Summary
Korrekt identifiering och lokalisering av epitelceller längs tarmslemhinnans lining är väsentliga för att definiera olika cellinjer. Korrekt avbildning av tarmvävnad är avgörande för identifiering av proteinuttrycksmönster med maximal upplösning. Denna studie syftar till att beskriva de optimala metoder och villkor för bearbetning mus tarmvävnader.
Introduction
Däggdjurens tarmepitel innefattar ett enda skikt av kolumnära celler. I tunntarmen, är de proliferativa cellerna begränsade till kryptor medan differentierade celler ockupera villus regionen. Men eftersom det inte finns några villi i tjocktarmen, är proliferativa celler lokaliserade till botten av kryptor och differentierade celler upptar den övre delen av kryptor. Tarmepitelet genomgår snabb påfyllning (ca 3-5 dagar) som drivs genom kontinuerlig uppdelning av proliferativa celler i kryptor. De proliferativa celler i kryptorna är inte en homogen befolkning och är indelade i stamceller och transitförstärkande (TA) celler 1. Stamcellerna uppe vid botten av kryptan, inom de första 4 - 5 celler från mycket botten 2. Den nuvarande modellen stöder förekomsten av två typer av stamceller: crypt bas columnar (CBC) stamceller och reserv vilande stamceller. CBC stem-celler är aktivt prolifererande och är markerade med leucin-rika repeteinnehållande G-proteinkopplad receptor 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 och Achaete scute liknande 2 (Ascl2) 5. Å andra sidan, är reserv vilande stamceller märkt genom B-cell-specifika Moloney murint leukemivirus integrationsstället ett (Bmi1) 6, mus telomeras omvänt transkriptas (mTERT) 7, HOP homeobox (Hopx) 8, Doublecortin-liknande och CAM Kinase -liknande 1 (Dclk1) 9, och leucinrika upprepar och immunoglobulinliknande domäner 1 (Lrig1) 10. De aktivt prolifererande stamceller ger upphov till TA-celler sedan genomgå ytterligare differentiering i absorberande celler (enterocyter) och sekretoriska celler (enteroendocrine, bägare, Paneth och tofs celler). Kontinuerlig celldelning i proliferativa zonen resulterar i en rörelse uppåt av epitelceller längs kryptan-villus axeln tills de når toppen av villi, där de genomgår apoptos och ärfaller av från ytan av epitelet. De olika typerna av intestinala epitelceller markeras genom uttryck av olika proteiner (t.ex. kan tarm bägarceller erkännas genom färgning med antikroppar mot Muc2 och panethceller med antikropp mot lysozym). Vi studerar roll Krüppel-liknande faktorer (KLFs) i homeostas och patobiologi av tarmepitelet 11-13. De resultat som presenteras här stödjer genomförbarheten av en modifierad Swiss-rullande teknik bygger på tidigare studier av den roll som Krüppel liknande faktor 5 (KLF5) i upprätthållandet av aktivt prolifererande intestinala epitelceller stamceller 14. KLF5 är en zinkfingertranskriptionsfaktor som uttrycks i hög utsträckning i den aktiva intestinal stam och TA cellerna 12. Tidigare studier har visat att KLF5 samuttrycks med Ki-67, en känd proliferativ markör i tarm kryptor.
Mag tr handlingen är inte strukturellt eller funktionellt homogen vävnad. Tunntarmen är uppdelad i tolvfingertarmen, jejunum och ileum och tjocktarmen i blindtarmen och tjocktarmen, med den senare vidare indelade i proximal, mitt och distala delarna. Var och en av dessa sektioner har unika histologiska egenskaper och spelar olika roller 15. Som sådan, kan effekterna av förolämpningar och graden av svaret från tarmepitelet beror på regionen studerade vävnad 16. Dessutom, olika musstammar visa mångfalden av svaret på den histologiska nivå beroende på vilken typ av förolämpning som används i studierna 16. Således, anstår förberedelse vävnad är nödvändigt att möjliggöra en lämplig histologiska och molekylär analys av tarmvävnad. Som sådan, det schweiziska-roll bidrag teknik analys av den fullständiga längden hos tarmepitelet vid en tid och därmed konstaterar välinformerade slutsatser baserade på omfattande information.
