterligere differensiering i absorberende celler (entero) og sekretoriske celler (enteroendocrine, beger, Paneth, og tuft celler). Kontinuerlig celledelingen i den proliferative sonen resulterer i oppadgående bevegelse av epitelceller langs krypten-villus akse inntil de når toppen av villi, hvor de gjennomgår apoptose og ersloughed av fra overflaten av epitelet. De ulike typene av intestinale epitelceller er preget av uttrykket av ulike proteiner (f.eks, kan tarmslimceller bli gjenkjent av farging med antistoff mot Muc2 og Paneth celler med antistoff mot lysozym). Vi studere rollen til Krüppel-lignende faktorer (KLFs) i homeostase og patobiologi av tarmepitelet 11-13. Resultatene som presenteres her støtter gjennomførbarheten av en modifisert Swiss-valseteknikk er basert på tidligere undersøkelser av rollen til Krüppel-lignende faktor 5 (KLF5) i vedlikehold av aktivt prolifererende intestinale epitelceller stamceller 14. KLF5 er en sink-finger transkripsjonsfaktor som er sterkt uttrykt i aktiv tarm stammen og TA celler 12. Tidligere studier har vist at KLF5 er co-uttrykkes med Ki-67, en kjent proliferativ markør i tarm krypter.
Mage-tr handling er ikke et strukturelt eller funksjonelt homogen vev. Tynntarmen er delt inn i duodenum, jejunum og ileum og tykktarmen inn i cecum og tykktarm, med den sistnevnte videre delt inn proksimale, midtre og distale deler. Hver av disse seksjonene har unike histologiske funksjoner og spiller forskjellige roller 15. Som sådan, kan virkningene av fornærmelser og graden av responsen til tarmepitelet er avhengig av området av undersøkt vev 16. I tillegg er forskjellige musestammer demonstrere mangfold av responsen på det histologiske nivå basert på den type av fornærmelse anvendt i studiene 16. Således som gjenspeiler dette vevspreparatet er nødvendig for å tillate passende histologiske og molekylær analyse av tarmvevet. Som sådan, Swiss-rull teknikk tilskudd analyse av hele lengden av tarmepitelet på en gang og dermed konstaterer velinformerte konklusjoner basert på omfattende informasjon.
e_content "> The Swiss-roll teknikken ble først nevnt av Magnus 17, og beskrevet i detalj av Moolenbeck og Ruitenberg og Park et al. som en metode for å forberede vev og utføre histologisk analyser av gnager tarmen 18,19, henholdsvis. Protokollen skissert i denne publikasjon viser en forbedret versjon av den opprinnelige metode som tillater for presis og pålitelig vev forberedelse for diagnostiske formål. denne modifiserte teknikken gjør det mulig for effektiv samlinger og fremstillingen av tarmepitelet for universelt brukte teknikker, slik som immunhistokjemi, immunfluorescens, såvel som in situ hybridisering (fluorescerende og kromogen 20). Videre er det modifiserte vev prøven fremstillingsmetode utnytter lett tilgjengelige og relativt rimelige reagenser samtidig som de gir en fremgangsmåte for hurtig vev fiksering og gjør det mulig for utvinning av protein, DNA og RNA for ytterligere evaluering. Tatt sammen, this teknikken er utmerket for helhetlig vurdering av histopatologiske, patologiske og molekylære funksjoner i tarmepitelet.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mice
- Alle studier med mus ble godkjent av Stony Brook University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). Musene ble opprettholdt på en 12:12 timers lys-mørke-syklusen.
- Kommersielt oppnå C57BL / 6 mus. Skaff C57BL / 6 mus som bærer Klf5 alleler flankert av loxP nettsteder (Klf5 f l / f l). Disse musene ble tidligere beskrevet 21 og graciously levert av Dr. Ryozo Nagai.
- Kjøp C57BL / 6 mus som bærer induserbar Cre rekombinasegenet etter regulering av Lgr5 promoter (Lgr5-EGFP / CreERT2 mus).
- Å etablere Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 f l / f l mus, krysse Klf5 fl / f l mus med Lgr5-EGFP / Creer T2 mus og deretter backcross avkommet til Klf5 fl / f l mus.
- Treat mus med tamoxifen som per protokoll tidligere beskrevet 22. Injisere 8 uker gamle eksperimentelle og kontrollmus intraperitonealt (IP) med 1 mg av tamoxifen (10 mg / ml), oppløst i sterilt maisolje, i 5 påfølgende dager.
