Abstract
המחקר של אינטראקציות polymicrobial ברחבי הממלכות טקסונומיות הכוללים פטריות, חיידקים ווירוסים לא נבדקו בעבר ביחס כיצד חברי ויראלי של Microbiome להשפיע אינטראקציות חיידק לאחר מכן עם תאים המארח הנגועים בנגיף אלה. השיתוף למגורים של וירוס עם חיידקים ופטריות קיימים בעיקר על המשטחים הריריים של חלל הפה בדרכי מין. תאים ריריים, במיוחד אלה עם זיהומים נגיפיים סמויים כרוניים או מתמשכים מתמשכים, עשויים להיות השפעה משמעותית על חברי Microbiome בעקבות שינויים במבנה נגיף מספר וסוג קולטנים לידי ביטוי. שינוי בארכיטקטורת קרום תא מארח יביא יכולת שינתה החברים הבאים של הפלורה הנורמלי פתוגנים אופורטוניסטים ליזום את הצעד הראשון ההיווצרות ביופילם, כלומר, הדבקות. מחקר זה מתאר שיטה כדי לכמת ובדיקה ויזואלית של האפקט של HSV על הייזום של biofilהיווצרות מ (דבק) של ס aureus ו- C. אלביקנס.
Introduction
Microbiome האדם כולל אורגניזמים מגוונים מממלכות טקסונומיות מרובות החולקות אזורים גיאוגרפיים בגוף. דבקות משטחי תא היא צעד חיוני ראשון היווצרות ביופילם, המהווה חלק של תהליך הקולוניזציה Microbiome. כלול Microbiome יכול להיות וירוסים שגורמים זיהומים כרוניים ומתמשכים. זיהום התא הכרוני על ידי וירוסים אלה יכול לגרום שינוי זמין קולטן משוער. 1,2 בנוסף, ערך בתא ידי פתוגנים התאיים גם יכול להשפיע נזילות הממברנה מארחת / הידרופוביות אשר בתורו עשוי לשנות מצורפת של חברי Microbiome אחרים, כוללים חיידקים ופטריות . על מנת להבין את האינטראקציה שהוא יכול להתרחש בין פתוגנים רבים אלה ושהשיתוף למקם באותה האזורים הגיאוגרפיים של המארח האנושי, עלינו להיות מסוגל ללמוד את האינטראקציה של פתוגנים המייצגים את הספקטרום של ממלכות טקסונומיות נוכחות פני השטח הריריים.
t "> The Herpesviridae הם משפחה של חיידקים הנמצאים 100% של בני אדם כמו החברות הקבועות Microbiome 3,4. בנוסף הם יכולים גם להיות לשפוך הן בהתמדה בנוכחות והיעדר תסמינים. באופן ספציפי, הרפס סימפלקס וירוס-1 ו הרפס סימפלקס וירוס-2 (HSV-1 ו- HSV-2, בהתאמה) הן חברות קבועות Microbiome ב oronasopharynx ו בדרך המין. אצל אנשי חיסון מוסמך, הן HSV-1 ו- HSV-2 הגורם gingivostomatitis, כמו גם הרפס גניטלי 5-8. באתרים אלה, HSV גורמת זיהום לטנטי המאופיין 9 ויראלי אסימפטומטית מתמשך שפיכה. כניסה של HSV לתוצאות תאי שינויים בביטוי פני nectins, סולפט heparan, רפסודות שומנים ומגשר כניסה ההרפס / נימק גידול הקולטן לגורם (HVEM / TNFr) 10-25. אלה קולטנים מייצגים משותף פוטנציאלי עבור כמה חיידקים ופטריות, למשל S. aureus ו ג אלביקנס, אשר תוך פתוגנים אופורטוניסטיים,גם יכול להיות מאוחסן כחברי Microbiome הרירית של oronasopharynx 26,27. בתוך oronasopharynx ס aureus ו- C. אלביקנס לכבוש שני לאתרים ייחודיים של קולוניזציה. בשנת מארחים עם שיניים טבעיות, רירית הפה משותפת HSV-1 