e_content "> Den schweiziska-roll teknik nämndes först av Magnus 17, och beskrivs i detalj av Moolenbeck och Ruitenberg och Park et al. som en metod för framställning av vävnader och utföra histologiska analyser av gnagare tarmen 18,19 respektive. Protokollet avgränsas i denna publikation presenterar en förbättrad version av den ursprungliga metoden som tillåter för aktuell och tillförlitlig vävnadspreparat för diagnostiska ändamål. denna modifierade teknik möjliggör effektiva samlingar och framställning av tarmepitelet för allmänt använda tekniker, såsom immunohistokemi, immunofluorescens samt som in situ hybridisering (fluorescerande och kromogena 20). Dessutom modifierade vävnadsprovet framställningsmetod utnyttjar lättillgängliga och relativt billiga reagens samtidigt som den erbjuder en metod för snabb vävnadsfixering och möjliggör återvinning av protein, DNA och RNA för ytterligare utvärdering. Taken tillsammans, this teknik är utmärkt för omfattande utvärdering av histopatologiska, patologiska och molekylära egenskaper hos tarmepitelet.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Möss
- Alla studier med möss har godkänts av Stony Brook University Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). Mössen hölls på en 12:12 timmar ljus-mörker-cykel.
- Kommersiellt få C57BL / 6 möss. Erhålla C57BL / 6-möss som bär Klf5 alleler flankerade av loxP-ställen (Klf5 f l / f l). Dessa möss tidigare beskrivits 21 och nådigt tillhandahålls av Dr. Ryozo Nagai.
- Köp C57BL / 6 möss som bär den inducerbara Cre-rekombinas-genen under reglering av Lgr5 promotorn (Lgr5-EGFP / CreERT2 möss).
- Att etablera Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 f l / f l möss, korsa Klf5 fl / f l möss med Lgr5-EGFP / CreER T2 möss och sedan tillbakakorsning avkomman till Klf5 fl / f l möss.
- Behandla möss med tamoxifen enligt det protokoll som tidigare beskrivits 22. Injicera åtta veckor gamla experimentell och kontrollmöss intraperitonealt (IP) med 1 mg av tamoxifen (10 mg / ml), löst i steril majsolja, 5 dagar i följd.
- På dag 14 efter första tamoxifen injektion, offra möss med användning CO 2 kvävning genom att placera dem i en kammare ansluten till CO2 gaskälla. Låt gasen att strömma in i kammaren tills mössen är medvetslösa och all rörelse upphör. Att säkerställa eutanasi utföra cervikal dislokation.
2. Vävnadsberedning och schweiziska Rolling
- Med hjälp av dissektion pincett och sax, skär ett snitt i huden på buken sida. Med en pincett, hålla huden på snittet och dra försiktigt bort från buken muskelvävnaden. Använd en sax för att klippa bukhuden och exponera magmusklerna.
- Håll och dra upp peritoneum med pincett. Se till att inte hålla och dra i tarmarna. Noggrant göra ett snitt i peritoneal vävnaden och fortsätter att skära bort huden för att exponera magmusklerna. Noggrant göra ett snitt i magmusklerna och fortsätta skära bort dem för att exponera tarmen.
- Identifiera tjocktarmen och spåra till den distala änden där den ansluter till rektum / anus. Med en sax, klipps av så nära analöppningen som möjligt.
- Identifiera magen och spåra där den ansluter med tunntarmen. Med en sax, friskäras tarmen ca 1 cm avstånd från magen. Överföra hela längden av den frigjorda tunntarmen och tjocktarmen till en ren petriskål med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Med en hand eller en pincett, håll den distala änden av tjocktarmen och använda den andra handen för att försiktigt riva upp hela längden av tjocktarmen från någon mesenteriska connective och / eller fettvävnad.