- På dag 14 etter første injeksjon tamoxifen, ofrer mus ved hjelp av CO 2 kvelning ved å plassere dem i et kammer forbundet til CO 2 gasskilde. At gassen kan strømme inn i kammeret inntil mus er bevisstløs, og all bevegelse opphører. For å sikre aktiv dødshjelp utføre halshugging.
2. Tissue Forberedelse og sveitsiske Rolling
- Ved hjelp av disseksjon pinsett og saks, klippe et snitt i huden av abdominal side. Med en pinsett, holde huden på snittet og trekk forsiktig bort fra abdominal muskelvev. Bruk en saks til å klippe abdominal hud og utsette magemusklene.
- Hold og dra opp peritoneum med pinsett. Sørg for ikke å være å holde og trekke i tarmen. Nøye lage et snitt i peritoneal vev og fortsette å kutte bort huden for å avsløre magemusklene. Nøye lage et snitt i magemusklene og fortsette å kutte dem bort for å avsløre tarmen.
- Identifiser kolon og spore til den distale enden der den møter rektum / anus. Med en saks, kuttet så nær analåpningen som mulig.
- Identifisere magen og spore hvor den møter med tynntarmen. Med en saks, klippe frigjøre tarmen ca 1 cm fra magen. Overfør hele lengden av den frigjorte tynntarmen og tykktarmen til en ren petriskål inneholdende fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Med en hånd eller en pinsett, holder den distale enden av tykktarmen og å bruke den andre hånden til forsiktig å løse hele lengden av tykktarmen fra en hvilken som helst mesenterisk bindevev og / eller fett vev.
- Identifiser cecum(Liten pose mellom tynn- og tykktarmen) og kuttet hvor cecum og tykktarmen delta (den proksimale enden av colon) for å frigjøre tykktarmen.
- Med en hånd eller en pinsett, hold tynntarmen og bruk den andre hånden til å forsiktig løse hele lengden av tynntarmen fra alle mesenteric bindevev og / eller fettvev. Skåret bort cecum og kast hvis det ikke er behov for den.
Merk: Prosessen kan stoppes her ved å inkubere dissekert ut tarmen i modifisert Bouin er fiksativ (50% etanol / 5% eddiksyre i dH 2 O) over natten og fortsetter prosedyren neste dag. - Håndtering ett segment av tarmen (tynntarmen eller tykktarmen), fylle en 10 ml sprøyte med modifisert Bouin er fiksativ og feste en sonde nål til det. Sett nålen omtrent en halv centimeter i den fremre åpningen av tarmsegmentet.
- Hold sonde nål inne i tarmsegment ved å bruke fast press med et instrumentpå tarmsegmentet. Med den andre hånden holder sprøyten, bruke milde men konsekvent press for å skylle innholdet av tarmsegment ved hjelp av modifisert Bouin er fiksativ. Dette trinnet tillater samtidig rengjøring av tarmsegmentet og øyeblikkelig fiksering. Bruke en petriskål for å samle gjennomstrømnings avfall. Fiksering kan bli observert av tykktarmen farge snu ugjennomsiktig.
Merk: Pass på å ikke bruke for mye press under spyling eller tarmsegmentet kan sprenge åpne. - Ved hjelp av saks, klippe åpne tarmsegmentet i lengderetningen langs mesenteric linje. Hold den med en pinsett og skyll den raskt i en petriskål med PBS.
- Skjær tynntarmen inn i 3 like store segmenter: proksimale, mid, og distal. Den proksimale segment er en rett etter magesekken, og det distale segment er en rett før tykktarmen. Den proksimale segment er ekvivalent til tolvfingertarmen, midten til jejunum og distale tilileum.
- For hvert segment markere den proksimale og den distale ende. Den proksimale enden er den som opprinnelig ble peker mot magen, og den distale pekte mot kolon.
- Bruk toppen av en petriskål for å plassere den rensede og åpnet tarmsegmentet. Plasser tarmsegmentet med luminal siden vendt oppover.
- For kolon, identifisere den luminale side av variegations / ryggene løper over dens bredde og er til stede på den proksimale enden. Midten og distal regioner har noen variegations som kjører langs. For tynntarmen, identifisere den luminale side av den grove-vises overflate, som markerer villi.
