Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Улучшенная техника швейцарско-прокатка для Кишечные Подготовка ткани для иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного анализов

Published: July 13, 2016 doi: 10.3791/54161
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Department of Medicine, Stony Brook University School of Medicine, 2Department of Physiology & Biophysics, Stony Brook University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Точная идентификация и расположение эпителиальных клеток вдоль кишечной слизистой оболочки имеют важное значение для определения различных клеточных клонов. Правильная визуализация кишечных тканей имеет решающее значение для идентификации паттернов экспрессии белка с максимальным разрешением. Это исследование направлено на очертить оптимальные методы и условия для обработки мыши кишечных тканей.

Introduction

Эпителий кишечника млекопитающего содержит единственный слой столбчатых клеток. В тонкой кишке, пролиферативные клетки ограничены крипт в то время как дифференцированные клетки занимают область ворсинок. Тем не менее, так как нет ворсинки в толстой кишке, пролиферативные клетки локализуются в нижней части крипт и дифференцированные клетки занимают верхнюю область крипт. Кишечный эпителий претерпевает быстрое пополнение (около 3 - 5 дней), который приводится в движение непрерывным делением пролиферативных клеток в криптах. В пролиферативные клетки крипт не являются однородной популяции и подразделяются на стволовые клетки и транзитные-амплификации (TA) клеток 1. Стволовые клетки находятся в нижней части крипты, в течение первых 4 -х - 5 клеток от самого дна 2. Текущая модель поддерживает существование двух типов стволовых клеток: крипт база столбчатый (CBC) стволовых клеток и резервных покоящихся стволовых клеток. CBC sПЭМ клетки активно пролиферирующих и отмечены лейцин-богатый повтор содержащий G-белком рецептор 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 и Achaete щитка-как 2 (Ascl2) 5. С другой стороны, резервные покоящиеся стволовые клетки помечены B специфичного для клеток мышей Молони интеграции сайта вируса лейкоза 1 (Bmi1) 6, мыши теломеразной обратной транскриптазы (mTert) 7, хмель Гомеобоксный (Hopx) 8, даблкортин-Как и САМ - киназа -Как 1 (Dclk1) 9, и лейцин-Rich повторами и иммуноглобулин-подобных доменов 1 (Lrig1) 10. Активно пролиферирующие стволовые клетки дают начало клеткам TA затем подвергаются дальнейшей дифференциации в абсорбирующих клеток (энтероцитов) и секреторных клеток (энтероэндокринные, бокаловидных, Панет и хохолка клетки). Непрерывное деление клеток в пролиферативной зоне приводит к движению вверх эпителиальных клеток вдоль оси крипта-ворсинок, пока они не достигают вершины ворсинок, где они подвергаются апоптозу и являютсяотшелушиваются с поверхности эпителия. Различные типы эпителиальных клеток кишечника отмечены экспрессии различных белков (например, бокаловидных клеток тонкого кишечника могут быть признаны окрашиванием антителами против Muc2 и Paneth клеток с антителами против лизоцима). Мы изучаем роль Kruppel-подобных факторов (KLFs) в гомеостаза и патобиологии кишечного эпителия 11-13. Результаты , представленные здесь , поддерживая возможности модифицированного метода швейцарской прокатки основаны на предыдущих исследованиях роли Kruppel-подобный фактор 5 (KLF5) в поддержании в активно пролиферирующих эпителия кишечника стволовых клеток 14. KLF5 является фактором транскрипции цинковых пальцев , который высоко выражается в активной кишечной стволовых и клеток TA 12. Предыдущие исследования показали, что KLF5 совместно выражены с Ki-67, известного пролиферативного маркера в криптах кишечника.