ו- C. אלביקנס, בעוד nares האף הקדמי תפוס על ידי S. aureus 28. עם זאת, למרות במבחנה הממצאים ס aureus דבקה תאי אפיתל פה, 29,30 ס aureus מבודד לעתים רחוקות מן הדגימות אוראליות כאשר רקמות בריאות קיימת 29,30. מעט מאוד ידוע לגבי נישות שיתוף-קולוניזציה בדרכי מין מעבר הממצאים הקליניים שס aureus קשורה דלקת נרתיק אירובי, מאופיין בדלקת איברי מין, פרשות ו dyspareunia, בעוד ג אלביקנס מייצרת רירית נגעים דומים לזה שנצפה בחלל פי 31-35. לכן, למרות אותם חברי microbi האוראלי באברי המיןשת ממלכות טקסונומיות צלבו מעט מאוד ידוע לגבי האינטראקציה שלהם כפי שהוא משפיע יכל ליזום היווצרות ביופילם דרך דבקות אל פני שטח התא המארח 5. פרוטוקול זה יושם באופן יעיל כדי לקבוע את ההשלכות התפקודיות של שיתוף-קולוניזציה / זיהום.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. זני HSV וטיפול
הערה: רקומביננטי הלא מתפשטת HSV-1 (קוס) gL86 ו HSV-2 (קוס) 333gJ - עם פעילות הכתב בטא galactosidase בשימוש נמסרו על ידי V. Twiari 36,37.
- השתמש וירוס מרב וחנות אחת ב -80 מעלות צלזיוס ב יחס של 1: 1 של המדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) עם 20% בסרום שור עוברי (FBS) ו חלב רזה עד שימוש. לפני האחסון הרבה ויראלי, לקבוע ריכוז הנגיף על ידי o -nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) ו 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-גל) assay.
- לקבוע כדאי וירוס ריבוי של זיהום (משרד פנים) על ידי מכתים X-גל עבור כל מחזור assay הניסיון באמצעות assay כניסת כתב וירוס, כפי שתואר לעיל (איור 1) 14.
- לדלל וירוס (Opt-MEM) כדי הרצוי משרד הפנים. תקן monolayers (paraformaldehyde; 0.5 מ"ל / טוב) לפני מכתים. מניחים שולטים כדאיות וירוס בתוך microti נפרדצלחת ter במקביל צלחות assay polymicrobial.
2. טיפול Cell הלה 299
- לגדול ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ב DMEM עם 4.5 g / L גלוקוז, 10% בסרום שור העובר חום מומת (FBS), גנטמיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל) ו L- גלוטמין. תאי המעבר בנקודת המפגש 80% עם פתרון טריפסין (חומצה ethylenediaminetetraacetic, 0.53 M EDTA; 0.05% טריפסין; 5 מ"ל / בקבוק).
3. ג טיפול אלביקנס
הערה: ג אלביקנס להשיג ממקור קליני מעבדתי מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס Remmel חלב רזה 2x בינוני.
- תרבות קפואה מנייה על Sabouraud דקסטרוז הבינוני (37 מעלות צלזיוס). לאחר 24 תת hr ב- C. אלביקנס על מדיום Fungisel (37 מעלות צלזיוס; 48 שעות) לשימוש.
- צור צינור נבט (GT) צורות (איסוף מושבות נציג; FBS 3 מ"ל; 3 שעות, 37 ° C; Abs 600, 0.3). לאחר דגירה, לשטוף GT (HBSS; 2x; 4,000 XG). להוסיף GT כדי לרחוץ חימם HBSS (37 &# 176; C; 0.32 Abs 600). צורות GT צריכות להיות 99% של תאים נצפו כפי שנקבע על ידי ספירת hemocytometer.