Merk: For tynntarmen, er det ingen ytre makroskopisk anatomisk avgrensning av proksimale, midtre og distale regioner. Men disse regionene kan være kan identifiseres i avsnitt under mikroskop. Villi er lengste i proksimale regionen og bli gradvis kortere distalt hvor de erden korteste lengde. Mikroskopisk, kryptene i kolon er kortest i det proksimale område som også kan identifiseres ved nærvær av rygger. Kryptene i kolon er høyeste i midtpartiet og kortere i den fjerne regionen likevel høyere enn i det proksimale området.
- For kolon, identifisere den luminale side av variegations / ryggene løper over dens bredde og er til stede på den proksimale enden. Midten og distal regioner har noen variegations som kjører langs. For tynntarmen, identifisere den luminale side av den grove-vises overflate, som markerer villi.
- Fortsett med Swiss rulle kolon:
- Hold kolon flat åpen og dra den med pinsett fra sin proksimale enden mot kanten av petriskål.
- Hold luminal siden som vender opp og hold den proksimale ende med pinsett med den ene hånden og med den andre hånden holder en tannpirker.
- Pakk kanten av den proksimale ende rundt tannpirker ved hjelp av pinsett og litt klemme innpakket kanten mot tannpirker for å holde den på plass.
- Forsiktig og sakte begynne å rulle tannpirker med fingrene å rulle kolon rundt tannpirker for å danne en rullekake.
- Når hele tykktarmen lengde er rullet opp, kan du bruke en pinsett til å nøye skyve cOlon Swiss roll off tannpirker og inn i en vev-prosessering / -embedding kassett. Plassere kassetten i 10% bufret formalin over natten ved romtemperatur.
- Fortsett med Swiss rulle tynntarmen:
- Håndtering ett segment av gangen, holde segmentet flat åpen med luminal side opp og dra den med pinsett fra sin proksimale enden mot kanten av petriskål.
- Fortsett med Swiss rullende som beskrevet for kolon.
- Fortsett med behandlingen formalinfiksert vev for parafin innebygging. Gjør som følger:
MERK: Bruk en automatisert prosessor (se materialer og utstyr er for detaljer).- Mens vev er i kassetten, skyll vev med PBS inntil fikseringsmiddel er fullstendig fjernet.
- Dehydrere vev ved hjelp av etanol i følgende rekkefølge: 50% etanol i 10 min, 70% etanol i 10 min, 80% etanol i 10 min, 95% etanol i 10 min, 100% etanol i 10 min, 100% etanol i 10 min og ett00% etanol i 10 min.
- Utveksling etanol med xylen i følgende rekkefølge: 2: 1 etanol: xylen i 10 - 15 min, 1: 1 etanol: xylen i 10 - 15 min, 1: 2 etanol: xylen i 10 - 15 min, 100% xylen 10 - 15 min, 100% xylen i 10 - 15 min, og 100% xylen i 10 - 15 min. FORSIKTIG: Xylen er helsefarlig, og dermed arbeidsplassen bør være utstyrt med en lokal avtrekksventilasjon med en skikkelig hette og riktig verneutstyr skal være wore av personell.
- Utveksling xylen med parafin. Utføre følgende trinn i en vakuum-ovn innstilt på 54-58 ° C: 2: 1 xylen: parafin i 30 min, 1: 1 xylen: parafin i 30 min, 1: 2 xylen: parafin i 30 minutter, 100% parafin 1 - 2 timer, og 100% parafin, 1 - 2 timer eller over natten.
Merk: Ikke la parafin over 60 ° C i lengre perioder av gangen, fordi dette vil forringe parafin polymerer og gjøre det vanskelig og sprø. - Embed i frisk ny parafin og orientere vev som desired før parafinen stivner. For de sveitsiske rundstykker, følgende vev paraffinization, er det viktig å flytte hver rull på sin side under parafin innebygging. Dette sikrer at under skjæring, vil deler av hele lengden av hver valse bli produsert.
- For farging, kuttet 5-mikrometer tykke seksjoner ved hjelp av mikrotom. Samle avsnittene om ladede lysbilder og tørk dem (bake) i en 65 ° C ovn over natten; la avkjøles til romtemperatur og ble deretter brukte dem for farging.