Желудочно-кишечного тракта тр акт не является структурно или функционально однородная ткань. Тонкий кишечник делится на двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку и толстую кишку в слепую кишку и толстую кишку, причем последний дополнительно разделен на проксимальном, средней и дистальной части. Каждый из этих разделов имеет уникальные гистологические особенности и играет различные роли 15. Таким образом , эффекты инсультов и степень реакции на кишечный эпителий может зависеть от области исследуемой ткани 16. Кроме того, различные штаммы мышей демонстрируют разнообразие реакции на гистологическом уровне , основанного на типе инсульта , используемого в исследованиях 16. Таким образом, подобающую препарата ткани необходимо, чтобы обеспечить соответствующее гистологических и молекулярный анализ кишечных тканей. Таким образом, швейцарский ролл анализ методика грантов полной длины кишечного эпителия в одно время и, таким образом, удостоверяется обоснованные выводы на основе полной информации.

e_content "> Техника швейцарско-н - ролл был впервые упомянут Магнусом 17, и подробно описал Moolenbeck и Ruitenberg и Парк и др. , как способ получения тканей и выполнения гистологического анализа грызуна кишечника 18,19, соответственно. Протокола очерчены в данной публикации, представляет собой улучшенную версию оригинального метода, который позволяет для своевременной и надежной подготовки тканей для диагностических целей. Эта модифицированная методика позволяет эффективно коллекций и подготовки кишечного эпителия универсально используемых методов, таких как иммуногистохимии, иммунофлюоресценции, а также как (флуоресцентных и хромогенного 20) в месте гибридизации. Кроме того, модифицированная ткань образец способа получения использует легко доступные и относительно недорогие реагенты, предлагая метод быстрой фиксации тканей и позволяет для извлечения белка, ДНК и РНК для дополнительной оценки. Взятые вместе, Тхиs метод отлично подходит для комплексной оценки гистологических, патологических и молекулярных особенностей кишечного эпителия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Мыши

  1. Все исследования с участием мышей были утверждены Институциональный уходу и использованию животных комитета Stony Brook University (IACUC) путем. Мышей содержали в цикле свет-темнота 12:12 час.
    1. Коммерчески получить мышей C57BL / 6. Получить C57BL / 6 мышей , несущих аллели Klf5 фланкированные сайтов LoxP (Klf5 е л / ф л). Эти мыши были описаны ранее 21 и любезно предоставленные доктором Ryozo Нагаи.
  2. Приобретение / 6 мышей C57BL, несущие ген индуцибельной Cre рекомбиназы под регуляции промотора Lgr5 (Lgr5-EGFP / CreERT2 мышей).
  3. Для установления Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 F L / F L мышей, пересекают Klf5 фл / F L мышей с Lgr5-EGFP мышей / Creer Т2 , а затем обратного скрещивания потомство к Klf5 фл / F L мышей.
  4. Лечить мышей с тамоксифеном согласно протоколу описано ранее 22. Вводят 8-недельных экспериментальных и контрольных мышей внутрибрюшинно (IP) с 1 мг тамоксифена (10 мг / мл), растворенного в стерильном кукурузном масле, в течение 5 дней подряд.
  5. На 14 -й день после первой инъекции тамоксифена, пожертвуйте мышей с использованием СО 2 удушья, помещая их в камеру , соединенную с CO 2 источника газа. Дайте поток газа в камеру до тех пор, пока мыши находятся в бессознательном состоянии, и все движение прекращается. Для обеспечения эвтаназии выполнять шейки дислокации.