- Identifiera cekum(Liten påse mellan tunn- och tjocktarmen) och skär där blindtarmen och tjocktarmen join (den proximala änden av tjocktarmen) för att frigöra kolon.
- Med en hand eller en pincett, hålla tunntarmen och använd den andra handen för att försiktigt riva upp hela längden av tunntarmen från varje mesenteriska bindväv och / eller fettvävnad. Skär bort blindtarmen och kasta om det inte finns något behov av det.
Obs: Processen kan stoppas här genom inkubation dissekerade ut tarmarna i modifierad Bouins fixativ (50% etanol / 5% ättiksyra i dH 2 O) över natten och fortsätta förfarandet följande dag. - Hantering ett segment av tarmen (tunntarmen eller kolon), fylla en 10-ml spruta med modifierad Bouins fixativ och bifoga en sondmatning nål till den. Stick in nålen ungefär en halv centimeter i den främre öppningen av tarmsegmentet.
- Håll sondmatning nålen i tarmsegmentet genom att tillämpa ett fast tryck med ett instrumentpå tarmsegmentet. Med den andra handen håller sprutan, tillämpa mild men konsekvent tryck att spola innehållet i tarmsegmentet med hjälp av modifierade Bouins fixativ. Detta steg möjliggör samtidig rengöring av tarmsegmentet och omedelbar fixering. Använda en petriskål för uppsamling av genomflödes avfall. Fixering kan observeras av kolon färg vrida ogenomskinlig.
Obs: Se till att inte för mycket tryck under spolning eller tarmsegmentet kan öppnat. - Med sax, skära upp tarmsegmentet i längdriktningen längs mesenteriska linjen. Håll den med en pincett och skölj det kort i en petriskål med PBS.
- Klipp tunntarmen i 3 lika stora segment: proximala, mitten och distala. Det proximala segmentet är det ett omedelbart efter magen, och det distala segmentet är en omedelbart före tjocktarmen. Det proximala segmentet är ekvivalent till duodenum, mitten till jejunum, och den distala tillileum.
- För varje segment markera den proximala och den distala änden. Den proximala änden är den som ursprungligen riktad mot magen, och den distala pekade mot kolon.
- Använda toppen av en petriskål för att placera den rengjorda och öppnas tarmsegmentet. Placera den intestinala segmentet med den luminala sidan vänd uppåt.
- För tjocktarmen, identifiera den luminala sidan av variegations / åsar som löper över dess bredd och är närvarande vid den proximala änden. I mitten och distala regioner har vissa variegations som körs i längsled. För tunntarmen, identifiera den luminala sidan av den grova-framträdande yta, som markerar villi.
Obs! För tunntarmen, det finns inga yttre makroskopisk anatomisk avgränsning av proximala, mellersta och distala regioner. Men dessa regioner kan kan identifieras i avsnitten under mikroskop. Villi är längst i den proximala regionen och bli gradvis kortare distalt där de ärden kortaste i längd. Mikroskopiskt de colonic kryptor är kortast i det proximala området som också kan identifieras genom närvaron av åsar. Kolon kryptor är högsta i mittsektionen och kortare i den distala regionen ändå högre än i den proximala regionen.
- För tjocktarmen, identifiera den luminala sidan av variegations / åsar som löper över dess bredd och är närvarande vid den proximala änden. I mitten och distala regioner har vissa variegations som körs i längsled. För tunntarmen, identifiera den luminala sidan av den grova-framträdande yta, som markerar villi.
- Fortsätt med Swiss rullande kolon:
- Hålla kolon plan, öppen och dra den med pincett från sin proximala ände mot kanten av petriskålen.
- Håll luminala sidan uppåt och hålla den proximala änden med pincetten med ena handen och med den andra handen håller en tandpetare.
- Linda kanten av den proximala änden runt tandpetare använder tången och något klämma lindade kant mot tandpetare för att hålla den på plats.