- הפוך אמצעי שמרים (YF) השעיות המניות על ידי הרמת מושבות Fungisel נציג (HBSS, 3 מ"ל; 0.32 Abs 600). ספירת צורות YF / ml מיקרוסקופית באמצעות hemocytometer. צורות YF צריכות להיות 99% של תאים נצפו כפי שנקבע על ידי ספירת hemocytometer.
- להפוך את עבודת מניות פטרייתי (250 μl של GT או מניות YF ב 25 מיליליטר HBSS; 37 מעלות צלזיוס; 10 5 CFU / ml)
4. ס טיפול aureus
- חנות S. aureus ATCC 25,923 (-80 ° C; Remmel לרחף 2x חלב). תרבות על אגר כבשים דם (5%; 37 מעלות צלזיוס; 24 שעות). פיק מושבות נציג ולהעביר מניטול מלחים בינוני בתוך 2 ימים עבור מניות (37 מעלות צלזיוס; 18 שעות).
- הפוך ס aureus ההשעיה המניות (3 מ"ל HBSS; 1.32 Abs 600; 10 8 CFU / ml)
- להפוך את עבודת S. מניית aureus (100 μlשל המניה ב 25 מ"ל HBSS; 10 5 CFU / ml).
5. קנדידה וס השעיות aureus
- הפוך מעורב ג אלביקנס וס ההשעיה aureus (250 YF μl או מלאי GT ו 100 μl S. aureus המניה ב -25 מ"ל HBSS).
6. polymicrobial Assay Biofilm
- Seed 96 צלחות גם עם 200 μl של 2 x 10 5 תאים הלה / מ"ל (רמת מפגש 85%). רוק צלחות (30 - 45 דקות, 37 ° C) לפני הדגירה (37 ° C; 5% CO 2 באינקובטור; 18 שעות). Monolayers Wash (1x; Opt-MEM) אז הזרע עם HSV (HSV-1 (קוס) gL86 או HSV-2 (קוס) 33 GJ - ב 100 μl Opt-MEM; משרד הפנים 50 ו -10). דגירה צלחות (3 שעות, 37 ° C; 5% CO 2). השתמש רק זן ויראלי אחד ליום.
- לשטוף monolayers נגוע (1x; בופר פוספט (PBS) עם Mg +2 ו Ca +2; 100 μl). החלף PBS עם HBSS חם עוזב 25 & #181; l בכל טוב.
- להוסיף YF, GT ו / או ס aureus השעיות עובדים (100 μl; יעד יחס התא = 5: 1; n = 16). כפי שניתן לראות בטבלה 1 דגירה צלחות (סטטי; 30 דקות; 37 מעלות צלזיוס; 5% CO 2).
- לאחר דגירה, לשאוב עמודה אחת בכל פעם מילוי מיד עם 300 μl PBS עם Mg +2 ו Ca +2. חזור על פעולה זו פעמים ואז להוסיף למאגר תמוגה assay הרדיו-immunoprecipitation (ריפה; מסנן מעקר: 200 μl של דילול 1:50).
- במהירות triturate את lysate תא הלה מכן למקם 50 μl על מלחי מניטול (MS) ו / או Fungisel (F) מדיה (איור 2). מורחים את lysate באמצעות מכופף מוט הזכוכית בזווית של 90 מעלות. דגירת הצלחות (18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס). באופן ידני לספור את מספר מושבות בכל צלחת. בקרה מורכבת ס aureus ו / או C. דבקות אלביקנס לתאים הלה-נגוע HSV.
7. בדיקות הדמיה </ P>
- לשטוף כל coverslip זכוכית עגול (12 מ"מ; 50 מיליליטר אצטון בכוס 100 מיליליטר). יבש לעקר coverslips (Kimwipes; בצלחות פטרי זכוכית). מניח coverslips סטרילי היבש לתוך הבארות של צלחות גם 24 סטרילי עם מלקחיים מעוקרים להבת אלכוהול.