2. Подготовка ткани и швейцарской Роллинг

  1. Использование рассечение пинцет и ножницы, вырезать надрез в коже брюшной стороны. С парой щипцов, держать кожу в разрез и осторожно потяните в сторону от брюшной мышечной ткани. Используйте пару ножниц, чтобы разрезать брюшную кожу и подвергать мышцы живота.
  2. Удержание и подтянуть Пеritoneum с пинцетом. Убедитесь в том, чтобы не быть проведение и потянув на кишечнике. Осторожно сделать надрез в брюшную ткани и продолжают срезая кожу подвергать мышцы живота. Тщательно надрезать мышцы живота и продолжают сокращать их прочь выставить кишечник.
  3. Определение толстой кишки и трассировки к дальнему концу, где он соединяется в прямую кишку / задний проход. С ножницами, вырезать как можно ближе к анальное отверстие, как это возможно.
  4. Определить желудок и проследить, где она соединяется с тонкой кишки. С парой ножниц, освободи кишечник около 1 см от живота. Перенесите всю длину освобожденного тонкой кишки и толстой кишки в чистую чашку Петри, содержащую фосфатно-солевой буфер (PBS).
  5. С одной стороны, или парой щипцов, удерживая дистальный конец толстой кишки и использовать другую руку, чтобы аккуратно распутать всю длину толстой кишки из любого брыжеечной соединительной и / или жировой ткани.
  6. Определить слепой кишки(Маленький мешочек между тонкой и толстой кишки) и разрезают, где слепая кишка и двоеточие Join (проксимальный конец толстой кишки), чтобы освободить прямую кишку.
  7. С одной стороны, или парой щипцов, держать тонкую кишку и использовать другую руку, чтобы аккуратно распутать всю длину тонкой кишки из любого брыжеечной соединительной и / или жировой ткани. Срежьте слепая кишка и выбросить, если нет необходимости в этом.
    Примечание: Этот процесс может быть остановлен здесь путем инкубирования отсекают кишок в модифицированном фиксаторе Буэна (50% этанол / 5% уксусной кислоты в дН 2 O) в течение ночи и продолжить процедуру на следующий день.
  8. Обработка одного сегмента кишечника (тонкой кишки или толстой кишки), заполнить 10-мл шприц с фиксатором модифицированную Буэна и прикрепить иглу через зонд к нему. Вставьте иглу около половины сантиметра в переднем открытии кишечного сегмента.
  9. Удерживая иглу через зонд внутри кишечного сегмента, применяя сильное давление с помощью приборана кишечный сегмент. С другой стороны, проведение шприц, нежный, но постоянное давление, чтобы очистить содержимое сегмента кишечника с использованием закрепитель модифицированную Буэна. Этот шаг позволяет одновременную чистку кишечника сегмента и немедленной фиксации. Используйте чашку Петри для сбора отходов проточный. Фиксацию можно наблюдать по цвету толстой кишки поворота непрозрачным.
    Примечание: Убедитесь в том, чтобы не применять слишком большое давление при промывке или кишечный сегмент может распахнулась.
  10. С помощью ножниц разрезали кишечного сегмента продольно вдоль линии брыжейки. Держите его с парой щипцов и промойте его на короткое время в чашку Петри, содержащую PBS.
    1. Отрежьте тонкую кишку на 3 равные части: проксимальной, средней и дистальной. Проксимальный сегмент является одним сразу после желудка, и дистальный сегмент является одним непосредственно перед двоеточием. Проксимальный сегмент эквивалентен двенадцатиперстную кишку, в середине к тощей кишке, и дистальнееподвздошной кишки.
    2. Для каждого сегмента отмечают проксимальный и дистальный конец. Проксимальный конец является тот, который первоначально был направлен в сторону желудка, и дистальный указал на толстой кишке.
  11. Используйте в верхней части чашки Петри поместить очищенный и открытый кишечный сегмент. Поместите кишечный сегмент с полостную стороной вверх.
    1. Для толстой кишки, определить люминальную сторону по variegations / гребнями, работающих по ширине и присутствуют на проксимальном конце. В середине и дистальных отделах имеют некоторые variegations, которые работают в продольном направлении. Для тонкой кишки, определить люминальную сторону по шероховатой поверхности появляются, знаменующий ворсинки.