- Försiktigt och långsamt börja rulla tandpetaren med fingrarna för att rulla kolon runt tandpetare för att bilda en rulltårta.
- När hela tjocktarmen längd har rullats upp, använd en pincett för att försiktigt glida colon rulltårta utanför tandpetare och in i en vävnad-bearbetning / -embedding kassett. Placera kassetten i 10% buffrad formalin över natt vid rumstemperatur.
- Fortsätt med Swiss rulla tunntarmen:
- Hantering ett segment åt gången, hålla segmentet plan, öppen med luminala sidan upp och dra den med pincett från sin proximala ände mot kanten av petriskål.
- Fortsätt med Swiss valsning såsom beskrivits för kolon.
- Fortsätt med att bearbeta formalinfixerade vävnader för paraffininbäddning. Gör så här:
OBS: Använd en automatiserad processor (se material och utrustning är för detaljer).- Medan vävnaden är i kassetten, skölj vävnaden med PBS tills fixerings är helt bort.
- Dehydratisera vävnad med användning av etanol i följande sekvens: 50% etanol under 10 min, 70% etanol under 10 min, 80% etanol under 10 min, 95% etanol under 10 min, 100% etanol under 10 min, 100% etanol under 10 min och en00% etanol under 10 min.
- Utbyte etanol med xylen i följande sekvens: 2: 1 etanol: xylen under 10 - 15 min, 1: 1 etanol: xylen under 10 - 15 min, 1: 2 etanol: xylen under 10 - 15 min, 100% xylen under 10 - 15 min, 100% xylen under 10 - 15 min och 100% xylen under 10 - 15 min. VARNING: Xylen är en hälsorisk, därför arbetsplatsen bör vara utrustad med en punktutsug med en ordentlig huva och lämplig skyddsutrustning bör bar av personal.
- Exchange xylen med paraffin. Utför följande steg i en vakuumugn inställd på 54-58 ° C: 2: 1 xylen: paraffin i 30 min, 1: 1 xylen: paraffin i 30 min, 1: 2 xylen: paraffin i 30 min, 100% paraffin för 1-2 h, och 100% paraffin, 1 - 2 timmar eller över natten.
Obs: Låt inte paraffin överstiga 60 ° C under längre perioder eftersom detta kommer att försämra paraffin polymerer och göra det hårda och spröda. - Bädda in i nya fräscha paraffin och orientera vävnad som defar före paraffin härdar. För de rulltårta, efter vävnads paraffinization, är det viktigt att omplacera varje rulle på sin sida under paraffininbäddning. Detta säkerställer att under skärning, kommer delar av den hela längden av varje rulle framställas.
- För färgning, skär 5-im tjocka sektioner med hjälp av mikrotomen. Samla avsnitten om laddade objektglas och torka dem (baka) i en 65 ° C ugn över natten; låt svalna till rumstemperatur och därefter används dem för färgning.
Obs! Gräddningstiden kan kortas till 1-2 h beroende på hur nyklippt bilderna är. Om mindre än en månad sedan sektionering, då är det lämpligt att baka natten. Om det har gått mer än en månad, sedan 1-2 h av bakning är tillräcklig för att spara tid. Om ont om tid, kan alltid användas underlag natten.
3. Histologisk analys och immunofluorescensfärgning
Utföra histologisk analys och immunofluorescence färgning som tidigare beskrivits 23,24, med ändringar. För förbättrad grönt fluorescerande protein (EGFP) immunofluorescens:
- Baka glasen i en 65 ° C ugn under 1 h för att inaktivera endogen alkaliskt fosfatas-aktivitet och därefter Avparaffinera i xylen.
- Inkubera sektioner i ett bad med 3% väteperoxid i metanol för att blockera endogena vävnads peroxidaser; sedan rehydrera genom inkubation i en minskande alkoholbad serien (100%, 95%, 70%) följt av antigenåtervinning i citrat-buffertlösning (10 mM natriumcitrat, 0,05% Tween-20, pH 6,0) vid 125 ° C under 10 min med användning av en decloaking kammaren.