Merk: Steketiden kan kortes ned til 1-2 timer avhengig av hvor nyklipt lysbildene er. Hvis mindre enn en måned siden seksjonering, så er det lurt å bake over natten. Hvis det har gått mer enn en måned, deretter 1-2 timer av bakervarer er tilstrekkelig for å spare tid. Hvis du kjører ut av tid, kan over natten backing alltid brukes.
3. Histologisk analyse og immunfluorescens Farging
Utfør histologisk analyse og immunofluorescence farging som tidligere beskrevet 23,24, med modifikasjoner. For forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) immunfluorescens:
- Stek glir i en 65 ° C ovn i 1 time for å inaktivere endogen alkalisk fosfatase-aktivitet og påfølgende deparaffinize i xylen.
- Inkuber seksjoner i et bad med 3% hydrogenperoksid i metanol for å blokkere endogent vev peroksydaser; deretter rehydratiseres ved inkubasjon i en avtagende alkohol bad serien (100%, 95%, 70%), etterfulgt av antigen gjenfinning i citrat-bufferoppløsning (10 mM natriumcitrat, 0,05% Tween-20, pH 6,0) ved 125 ° C i 10 min ved hjelp av en decloaking kammer.
- Tegne en sirkel rundt vevssnitt ved hjelp av merkepenn som gir hydrofob barriere og inkuber seksjoner med blokkeringsbuffer (2,5% bovint serumalbumin [BSA] i TBS-Tween) i 30 minutter ved 37 ° C og deretter med primært antistoff mot EGFP (fortynning 1 : 500) ved 4 ° C over natten i en fuktet kammer under forsiktig rysting.
- Vask seksjoner og inkuberes med fluorescent-merkede sekundære antistoff ved den passende konsentrasjon i 30 minutter ved 37 ° C.
- Vask slides etter videregående antistoff behandling og beis kjerner med Hoechst og monter med monterings media.
- For Klf5 / EGFP / Ki-67 co-flekker, prosess lysbilder som beskrevet i trinn 3.1 - 3.3 og utføre Klf5 farging ved inkubasjon med Klf5 antistoff (fortynning 1: 150) over natten.
- Påfør kanin AP polymer deteksjon til lysbilder som per protokoll.
- Avslør Klf4 flekker ved hjelp av kromogen immunhistokjemisk farging som per produsentens protokoll.
- Utføre antistoff eluering ved bruk av den tidligere beskrevne protokoll 25. Inkuber objektglass ved 50 ° C i Glycin-SDS (pH 2,0) oppløsning under omrøring i 1 time.
- Vask glir grundig med destillert vann og inkubert med blokkeringsbuffer (2,5% BSA i TBS-Tween) i 30 minutter ved 37 ° C.
- Legg Ki-67 (fortynning 1: 500) og EGFP (fortynning 1:500) antistoffer samtidig og inkuber ved 37 ° C i 1 time.
- Utfør fluorescerende deteksjon med passende sekundære antistoffer før farging med Hoechst (data ikke vist) og monter med monteringsmedium.
- Observer histologisk morfologi av vevet på beising 5-mikrometer seksjoner med hematoxylin og eosin (H & E) 26. For fluorescerende bilder, bruker emisjonsbølgelengder av 535, 646 og 700 for å visualisere EGFP, Klf5, og Ki-67 flekker, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det sveitsiske valseteknikk i kombinasjon med immunhistokjemisk farging gir mulighet for fullstendig analyse av små eller store tarmvevet. Eksemplet med H & E farging av et stort tarm av en C57BL / 6 mus (figur 1) er en illustrasjon av gjennomførbarheten og effektiviteten av denne teknikken. Som vist i figur 1, er bildet i stand til å fange opp alle partier av tykktarmen: proksimale, midtre og distale. Dermed gir det mulighet for omfattende histologisk vurdering. Den sveitsiske rullende og evnen til å fange opp hele lengden av små eller store tarmvevet er svært nyttig for heterogene genekspresjon og markør flekker eller en variabel respons i tarmvevet til fornærmelse.
Et eksempel er den EGFP fargemønsteret i Lgr5-EGFP / Creer T2 mus. I denne musemodell, blir ekspresjon av EGFP drevet avLgr5 arrangøren, som er aktiv bare i de aktivt prolifererende tarm krypter. I tillegg er denne musemodell kjennetegnet ved lav (ca. 5 - 10%) pene av transgen ekspresjon. Som vist i figur 2, den EGFP uttrykksmønster i tarmvevet er variabel. Følgelig er evnen til å fange et stort riss av vev bidrar til å identifisere regionen av interesse.