      Примечание: Для тонкой кишки, нет никаких внешних макроскопического анатомического демаркация проксимальных, средних и дистальных отделах. Однако эти области можно можно идентифицированный в разделах под микроскопом. Ворсинок являются самыми длинными в проксимальной области и постепенно становятся короче дистально, где они находятсясамый короткий в длину. Микроскопически, крипт ободочной кишки являются кратчайшим в проксимальной области, которые также могут быть идентифицированы по наличию гребней. Крипт ободочной кишки являются самым высоким в средней части и короче в дистальной области пока еще выше, чем в проксимальной области.
  12. Продолжайте швейцарским крученым двоеточие:
    1. Держите двоеточие плоские открытые и вытащить его пинцетом от его проксимального конца к краю чашки Петри.
    2. Держите люминальную стороной вверх и удерживать проксимальный конец с пинцетом с одной стороны, и с другой стороны провести зубочисткой.
    3. Заверните края проксимального конца вокруг зубочистки с помощью пинцета и слегка ущипнуть, обернутый край против зубочистку, чтобы удерживать его на месте.
    4. Аккуратно и медленно начать прокатки зубочистку с пальцами, чтобы бросить толстой кишки вокруг зубочисткой, чтобы сформировать рулет.
    5. После того, как по всей длине толстой кишки был свернут, используйте пару щипцов, чтобы аккуратно вставьте грOlon рулет от зубочисткой и в ткани обработки / -вложением кассеты. Поместите кассету в 10% забуференном формалине в течение ночи при комнатной температуре.
  13. Продолжайте швейцарской прокатки тонкой кишки:
    1. Обработка одного сегмента в то время, держать сегмент плоские открытые с полостной стороной вверх и потяните его с пинцетом от его проксимального конца к краю чашки Петри.
    2. Продолжить со швейцарским прокатке, как описано для толстой кишки.
  14. Продолжить с обработкой фиксированных формалином тканей для парафин. Выполните следующие действия:
    Примечание: Используйте автоматизированный процессор (см материалы и оборудование для получения подробных сведений).
    1. В то время как ткань находится в кассете, промойте ткань с PBS до тех пор, пока фиксатор полностью удаляется.
    2. Высушить ткани с использованием этанола в следующей последовательности: 50% этаноле в течение 10 мин, 70% этаноле в течение 10 мин, 80% этаноле в течение 10 мин, 95% этаноле в течение 10 мин, 100% этаноле в течение 10 мин, 100% этаноле в течение 10 мин , и 100% этаноле в течение 10 мин.
    3. Обмен этанола с ксилолом в следующей последовательности: 2: 1 этанол: ксилол в течение 10 - 15 мин, 1: 1 этанол: ксилол в течение 10 - 15 мин, 1: 2 этанол: ксилол в течение 10 - 15 мин, 100% ксилола в течение 10 - 15 мин, 100% ксилола в течение 10 - 15 мин, и 100% ксилола в течение 10 - 15 мин. ВНИМАНИЕ: Ксилол представляет опасность для здоровья, таким образом, рабочее место должно быть оборудовано местной вытяжной вентиляцией с соответствующим капотом и надлежащего защитного оборудования должен быть несл персоналом.
    4. Обмен ксилола с парафином. Выполните следующие действия в вакуумной печи в течение 54 - 58 ° C: 2: 1 ксилол: парафин в течение 30 мин, 1: 1 ксилол: парафин в течение 30 мин, 1: 2 ксилол: парафин в течение 30 мин, 100% парафина для 1 - 2 ч, а 100% парафина в течение 1 - 2 ч или в течение ночи.
      Примечание: Не дайте парафина превышать 60 ° С в течение длительных периодов времени, так как это может привести к разрушению парафиновых полимеров и сделать его твердым и хрупким.
    5. Вставить в свежей новой парафином и сориентировать ткани, как дехряков до того, как парафин затвердевает. Для рулетов, следуя paraffinization ткани, важно, чтобы изменить положение каждый рулон на его стороне во время парафин. Это гарантирует, что во время резки, участки по всей длине каждого рулона будет производиться.
  15. Для окрашивания, вырезать толстые секции 5 мкм с использованием микротома. Соберите разделы на заряженные слайды и высушить их (отжигом) в 65 ° С печи в течение ночи; дайте остыть до комнатной температуры, а затем использовали их для окрашивания.
    Примечание: Время выпечки может быть сокращен до 1 - 2 часа в зависимости от того, как свежесрезанных слайды. Если менее чем через месяц после секционирования, то желательно, чтобы испечь в течение ночи. Если прошло больше месяца, а затем 1 - 2 ч выпечки достаточно, чтобы сэкономить время. Если время истекает, в течение ночи поддержка всегда можно использовать.