- Rita en cirkel runt vävnadssnitt med hjälp av märkpenna som ger hydrofob barriär och inkubera sektioner med blockeringsbuffert (2,5% bovint serumalbumin [BSA] i TBS-Tween) under 30 min vid 37 ° C och sedan med primär antikropp mot EGFP (spädning 1 : 500) vid 4 ° C över natten i en fuktig kammare under skakning försiktigt.
- Tvätta sektioner och inkubera med fluorescerande-taggade sekundär antikropp vid den lämpliga koncentrationen i 30 min vid 37 ° C.
- Tvätta diabilder efter sekundär antikropp för behandling och fläck kärnor med Hoechst och montera med monterings media.
- För Klf5 / EGFP / Ki-67 co-färgning, process diabilder som beskrivs i steg 3,1 - 3,3 och utför Klf5 färgning genom inkubering med Klf5 antikropp (utspädning 1: 150) över natten.
- Applicera kanin AP polymer upptäckt i bilder som per protokoll.
- Avslöjar Klf4 färgning med hjälp av kromogen immunhistokemisk färgning enligt tillverkarens protokoll.
- Utför antikropps eluering med användning av den tidigare beskrivna protokoll 25. Inkubera objektglasen vid 50 ° C i Glycin-SDS (pH 2,0) lösning med omrörning under 1 timme.
- Tvätta objektglasen noggrant med destillerat vatten och inkubera med blockeringsbuffert (2,5% BSA i TBS-Tween) under 30 min vid 37 ° C.
- Lägg Ki-67 (utspädning 1: 500) och EGFP (utspädning 1:500) antikroppar samtidigt och inkubera vid 37 ° C under 1 timme.
- Utför fluorescerande detektion med lämpliga sekundära antikroppar innan färgning med Hoechst (data visas ej) och montera med monteringsmedium.
- Observera histologisk morfologi av vävnaderna på färgning 5-im sektioner med hematoxylin och eosin (H & E) 26. För fluorescerande bilder, använda emissionsvåglängder av 535, 646 och 700 för att visualisera EGFP, Klf5, och Ki-67 färgning, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den schweiziska rullande teknik i kombination med immunhistokemisk färgning möjliggör omfattande analys av små eller stora tarmvävnad. Exemplet H & E-färgning av en stor tarm en C57BL / 6 mus (figur 1) är en illustration av genomförbarheten och effektiviteten av denna teknik. Som visas i figur 1, är bilden kan fånga alla delar av tjocktarmen: proximala, mellersta och distala. Således möjliggör det omfattande histologisk bedömning. Schweiziska valsning och förmågan att fånga hela längden av den lilla eller stora tarmvävnad är mycket hjälpsamt för heterogena genexpression och markör-färgning eller en variabel svaret hos tarmvävnaden till insult.
Ett exempel är EGFP infärgningsmönster i Lgr5-EGFP / CreER T2 möss. I denna musmodell, är uttrycket av EGFP drivs avLgr5 promotor, som är aktiv endast i aktivt prolifererande tarm kryptor. Dessutom är denna musmodell som kännetecknas av låg (ca 5-10%) penetrans av transgen expression. Såsom visas i figur 2, är EGFP uttrycksmönstret i tarmvävnaden variabel. Följaktligen förmågan att fånga en stor bild av vävnaden hjälper till att identifiera regionen av intresse.