- הוספת תאי הלה (1 מיליליטר; נפח 5x המשמש 96 צלחות גם) על הבארות של 24 צלחות היטב המכילות את coverslips הזכוכית העגול סטרילי השטף. מוסיפים את וירוס, חיידקים ופטריות בהתאם לתבנית (טבלה 2) בשעה 5x נפח המשמש 96 צלחות היטב, ואז דגירה תהליך כמתואר בשלבים 6.2.1 ל -6.4 לעיל.
- לאחר שטיפה של דבר, לתקן את התאים במיקרוסקופ על ידי הצפת שקופיות עם מתנול, ולתת לו להתאדות. אחסן את הצלחות ב RT עד מכתים.
- עבור מיקרוסקופ שדה הבהיר (1,000x הגדלה מקורית סופית) למלא את הבארות המכילות coverslips קבוע מתנול עם מים ללא יונים. מיד לשאוב מים. כיסוי כל coverslip עם סגול קריסטל גרם. לשטוף coverslips ללא כתם שאינו כבול (מים ללא יונים). Coverslips יבש באתרם ואז לדבוק בהם עם סט קשה הרכבה בינונית לשקופית שכותרתו (איור 3).
- עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אובייקטיבי 100x; 1,000x מקורי הגדלה סופית) לשטוף coverslips ללא מתנול בעצם כמתואר בשלב 7.4. יבש coverslips בבארות.
- לאחר ייבוש, להסיר את מכסה מחליק ומניחים אותם בשקופיות שכותרתו. לאחר מכן להוסיף כמות מספקת של 1:20 דילול של isothiocyanate והעמסת (FITC) מצומדות וירוס הרפס סימפלקס סוג 1 + 2 נוגדן GD כדי לכסות את coverslip (1 - 5 μl).
- דגירת השקופיות בתא לחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר דגירה, לשטוף את coverslips ב 4 שינויים של PBS.
- לאחר שטיפה של דבר, להחזיר את coverslip לשקופית שכותרתו. הכתם עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; קאמרית לחות; 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות). לאחר דגירה לשטוף את coverslips ב 4 צ'אןGES של PBS, ואז להדביק לשקופית שכותרתו עם הרכבה בינונית סט קשה.
- אפשר הרכבה בינונית לרפא למשך 24 שעות ב RT בחושך. בדוק את coverslips תחת המטרה שמן משני מיקרוסקופ שדה בהיר או מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנני הפסקת FITC ו DAPI. בדוק תמונות של 50 שדות לפחות (100 תאים לכל מינימום אורגניזם) עבור שיתוף לוקליזציה (איור 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
רמת החוסן של נתוני השגה מהמערכת המתוארות בדוח זה מוצגת af איור 2 38. באמצעות השימוש במערכת זו האפנון של אינטראקצית staphylococcal ופטריות עם תאים נגועים בנגיף והשפיע על כל הדבקות של אחרים יכול להיות תחום. סוגים של מחקרים אלה דורשים בדיקה מיקרוסקופית של האינטראקציה כפי שמוצגים איורים 3 ו -4 38 על מנת לקבוע אם אינטראקצית polymicrobial מתרחשת על אותם תאים. במחקר זה אינטראקציה תא ההפרש הוא ציין כתוצאה HSV-אפנון של דבקות staphylococcal ופטריות כי הוא ויראלי מינים ספציפיים.
S. aureus ו- C. אלביקנס (GT ו YF) דבקת התאים באותה שליטת הלה HSV-הנגועים. שיתוף לוקליזציה זה על תאים מצביעה על חוסר גופני היקש iCal עם כל דבקות תא הלה של אחרים וכי מדדו רמות של דבקות ההפרש שנמדדו היו סביר בתיווך HSV (איור 3 א, A1) 38. עם זאת, על HSV-1 או HSV-2 נגוע תאים הלה לא שיתוף לוקליזציה של staphylococci ו- C. אלביקנס נצפתה. (איורים 3 ב, B1, B2, B3, C1, C2). באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (FITC- מצומדות אנטי-HSV-GD נוגדן חד שבטי) כמו כן, אישר כי ס aureus לא הופיע לשתף למקם עם ג אלביקנס ולא HSV-1 או HSV-2 (איורים 4 א, A1, A2, A3, A4, B1, B2, B3). שיתוף פעולה זה בין HSV וקנדידה שהועמדו שתי צורות צינור שמרים נבט (איורים 2A-F) של ג אלביקנס. סגוליות זה של הקשר בין השלישיה של חיידקים משקף את הספציפיות של קולוניזציה לראות בקנה מידה רחב יותר הרבה ברירית מארח oronasopharynx.