3. Анализ Гистологические и Иммунофлуоресценции Окрашивание

Выполните гистологический анализ и immunofluценции окрашивания , как описано выше 23,24, с некоторыми изменениями. Для получения белка усиливается зеленый флуоресцентный (EGFP) иммунофлюоресценции:

  1. Выпечка слайдов в 65 ° C печи в течение 1 ч, чтобы инактивировать эндогенный активность щелочной фосфатазы и впоследствии deparaffinize в ксилоле.
  2. Инкубируйте секций в ванне 3% -ной перекиси водорода в метаноле, чтобы блокировать пероксидаз эндогенные ткани; затем регидратации путем инкубации в серии убывающий спирта ванны (100%, 95%, 70%) с последующим извлечением антигена в цитратном буферном растворе (10 мМ цитрат натрия, 0,05% Tween-20, рН 6,0) при 125 ° С в течение 10 мин используя decloaking камеру.
  3. Обведите срезах ткани с помощью маркировки перо, которое обеспечивает гидрофобный барьер и инкубировать секций с блокирующим буфером (2,5% бычьего альбумина [БСА] в сыворотке в TBS-Tween) в течение 30 мин при температуре 37 ° С и затем с первичным антителом против EGFP (разведение 1 : 500) при 4 ° с в течение ночи во влажной камере при встряхивании осторожно.
  4. Промыть секции и инкубировать с флуоресцентно меченый вторичными антителами в соответствующей концентрации в течение 30 мин при 37 ° С.
  5. Вымойте слайды после вторичной очистки антител и окраски ядер с Hoechst и смонтировать с монтажными средствами массовой информации.
    1. Для Klf5 / EGFP / Ki-67 совместного окрашивания, процесс горок, как описано в пунктах 3.1 - 3.3 и выполнить Klf5 окрашивание путем инкубации с Klf5 антителом (разведение 1: 150) в течение ночи.
    2. Применить кролика обнаружения полимера AP к слайдам согласно протоколу.
    3. Reveal Klf4 окрашивания с использованием хромогенного иммуногистохимического окрашивания в соответствии с протоколом производителя.
    4. Выполните антитела элюирование с использованием ранее описанной протокола 25. Инкубируйте слайды при 50 ° C в глицин-ДСН (рН 2,0), раствор при перемешивании в течение 1 часа.
    5. Промыть тщательно сползает с дистиллированной водой и инкубировать с блокирующим буфером (2,5% бычьего сывороточного альбумина в TBS-Tween) в течение 30 мин при 37 ° С.
    6. Добавить Ki-67 (разведение 1: 500) и EGFP (разведение 1:500) антител одновременно и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа.
    7. Выполните флуоресцентной детекции с соответствующими вторичными антителами перед тем окрашиванием Hoechst (данные не показаны) и монтировать с монтажной средой.
  6. Заметим , гистологическую морфологию тканей мечение клеток 5 мкм секций с гематоксилином и эозином (H & E) , 26. Для люминесцентных изображений используйте длину волны излучения 535, 646 и 700 визуализировать EGFP, Klf5 и Ki-67 окрашивание соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Швейцарская техника качению в сочетании с иммуногистохимического окрашивания позволяет для всестороннего анализа тонкой или толстой ткани кишечника. Пример H & E окрашивания в толстой кишке о наличии C57BL / 6 мыши (рисунок 1) является иллюстрацией целесообразности и эффективности этого метода. Как показано на рисунке 1, изображение может захватывать все части толстой кишки: проксимальный, средний и дистальный. Таким образом, это позволяет комплексной гистологических препаратов. Швейцарский качению и возможность захвата по всей длине тонкой или толстой ткани кишечника, является чрезвычайно полезным для гетерогенной экспрессии гена-маркера и окрашивания или переменной отклика ткани кишечника на оскорбление.