Den teknik som beskrivs här är kraftfulla särskilt med tillämpning av multifluorophore färgning. Här visar vi ett exempel på trifluorophore färgning av tarmvävnad som framställdes med användning av Swiss-roll teknik. Huvudsyftet med denna studie var att undersöka vilken roll Klf5 i upprätthållandet av tarm stamceller uttrycker Lgr5 markör. Därför utgår vi Klf5 från Lgr5-positiva tarm stamceller i Lgr5-EGFP / CreER T2 möss och samlas tarmvävnader på dag14 efter första tamoxifen injektion. För immunhistologisk analys, var vävnaderna ställdes i enlighet med protokollet som presenteras i detta manuskript, och färgning för EGFP (Lgr5 markör), Klf5, och Ki-67 utfördes. I kontrollmössen, betecknade som Lgr5-EGFP / CreER T2, både EGFP-positiva (märkt med blå pilar) och EGFP-negativa kryptor (markerad med vita pilar) uppvisade co-färgning för Klf5 och Ki-67 vid två undersökta tidpunkter , såsom visas i fig 3D. Däremot i Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 fl / fl liten tarmvävnad, Klf5 / Ki-67 sam-färgning saknades i EGFP-positiva CBC stamceller (märkt med blå pilar) men föreligger i EGFP-negativa kryptor angränsande de gröna kryptor (markerade med vita pilar), såsom visas i fig 3H. Detta är ett utmärkt exempel att preparatet vävnad tekniker som presenteras här inte negativt inte påverkar färgnings kvalitet.
Figur 1. H & E-färgning av en Large Bowel från en C57B L / 6 mus. Visat är den sammansatta bilden av hela längden av tjocktarmen. Delen mellan den svarta pilen och svart linje markerar den proximala delen, mellan de svarta och orange linjer markerar mitten, och mellan den orange linjen och orange pil markerar den distala delen av tjocktarmen. Skala bar = 1000 um. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Immunofluorescens färgning av en tunntarmen av en Lgr5-EGFP / CreER T2 mus. Sammansatt bild av EGFP (märkning Lgr5-positiva epitelceller) färgning av tunntarms sektioner av en Lgr5-EGFP / CreER T2 mus. Exempel på heterogena immunofluorescens färgning av proteinmarkör (EGFP) som märker Lgr5-postive epitelceller i kryptor av Lgr5-EGFP / CreER T2 mus. Kärnor visualiseras med Hoechst. Vita pilar markerar kryptor positivt för EGFP uttryck. Skalstreck = 500 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Klf5 radering i Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 fl / fl möss Persistent Långsiktigt i Lgr5-EGFP-positiva kryptor. T2 kontroll och Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 fl / fl möss på dag 14 dag efter första tamoxifen injektion respektive. Paneler AD är representativa för färgning av vävnad som samlats in från Lgr5-EGFP / CreER T2 kontrollmöss, medan paneler EH visar färgning är representativa för Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 fl / fl möss. Paneler A och E display Klf5 immunofluorescerande färgning i rött; paneler B och F visar EGFP färgning i grönt; paneler C och G visar Ki-67-färgning i gult; och panelerna D och H visar samman bilder av Klf5, EGFP och Ki-67 fläckar. Blå pilarna pekar på gröna kryptor; vita pilar pekar på nongreen kryptor i de sammanslagna bilderna. Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 fl / fl möss visade långsiktig förlust av Klf5 endast i EGFP-märkta CBC-celler 14. Skala bar = 50 um. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den schweiziska rullande teknik är en kraftfull metod för framställning av tarmvävnad för histologisk och morfologisk bedömning i stor skala. I motsats till den tidigare beskrivna Swiss-valsningsteknik, som ursprungligen utvecklades för beredning av frusna sektioner 18,19, det förfarande som presenteras här möjliggör snabb tarmvävnadspreparat och fixering för formalinfixering och paraffininbäddning (FFPE). Jämfört med frusen vävnad, har FFPE vävnad mycket längre hållbarhet och är den vanligaste formen av vävnad för histologisk analys på grund av bättre vävnadsintegritet. Kritiska delar av Swiss-rullande protokoll involverar vävnads flexibilitet för valsning och underhåll av Swiss-roll integritet och vävnadskvalitet för färgning postfixation. Standarden Swiss-roll teknik för FFPE av tarmvävnad är typiskt arbets- och tidskrävande (2 dagar) 18,19. Dessutom, denna standard metod ger vanligtvis tarmvävnad som är relatively stel och inte lätt att bilda i en rulltårta. Detta beror på att inkubation över natt av det dissekerade tarmvävnaden i 10% buffrad formalin krävs innan vävnadsvalsning. Andra modifieringar av tekniken för FFPE ändamål har också utvecklats, men de har ett stort problem av tendensen