1 ">
איור 1. X-gal תמונות הכתמה של מינון Dependent HSV-1 זיהום בתאים הלה. תאים הלה נגוע HSV-1 ב שונים הפנים ו- X-Gal מוכתם. (א) תאים הלה היטב של 96 הצלחת היטב עם שליטה תא הלה מעושה נגוע מוכתמים X-גל; 20x גדלה ראשונית; (ב) הלה התאים היטב של 96 הצלחת היטב עם תא הלה מוכתמים X-Gal נגוע HSV-1 לעבר ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10; 20x גדלה ראשונית; (ג) תאים הלה היטב של 96 הצלחת היטב עם תא הלה מוכתמים X-Gal נגוע HSV-1 לעבר ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 50; 20x גדלה ראשונית; סרגל חל על כל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
קבצים / ftp_upload / 54,162 / 54162fig2.jpg "/>
איור 2. השפעת HSV-1 (לוחות A, C, E) ו HSV-2 (לוחות B, D, F) בשעה multiplicities של זיהום (משרד הפנים) של 50 ו -10 על דבקות של ס aureus ו / או C. אלביקנס לתאים הלה. (א) ס aureus (Sa) מחייב HSV-1 תאים נגועים בנוכחות ג צינורות נבט אלביקנס (GT) או צורות שמרים (YF); (ב) ס aureus (Sa) מחייב HSV-2 תאים נגועים בנוכחות ג צינורות נבט אלביקנס (GT) או צורות שמרים (YF); (ג) ג צינורות נבט אלביקנס (GT) מחייב HSV-1 תאים נגועים בנוכחות ס aureus (Sa); (ד) ג צינורות נבט אלביקנס (GT) מחייב HSV-2 תאים נגועים בנוכחות ס aureus (Sa); (ה) ג צורות שמרים אלביקנס (YF) מחייב HSV-1 תאים נגועים בנוכחות ס aureus (Sa); (F) ג צורות שמרים אלביקנס (YF) מחייב HSV-2 תאים נגועים בנוכחות ס aureus (Sa). כל נקודות הנתונים הן ממוצעות +/- SEM, n = 16 מנורמל לשליטה מוירוסים. * = שינויים משמעותי (p <0.05) משליטת תא הלה נגועה. # = שינויים משמעותיים (p <0.05) מנקודה לזווג שמציינים סוגר; הסרגל חל על כל. 38 אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
חוסר איור 3. של ס aureus ו- C. אינטראקציות אלביקנס על HSV-1 ו- HSV-2 תאים הלה אינפקטד. HSV-1 ו- HSV-2 נגוע (משרד הפנים 50) monolayers תא הלה עם ס aureus ו- C. אלביקנס (5: 1 היעד לתא). עבור שדה בהיר מיקרוסקופיה, monolayers התא הוכתמו סגול קריסטל של גראם, אז נבדק על ידי מיקרוסקופ אור. תאים שהיו חיוביים עבור קנדידה או ס aureus (100 תאים בודדים לכל אות חיידק / לכל coverslip) משני נסרקו לנוכחות של חיידק נוסף אותות שיתוף לוקליזציה (הגדלה הראשונית 1,000x). (A & A1) ס aureus (Sa) ו- C. צורות שמרים אלביקנס (YF) או בצורות צינור נבט (GT) שיתוף למקם על תאים הלה נגוע; (A2, כנס). אחוז תאי הלה עם חיידקים שותף מקומי או אדם כלשהו; (B - B3) חוסר ס. aureus ו- C. אלביקנס שיתוף לוקליזציה בנוכחות HSV-1; (C - C2) חוסר ס aureus ו- C. אלביקנס שיתוף לוקליזציה בנוכחות HSV-2. ממוצע ± SEM; סרגל חל על כל. 38r קבל = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
חוסר איור 4. Co-לוקליזציה של ס aureus עם ג אלביקנס על HSV-1 או HSV-2 תאים הלה אינפקטד. HSV-נגוע אתגר monolayers תא הלה עם ס aureus ו- C. אלביקנס (5: 1 היעד לתא) מוכתם (FITC- מצומדות נוגדן HSV GD אנטי, ו DAPI). תמונות מייצגות ממצאי הקרנת התאים שהיו איתות חיובית עבור HSV סרק אז עבור קנדידה וס aureus (100 תאים בודדים לכל אות חיידק לכל coverslip) כי אז נסרקו משני עבור הנוכחות של אותות לוקליזציה שיתוף חיידק נוספים (גדלה ראשונית 1,000x; Nikon). (A - A4) ג אלביקנס (A2, הכנס; מכתים DAPI) שיתוף לוקליזציה עם HSV-1; (B- B3) ג שותף מקומי אלביקנס עם HSV-2 (B1, להוסיף, C. אלביקנס מכתים DAPI). ממוצע ± SEM; הסרגל חל על כל. 38 אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||||||
| צינורות | GT | פותחים עתיד | MSSA | GT / MSSA | YF / MSSA | GT | פותחים עתיד | MSSA | GT / MSSA | YF / MSSA | ||||||
| כְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת | F | F | גברת | גברת | F | גברת | F | F | F | גברת | גברת | F | גברת | F | ||
| א | ||||||||||||||||
| B | ||||||||||||||||
| C | ||||||||||||||||
| D | ||||||||||||||||
| E | ||||||||||||||||
| F | ||||||||||||||||
| G | ||||||||||||||||
| H | ||||||||||||||||
שולחן 1.
קביעת תבנית כללית של דבקות מיקרוביאלית ב אינטראקציות polymicrobial פנוטיפ צינור נבט אלביקנס GT = קנדידה.; YF = ג פנוטיפ טופס שמרים אלביקנס; MSSA = methicillin aureus Staphylococcus רגיש; MS = מלחי מניטול בינוני; F = Fungisel בינוני. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
| פלייט 1 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| הלה תאים בלבד | הלה + GT | הלה + פותחים עתיד | הלה + Sa | הלה + GT + Sa | הלה + YF + Sa | |
| א | ||||||
| B | ||||||
| C | ||||||
| D | ||||||
| פלייט 2 | ||||||
| HSV | הלה תאים + HSV | HSV + הלה + GT > | HSV + הלה + פותחים עתיד | HSV + הלה + Sa | HSV + הלה + GT + Sa | HSV + הלה + YF + Sa |
| א | ||||||
| B | ||||||
| C | ||||||
| D |
טבלה 2.
כללי תבנית עבור ניתוח ויזואלי של אינטראקציות polymicrobial עם HSV-נגוע נגוע הלה תאים GT = קנדידה אלביקנס פנוטיפ צינור נבט.; YF = ג פנוטיפ טופס שמרים אלביקנס; SA = methicillin רגיש Staphylococcus aureus; HSV = וירוס הרפס סימפלקס."Target =" ve.com/files/ftp_upload/54162/54162table2.xlsx _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כרגע אין מידע נגיש יחסי הגומלין המורכבים שבין קבע לחברי חצי קבוע של Microbiome מארח החוצות תחומים טקסונומיות מרובות, כלומר, פרוקריוטים, האיקריוטים ויראלי. לכן פיתחנו רומן במערכת מודל במבחנה ללמוד ייזום ביופילם על ידי ש aureus ו- C. אלביקנס על HSV-1 או HSV-2 נגוע הלה 229 (הלה) תאים 38. מערכת מודל תא הלה מציגה יתרון ייחודי. זאת בשל חוסר ביטוי פיברונקטין שטח, המשמש קולטן עבור שני ס aureus ו- C. אלביקנס 39-41. מאז משטח 42 הפסגה של אפיתלים ריריים בדרך כלל חסר פיברונקטין, מערכת זו באופן הדוק יותר מחק לזה שנצפה זיהום טבעי קולוניזציה 43-47. לכן, אנו מסוגלים יותר ישירים שלה בוחנים את מחזות מחזור קולטן כניסת ויראלי הספציפיים תפקיד הדבקות לאחר מכן על ידי חברים אחרים של Microbiome.
כניסה באמצעות בקיאים הלא מתפשטת HSV-1 ו- HSV-2, ממצאים אלה מראים כי ערך בתא של HSV-1 או HSV-2 הופך תאים מגיבים-זיהום סופר עם ס aureus, תוך שיפור ג דבקות אלביקנס באופן תלוי ריכוז וירוס (איור 4). מעניין לציין, כי התופעות של HSV-1 על צורות GT לעומת YF, היה ההיפוך של שמדד עבור HSV-2, ממצא אשר עשוי להיות בעל השפעה משמעותית על קידום של פטרת נרתיקית במצגות קליניות 48-51. מנקודת מבט בפתוגנזה, מקובל כי הפנוטיפ GT של ג אלביקנס היא הצורה פתוגניים, עם YF המדינה commensal 51-54. דבקות של ג GT אלביקנס שהיו לשתף מודגרות עם ס aureus הראה דפוס שונה של קשירת תאי הלה נגוע HSV, בהשוואה לזה שנמדד עבור YF - ס aureus מחייב. HSV-1 משופר הדבקות של GT לתאים הלה, אבל אל sig בצורה משמעותית ובמידה פחותה (p <0.05) מזה שנמדד לדבקות YF, כפי שפורט לעיל, כלומר, 270% שליטה לדבקות YF ובקרה 190% לדבקות GT. בנוסף, בעוד ש aureus לא היה השפעה על שיפור HSV-1 של GT מחייב, coccus שלל את הדבקות המשופרת המתווכת על ידי הנוכחות של HSV-2. הדפוס ההפוך נצפה עבור ס אפקט aureus על אינטראקצית YF עם תאים נגועים בנגיף. נטייה זו לצורות פטרייתי שונות על ידי HSV-1 (YF) לעומת HSV-2 (GT) עשויה לשחק תחזוקת בימוי תפקידה של מדינת commensal in vivo. באשר להשפעה בצורת GT על S. aureus מחייב, GT כמעט לחלוטין ביטל את עיכוב HSV-1 של דבקות staphylococcal לתאים הלה. לעומת זאת, אם כי היכולת של GT לשייך HSV-2 תאים נגועים הוגדל באופן משמעותי לעומת HSV-1, הנוכחות של ס aureus חסם את הגידול בתיווך HSV-2 בנושא הקפדה.
s = "jove_content"> השאלה אם כל שינוי בנושא הקפדת חיידק הוא התוצאה של קולטנים משוער ספציפי שינו נוכחי, או בשל הפרעה מכאנית-סטרית ניתן לענות במודל זה. באמצעות שימוש בשילוב של quantitation של אינטראקציות חיידק תאים (ספירת CFU) ובדיקה מיקרוסקופית של אינטראקציות, הצלחנו לקבוע כי HSV-1 ו- HSV-2 מופיעים לחסום ס aureus דו תאי אינטראקציה, מאז S. aureus דבקה אך ורק תאים הלה נגוע. יתר על כן, בדיקה מיקרוסקופית של תאים מראה כי קנדידה HSV-1 ו- HSV-2 שותף מקומי. השתמשו יחד כאן את הממצאים של מחקר זה מקביל את הספציפיות באתר תצפיות vivo ב לגרורות המציין את השירות של מודל זה לחקר אינטראקציות polymicrobial.
שימוש יעיל של הפרוטוקול המתואר במסמך זה תלוי במגוון גורמים. ראשית, שימוש התפשטות וירוס לקוי. זה מאפשר examina נקיtion של איתות כניסת תא ויראלי יש השפעה על אינטראקציות חיידק עוקבות ללא הסיבוך של שינויים שיכולים להתרחש עקב לעטוף רכישה לפני שעזבתי את התא. בנוסף, השימוש וירוס פגום מאפשר סביבה בטוחה יותר לטיפול פתוגנים שני מחלקה בטיחות ביולוגית. שנית, בפרוטוקול זה מאפשר שימוש בשתי גרסאות דבקות ויראלי חיידק. שימוש הגירסות שרק להיקשר לקולטנים ספציפיים התיר תיחום של קולטנים משותפים בין חיידקים, או, לחלופין זיהוי של קולטנים רומן. באמצעות השימוש של נוגדנים חד שבטיים לקולטנים, יש את הפוטנציאל להדמיה של לוקליזציה adhesin על פני שטח החיידק ומספק כלי ללמוד ביטוי adhesin שינה. פרוטוקול זה אינו מתאים לחקר חיידקים אשר לא יכול להיות מבודד באופן סלקטיבי על מדיום הפרש. המתודולוגיה היא גם תלויה בזמינות של נוגדנים חד שבטיים לחלבונים ספציפי וירוס. למרותnalysis במחקר זה קיבל משנה תוקף בשל ההפרש בגודל בין שמרים וחיידקים, השימוש מתויג באופן דיפרנציאלי פלורסנטי, למשל טקסס אדום, נוגדן חד-שבטי ספציפי חיידק יהיה אמצעי לעקוף צריך החיידקים המדובר להיות דומה במורפולוגיה וגודל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C.albicans | |||
| BBL Sabouraud Dextrose | BD | 211584 | |
| Fungisel Agar | Dot Scientific | 7205A | |
| S.aureus | |||
| Mannitol Salt Agar | Troy Biologicals | 7143B | |
| Sheep blood agar | Troy Biologicals | 221239 | |
| Hela cells | |||
| 1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CM | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Sigma | 1397 | 50 µg/ml final concentration in the complete DMEM |
| Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% final concentration in the complete DMEM |
| Other medium and reagents | |||
| ONPG | Thermo Scientific | 34055 | |
| Ultra-Pure X gal | Invitrogen | 15520-018 | |
| 1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) | Corning | 20-021-CV | |
| 1x PBS | Dot Scientific | 30042-500 | |
| RIPA Lysis | Life Technologies | 89901 | |
| Staining | |||
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| HSV 1&2, specific for gD | ViroStat | 196 | |
| DAPI | SIGMA | D8417-5MG | |
| Gram Crystal Violet | Troy Biologicals | 212527 | |
| Supplies | |||
| Petri dish 100 x 15 | Dot Scientific | 229693 | |
| Petri dish 150 x 15 | Kord Valmark | 2902 | |
| 96-Well plates | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | |
| 24-well plates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Culture tubes 100 x 13 | Thomas Scientific | 9187L61 | |
| Cover slip circles, 12 mm | Deckglaser | CB00120RA1 |
References
- Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
- Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
- Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
- Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
- Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
- Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
- Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
- Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
- Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
- Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
- Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
- Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
- Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
- Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
- Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
- Hauck, C. R. Cell adhesion receptors - signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
- Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
- Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
- Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
- Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, http://dx.doi.org/10.1016/j.expneurol.2006.04.026 461-469 (2006).
- Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
- Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
- National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
- Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
- Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
- Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
- Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
- Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
- Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
- Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
- Nenoff, P., et al. Mycology - an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
- Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
- Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. , (2016).
- Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. , (2014).
- Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, Suppl 4 400-403 (1987).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
- Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
- Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, (Pt 5) 569-581 (1997).
- Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
- Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, http://dx.doi.org/10.1016/j.matbio.2005.06.008 389-399 (2005).
- Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
- Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
- Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
- Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
- Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
- Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
- Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).