Примером может служить картина окрашивания EGFP у мышей Lgr5-EGFP / Creer Т2. В этой модели мышей, экспрессия EGFP движетLgr5 промотор, который активен только в активно пролиферирующих кишечных крипт. Кроме того, эта модель мыши характеризуется низкой (приблизительно 5 - 10%) проникания трансгенной экспрессии. Как показано на рисунке 2, паттерн экспрессии EGFP , в ткани кишечника , является переменной величиной. Следовательно, возможность захватить большую вид ткани помогает определить область интереса.

Техника, описанная здесь, является мощным, особенно с применением multifluorophore окрашивания. Здесь мы покажем пример trifluorophore окрашивания ткани кишечника, который готовили с использованием техники швейцарской ролл. Основная цель данного исследования состояла в том, чтобы исследовать роль Klf5 в поддержании кишечных стволовых клеток, экспрессирующих Lgr5 маркер. Таким образом, мы удалили Klf5 из Lgr5-положительных кишечных стволовых клеток у мышей Lgr5-EGFP / Creer Т2 и собирали кишечных тканей на день14 после первой инъекции тамоксифена. Для иммуногистохимического анализа, ткани были получены в соответствии с протоколом, представленном в этой рукописи, и окрашивания для EGFP (Lgr5 маркер), Klf5 и Ki-67 была выполнена. У контрольных мышей, обозначаемых как Lgr5-EGFP / Creer Т2, как EGFP-положительные (отмечены синими стрелками) и EGFP-отрицательные склепы (отмечены белыми стрелками) выставлены совместным окрашиванием для Klf5 и Ki-67 в двух исследованных временных точках , как показано на фиг.3D. В противоположность этому , в Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 фл / фл небольшой ткани кишечника, Klf5 / Ki-67 со-окрашивание отсутствует в EGFP-положительных CBC стволовых клеток (отмечены синими стрелками) , но присутствуют в EGFP-отрицательных крипты , примыкающие зеленые крипты (отмечены белыми стрелками), как показано на рисунке 3Н. Это отличный пример того, что методы подготовки ткани, представленные здесь, не оказывает негативного влияния окрашивания качество.