hos tarmvävnaden att rulla ut och / eller för mitten av rullen som skall förvrängas. Detta beror på att vävnad som används i dessa tekniker är färskt ofixerade vävnad, som är halt från slem som produceras av tarmen. Den nya modifierade teknik visas här övervinner dessa problem genom att använda en modifierad form av Bouins fixativ. Ursprungliga Bouins fixativ består av en blandning av ättiksyra, etanol, pikrinsyra och paraformaldehyd (eller formalin). De två mest farliga komponenter, pikrinsyra och paraformaldehyd (eller formalin), har eliminerats för att tillåta mycket säkrare användning av fixativ med en ättiksyra / etanol mix. Pikrinsyra utgör en explosionsrisk, och paraformaldehyde (eller formalin) är en cancer fara. Betydelsen av användning av den modifierade Bouins fixativ är att det (1) är mindre farligt jämfört med dess ursprungliga formeln, är (2) lätt att förbereda med relativt nonexpensive reagens som är lätt tillgängliga i de flesta labb, och (3) möjliggör en snabb, nästan omedelbar, fixering av vävnaden när den används för spolning. Till kunskap, det finns inga kända begränsningar att använda denna modifierade teknik. Dessutom, den snabba fixeringen med denna blandning reducerar oerhört slipperiness av tarmvävnad, vilket gör att mycket snabbare och enklare vävnadsvalsning. Detta fixerings möjliggör också utmärkt konservering av vävnader och celler integritet för histologiska och immunfärgning analys. Således, i jämförelse med andra metoder för tarmvävnad förberedelse, denna förbättrade teknik vinner flera tekniska frågor och bidrag kraftigt förbättrade hastighet och användarvänlighet.
Dessutom är denna modifierade fixativ lämpligt att använda med andra tjockvävnader som kräver snabb fixering. På grund av arten av ättiksyra och etanol, som har kapacitet på snabb penetration av tjock vävnad medan på samma gång genomgår fixering. Vi har använt den framgångsrikt för att snabbt fixa tjock vävnad såsom lever, mjälte och njurar. Till exempel är fixering av en vuxen mus hela levern användning av den modifierade Bouins fixativ vanligtvis uppnås inom 15 till 20 min. Detta kan lätt bedömas genom att skära ett tvärsnitt in i levern och observera huruvida de djupa områdena av levern hade ändrat färg från blodröd till grått. Förändringen i färg är indikativ för fixering. Denna fixering följs sedan av tvärbindning med hjälp av formalin för 24-48 timmar utan rädsla för förändrad cellulär / vävnadssammansättning, som vävnaden redan fast vid denna punkt.
Som jämförelse skulle använda traditionella buffrad formalin fixering metoden ensam på en vuxen mus hela levern kräver 24-48 timmar för att uppnå djupvävnads fixatipå, med risk för förändrad cellulär sammansättning djup vävnad. De snabba fixeringsmetoder för tjocka vävnader har den överlägsna fördelen att reducera till ett minimum den förändring av cellulära komponenter som svar på stress villkor, såsom hypoxi, efter avlägsnande av organet / vävnaden från kroppen. Vi räknar med att den modifierade fixerings kan användas i djur perfusion som ett ännu snabbare sätt att fastställa tjocka vävnad / organ önskas. Således, avslutningsvis, denna metod och modifierade fixativ ge flera fördelar jämfört med traditionella metoder som används för tarmvävnad skörd och fixering och den modifierade fixativ kan användas för att snabbt fixa andra tjocka vävnader / organ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10 ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1:150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1:500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
- Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
- Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
- Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
- May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
- Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
- Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
- McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
- McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
- Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
- Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
- Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, Pt 1 115-120 (1987).
- Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
- Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
- el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
- McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
- Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, pdb prot4986 (2008).