Teknikken som beskrives her er kraftig, spesielt med bruk av multifluorophore farging. Her viser vi et eksempel på trifluorophore farging av tarmvevet som ble fremstilt ved anvendelse av Swiss-rull teknikk. Hovedformålet med denne studien var å undersøke hvilken rolle Klf5 i vedlikehold av tarm stamceller uttrykker Lgr5 markør. Derfor slettet vi Klf5 fra Lgr5-positive tarm stamceller i Lgr5-EGFP / Creer T2 mus og samlet intestinal vev på dagen14 etter første tamoxifen injeksjon. For immunhistokjemi analyse, ble vevene fremstilt i henhold til protokollen som presenteres i dette manuskriptet, og farging for EGFP (Lgr5 markør), Klf5, og Ki-67 ble utført. I kontroll mus, betegnet som Lgr5-EGFP / Creer T2, både EGFP-positive (merket med blå piler) og EGFP-negative krypter (merket med hvite piler) viste co-farging for Klf5 og Ki-67 på to undersøkte tidspunkter som vist i Figur 3D. I motsetning til i Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 fl / fl liten tarmvevet, Klf5 / Ki-67 co-farging ble mangler fra EGFP-positive CBC stamceller (merket med blå piler), men til stede i EGFP-negative krypter tilstøtende de grønne krypter (merket med hvite piler), som vist i figur 3H. Dette er et utmerket eksempel på at vevet forberedelse teknikker som presenteres her ikke negativt påvirke farging kvalitet.
Figur 1. H & E Farging av en tykktarms fra et C57B L / 6 mus. Vist er det sammensatte bildet av hele lengden av tykktarmen. Delen mellom den svarte pilen og svart linje markerer den proksimale del, mellom de svarte og oransje linjer markerer midten, og mellom den oransje linje og oransje pil markerer den distale delen av tykktarmen. Scale bar = 1000 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Immunofluorescensanalyse Farging av en liten tarm av en Lgr5-EGFP / Creer T2 Mouse. Composite bilde av EGFP (merking Lgr5-positive epitelceller) farging av tynntarmen deler av en Lgr5-EGFP / Creer T2 mus. Eksempel på heterogene immunfluorescens farging av protein markør (EGFP) som etiketter Lgr5-postive epitelceller i krypter i Lgr5-EGFP / Creer T2 mus. Kjerner er visualisert med Hoechst. Hvite piler markere krypter positive for EGFP uttrykk. Scale bar = 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Klf5 sletting i Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 fl / fl Mus vedvarer Long Term i Lgr5-EGFP-positive krypter. T2-kontroll og Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 fl / fl mus på dag 14 dagen etter første tamoxifen injeksjon, henholdsvis. Paneler AD er representative for flekker fra vev hentes fra Lgr5-EGFP / Creer T2 kontroll mus, mens panelene EH showet farging representative for Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 fl / fl mus. Paneler A og E skjerm Klf5 immunfluorescens farging i rødt; paneler B og F viser EGFP flekker i grønt; paneler C og G viser Ki-67 flekker i gult; og paneler D og H viser fusjonert bilder av Klf5, EGFP og Ki-67 flekker. Blå piler peker grønne krypter; hvite piler peker nongreen krypter i det fusjonerte bilder. Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 fl / fl mus viste langsiktig tap av Klf5 bare i EGFP-merket CBC celler 14. Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den sveitsiske rullende teknikken er en kraftig metode for fremstilling av tarmvevet for histologisk og morfologisk vurdering på en stor skala. I motsetning til den tidligere beskrevne Swiss-valseteknikk, som opprinnelig ble utviklet for fremstilling av frosne seksjoner 18,19, fremgangsmåten som presenteres her muliggjør rask tarmvevet forberedelse og fiksering for formalin fiksering og forankring parafin (FFPE). Sammenlignet med frossent vev, har FFPE vev mye lengre holdbarhet og er den foretrukne type vev for histologisk analyse på grunn av bedre vev integritet. Kritiske deler av Swiss-rullende protokollen involverer vev fleksibilitet for rullende og vedlikehold av Swiss-rull integritet og kvalitet vev for farging postfixation. Standarden Swiss-rull teknikk for FFPE av tarmvevet er typisk arbeidskrevende og tidkrevende (2 dager) 18,19. I tillegg gir denne standard metode gir vanligvis intestinal vev som er relatively stiv og ikke lett å danne en rullekake. Dette er fordi inkubering over natten av den dissekerte tarmvevet i 10% bufret formalin er nødvendig før vev rulle. Andre modifikasjoner av den teknikk for FFPE formål er også blitt utviklet, men de har et stort problem av tendensen til tarmvevet for å rulle og / eller for sentrum av rullen for å bli forvrengt. Dette er fordi det vev som brukes i disse teknikkene er frisk ufiksert vev, som er glatte fra slim produsert av tarmen. Den nye modifiserte teknikken som her overvinner disse problemer ved hjelp av en modifisert form av Bouins fiksativ. Original Bouins fiksativ består av en blanding av eddiksyre, etanol, pikrinsyre og paraformaldehyd (eller formalin). De to mest skadelige komponenter, pikrinsyre og paraformaldehyd (eller formalin), er eliminert for å tillate mye tryggere bruk av fikseringsmiddel med et eddiksyre / etanol-blanding. Pikrinsyre presenterer en tennkilde, og paraformaldehyde (eller formalin) er en kreft fare. Betydningen av å bruke den modifiserte Bouins fiksativ er at det (1) er mindre farlige i forhold til sin opprinnelige formelen, (2) er lett å fremstille med relativt nonexpensive reagenser som er lett tilgjengelig i de fleste laboratorier, og (3) tillater en rask, nesten øyeblikkelig, fiksering av vevet når det brukes til spyling. Til kunnskap, er det ingen kjente begrensninger ved bruk av denne modifiserte teknikk. I tillegg er den hurtigfiksering med denne blanding umåtelig reduserer slipperiness av tarmvevet, noe som gir mye raskere og enklere vev rulle. Dette fiksativ gir også mulighet for god bevaring av vev og celle integritet for histologisk og farging analyse. Derfor, i forhold til andre metoder for tarmvevet forberedelser, overvinner dette forbedret teknikk flere tekniske problemer og tilskudd kraftig forbedret hastighet og brukervennlighet.
Dessuten er dette endret fiksativ nyttig å bruke med andre tykkvev som krever rask fiksering. På grunn av innholdet av eddiksyre og etanol, som har kapasitet til rask gjennomtrengning av tykk vev, mens på samme tid som gjennomgår fiksering. Vi har brukt det med hell å raskt fikse tykk vev som lever, milt og nyrer. For eksempel, er fiksering av en voksen mus hel lever ved bruk av den modifiserte Bouins fiksativ vanligvis oppnås i løpet av 15 - 20 min. Dette kan lett bedømmes ved å skjære et tverrsnitt inn i leveren og observere hvorvidt de dype deler av leveren hadde endret farge fra blod-røde til grå. Endringen i farge er en indikasjon på fiksering. Denne fiksering blir så fulgt av tverrbinding ved hjelp av formalin til 24 - 48 timer uten frykt for endrede cellulære / vev sammensetning, som vevet er allerede festet ved dette punktet.
Til sammenligning ville bruken tradisjonelle bufret formalin-fiksering metoden alene på en voksen mus hel lever kreve i 24 - 48 timer for å oppnå dype vev fixatipå, med risiko for endrede cellulære sammensetning av dype vev. De raske fiksering av tykke vev har overlegen fordel av å redusere til et minimum av endring av cellulære komponenter som reaksjon på stress tilstander, slik som hypoksi, etter fjerning av det organ / vev fra kroppen. Vi regner med at den modifiserte fiksativ kan brukes i dyr perfusjon som en enda raskere måte å feste tykke vev / organer er ønsket. Således, i konklusjon, denne metoden og modifiserte fikseringsmiddel gir flere fordeler i forhold til tradisjonelle metoder som brukes for tarmvevet høsting og fiksering og den modifiserte fiksativ kan brukes til raskt å feste andre tykke vev / organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10 ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1:150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1:500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
- Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
- Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
- Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
- May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
- Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
- Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
- McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
- McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
- Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
- Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
- Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, Pt 1 115-120 (1987).
- Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
- Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
- el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
- McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
- Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, pdb prot4986 (2008).