Рисунок 1. Н & Е Окрашивание в толстую кишку из C57B L / 6 мышь. Измеренное составное изображение всей длине толстой кишки. Участок между черной стрелкой и черной линией отмечает проксимальную часть, между Черным и оранжевые линии знаменует середину, а также между оранжевой линией и оранжевой стрелкой отмечает дистальной части толстой кишки. Шкала бар = 1000 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Иммунофлуоресценции Окрашивание тонкой кишки из-Lgr5 с EGFP / Creer T2 Mouse. Композитный изображение EGFP (маркировка Lgr5-позитивные эпителиальные клетки) окрашивание небольших участков кишечника с помощью мыши Lgr5-EGFP / Creer T2. Пример гетерогенной иммунофлуоресцентного окрашивания белков маркером (EGFP) , что метки Lgr5-POSTIVE эпителиальные клетки в криптах мыши Lgr5-EGFP / Creer T2. Ядра визуализируются с Hoechst. Белые стрелки отмечают крипты положительные для экспрессии EGFP. Шкала бар = 500 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Klf5 делеция в Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 фл / фл Мыши упорствует в долгосрочной перспективе Lgr5-EGFP-положительных гробниц. T2 и Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 фл / фл мышей на день 14 день после первой инъекции тамоксифен, соответственно. Панели AD являются репрезентативными окрашивания из ткани , полученной от контрольных мышей Lgr5-EGFP / Creer Т2, в то время как панели EH показывают окрашивание представитель Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 фл / эт мышей. Панели А и Е дисплей Klf5 иммунофлуоресцентного окрашивания в красный цвет; панели B и F показывают EGFP окрашивание в зеленый цвет; Панели C и G - шоу Ki-67 окрашивание в желтый цвет; и панели D и H шоу слились образы Klf5, EGFP и Ki-67 пятен. Синие стрелки указывают на зеленый крипт; белые стрелки указывают на nongreen крипт объединяемых изображений. Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 П / фл мышах показали долгосрочную потерю Klf5 только в EGFP меченных CBC клеток 14. Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Прокатный техника Швейцарский является мощным способом получения кишечной ткани для гистологического и морфологической оценки в крупных масштабах. В отличие от ранее описанной швейцарской прокатной техники, которая первоначально была разработана для приготовления замороженных срезов 18,19, процедура представлена ​​здесь позволяет быстрое приготовление ткани кишечника и фиксации для фиксации формалином и парафин (FFPE). По сравнению с замороженной ткани, FFPE ткань имеет гораздо более длительный срок хранения и является предпочтительным типом ткани для гистологического анализа из-за улучшения целостности тканей. Критические части швейцарского качению протокола включают гибкость ткани для прокатки и поддержания целостности швейцарского крена и качества тканей для окрашивания вторичная фиксация. Стандартный метод Swiss-ролл для FFPE кишечной ткани , как правило , трудоемкая и отнимает много времени (2 дня) 18,19. Кроме того, этот стандартный метод, как правило, приводит к кишечной ткани, которое гelatively жесткая и не легко форме в рулет. Это происходит потому, что в течение ночи инкубации рассеченной ткани кишечника в 10% забуференном формалине требуется перед тканевого прокаткой. Другие модификации методики FFPE целей были разработаны также, но у них есть главная проблема тенденции кишечной ткани раскатать и / или центр рулона, чтобы быть искажены. Это происходит потому, что ткань, используемая в этих методов является свежей нефиксированной ткани, которая является скользким от слизи, полученного в кишечнике. Новый модифицированный метод показан здесь преодолевает эти проблемы с помощью модифицированной формы фиксаторе Буэна. Фиксирующий Оригинал Буэна состоит из смеси уксусной кислоты, этанол, пикриновой кислоты и параформальдегида (или формалином). Два наиболее опасных компонентов, пикриновой кислоты и параформальдегида (или формалином), были исключены, чтобы обеспечить более безопасное использование закрепителя с уксусной смесью кислоты / этанол. Пикриновая кислота представляет опасность взрыва и paraformaldehyde (или формалин) представляет опасность рака. Значение с помощью модифицированного закрепитель Буэна является то, что она (1) менее опасен по сравнению с его первоначальной формуле, (2) легко приготовить с относительно nonexpensive реагентов, которые легко доступны в большинстве лабораторий, и (3) позволяет быстро, почти мгновенно, фиксация ткани при использовании для промывки. Насколько известно, нет никаких известных ограничения на использование этой модифицированной техники. Кроме того, быстрая фиксация этой смеси очень уменьшает скользкость кишечной ткани, что позволяет гораздо быстрее и проще прокатку ткани. Это закрепляющий также позволяет для превосходного сохранения целостности тканей и клеток для гистологического и иммунным окрашиванием анализа. Таким образом, по сравнению с другими способами получения ткани кишечника, эта усовершенствованная методика позволяет преодолеть ряд технических проблем и грантов значительно повышена скорость и простоту в использовании.

Кроме того, этот модифицированный Фиксирующий полезно использовать с другой толщинойткани, требующие быстрой фиксации. Из-за природы уксусной кислоты и этанола, которые обладают способностью быстрого проникновения толстой ткани в то время как в то же самое время прохождения фиксации. Мы использовали его успешно, чтобы быстро исправить толстые ткани, такие как печень, селезенка и почки. Например, фиксация взрослой мыши всей печени с помощью модифицированного закрепитель Буэна обычно достигается в течение 15 - 20 мин. Это можно легко судить по резке поперечное сечение в печень и наблюдая ли глубокие участки печени изменили цвет от кроваво-красного до серого. Изменение цвета свидетельствует о фиксации. Эта фиксация затем следуют сшиванием с использованием забуференной формалине в течение 24 - 48 ч, не опасаясь измененном состава сотовой связи / ткани, как ткань уже зафиксировано в этой точке.

Для сравнения, использование традиционного метода буферном формалина фиксации только на взрослой мыши всей печени потребовалось бы 24 - 48 ч для достижения fixati глубокие тканина, с риском измененном клеточного состава глубоких тканей. Быстрые методы фиксации толстых тканей имеет превосходное преимущество, чтобы свести к минимуму изменение клеточных компонентов в ответ на стресс условий, таких как гипоксия, после удаления органа / ткани, из организма. Мы предполагаем, что модифицированный Фиксирующий может быть использован в качестве животного перфузией еще более быстрый способ фиксации толстых образцов ткани / органов желательно. Таким образом, в заключение, этот метод и модифицированный Фиксирующий обеспечивают множество преимуществ по сравнению с традиционными методами, используемыми для сбора ткани кишечника и фиксации и модифицированного закрепителя можно использовать, чтобы быстро исправить другие толстые ткани / органы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stainless Steel Dissecting Kits VWR 25640-002
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012
Syringe 10 ml VWR 89215-218
Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid Simport M515
Superfrost Plus Slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR 48311-703
Manual Slide Staining Set Tissue-Tek/Sakura 4451
Staining Dish Green Tissue-Tek/Sakura 4456
Staining Dish White Tissue-Tek/Sakura 4457
24-Slide Slide Holder with Detachable Handle Tissue-Tek/Sakura 4465
Oven Thermo Scientific 6243 for baking slides at 65 degree
Dissection microscope Zeiss Stemi 2000C
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X
PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Ethanol 200 proof AAPR 111000200
Methanol VWR BDH1135-4LP
Glacial acetic acid AAPR 281000ACS
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL
Hydrogen peroxide 25% solution in water ACROS 202465000
10% bufered formalin Fisher Scientific 22-026-213
Bovine serum fraction V, heat shock Roche 3116956001
Tween 20 Sigma Aldrich P7949
Sodium citrate Fisher Scientific S279
Gavage needle VWR 20068-624
Rabbit anti Klf5 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-22797 Dilution 1:150
Chicken anti EGFP antibody Millipore AB16901 Dilution 1:500
Rabbit anti Ki67 antibody Biocare Medical CRM325B Dilution 1:500
Mach3 rabbit AP polymer detection kit Biocare Medical M3R533L
Warp red chromogen kit Biocare Medical WR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 mice  Jackson labs 008875 
Automated processor Leica Leica TP1020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
  2. Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
  3. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  4. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  5. van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
  6. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
  7. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
  8. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  9. May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
  10. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  11. Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
  12. McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
  13. McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
  14. Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
  15. Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
  16. De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
  17. Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
  18. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  19. Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, Pt 1 115-120 (1987).
  20. Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
  21. Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
  22. el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
  23. McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
  24. Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
  25. Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
  26. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, pdb prot4986 (2008).

Tags

Основной протокол выпуск 113, рулет Кишечные эпителиальные клетки стволовые клетки Immunohistochemistry Иммунофлуоресценции
Улучшенная техника швейцарско-прокатка для Кишечные Подготовка ткани для иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного анализов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M.,… More

Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J. Vis. Exp. (113), e54161, doi:10.3791/54161 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter