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Immunology and Infection

जीवाणु और कवक द्वारा वायरस से संक्रमित कोशिकाओं पर Biofilm दीक्षा का निर्धारण

Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54162

Abstract

वर्गीकरण राज्यों है कि कवक, बैक्टीरिया और वायरस शामिल भर polymicrobial बातचीत का अध्ययन पहले से कैसे Microbiome के वायरल सदस्यों को इन वायरस से संक्रमित मेजबान कोशिकाओं के साथ बाद में सूक्ष्म जीव संबंधों को प्रभावित करने के लिए सम्मान के साथ जांच नहीं की गई है। बैक्टीरिया और कवक के साथ वायरस के सह बस्ती मुख्यतः मौखिक गुहा और जननांग पथ की श्लैष्मिक सतहों पर मौजूद है। श्लैष्मिक कोशिकाओं, विशेष रूप से लगातार क्रोनिक या लगातार अव्यक्त वायरल संक्रमण के साथ उन लोगों के लिए, एक महत्वपूर्ण संख्या में वायरस परिवर्तन के माध्यम से Microbiome के सदस्यों पर प्रभाव और व्यक्त रिसेप्टर्स के प्रकार हो सकता था। मेजबान कोशिका झिल्ली वास्तुकला में संशोधन biofilm गठन, यानी, पालन करने में पहला कदम आरंभ करने के लिए सामान्य वनस्पति और अवसरवादी रोगजनकों के बाद सदस्यों की बदल क्षमता पर नतीजा होगा। इस अध्ययन बायोफिल की दीक्षा पर quantitation और एचएसवी के प्रभाव के दृश्य परीक्षा के लिए एक विधि का वर्णनएम गठन (पालन) एस के ऑरियस और सी सफेद।

Introduction

मानव शरीर में Microbiome का हिस्सा है कि भौगोलिक क्षेत्रों के कई वर्गीकरण राज्यों से विविध जीवों भी शामिल है। सेल सतहों का पालन biofilm गठन, जो Microbiome उपनिवेशन प्रक्रिया का हिस्सा है में एक आवश्यक पहला कदम है। Microbiome में शामिल वायरस है कि पुरानी और लगातार संक्रमण का कारण हो सकता है। इन वायरस से पुरानी सेल संक्रमण ख्यात रिसेप्टर उपलब्धता में एक परिवर्तन का कारण बन सकता है। 1,2 इसके अलावा, intracellular रोगजनकों द्वारा सेल प्रविष्टि भी मेजबान झिल्ली तरलता / hydrophobicity जो बदले में अन्य Microbiome सदस्यों की कुर्की, बैक्टीरिया और कवक सहित बदल सकता है प्रभावित कर सकता है । आदेश बातचीत है कि इन कई रोगजनकों मानव मेजबान का एक ही भौगोलिक क्षेत्रों में है कि सह स्थानीय बनाना बीच हो सकता है समझने के लिए, हम रोगज़नक़ों कि mucosal सतह पर उपस्थित वर्गीकरण राज्यों के स्पेक्ट्रम का प्रतिनिधित्व करने का बातचीत का अध्ययन करने के लिए सक्षम होना चाहिए।

टी "> Herpesviridae Microbiome के स्थायी सदस्य के रूप में मनुष्य की 100% में मौजूद रोगाणुओं के एक परिवार के हैं 3,4। इसके अलावा वे भी लगातार दोनों की उपस्थिति और लक्षण के अभाव में बहाया जा सकता है। विशेष रूप से, दाद सिंप्लेक्स वायरस -1 और दाद सिंप्लेक्स वायरस -2 (एचएसवी -1 और एचएसवी -2, क्रमशः) oronasopharynx और जननांग पथ में Microbiome के स्थायी सदस्य हैं। प्रतिरक्षा सक्षम व्यक्तियों में, दोनों एचएसवी -1 और एचएसवी -2 कारण gingivostomatitis, साथ ही जननांग दाद 5-8। इन साइटों पर, एचएसवी पुरानी लगातार स्पर्शोन्मुख वायरल nectins, Heparan सल्फेट, लिपिड राफ्ट और herpesvirus प्रवेश मध्यस्थ की सतह अभिव्यक्ति में परिवर्तन में कोशिकाओं परिणामों में बहा 9। एचएसवी की एंट्री / ट्यूमर नेक्रोसिस की विशेषता एक अव्यक्त संक्रमण का कारण बनता है कारक रिसेप्टर (HVEM / TNFR) 10-25। कुछ बैक्टीरिया और कवक, जैसे एस ऑरियस और सी albicans के लिए ये संभावित साझा प्रतिनिधित्व रिसेप्टर्स, जबकि जो अवसरवादी रोगजनकों,यह भी oronasopharynx 26,27 की श्लैष्मिक Microbiome के सदस्यों के रूप में निवास कर सकते हैं। Oronasopharynx एस के भीतर ऑरियस और सी सफेद उपनिवेशवाद की दो अलग-अलग साइटों पर कब्जा। प्राकृतिक दांत के साथ होस्ट में, मौखिक mucosa एचएसवी -1 और सी द्वारा साझा किया जाता है सफेद, पूर्वकाल नाक nares एस के कब्जे में हैं, जबकि ऑरियस 28। हालांकि, के बावजूद इन विट्रो निष्कर्ष है कि एस ऑरियस मुंह उपकला कोशिकाओं का पालन करता है, 29,30 एस ऑरियस बार बार मौखिक नमूनों से अलग है जब सामान्य ऊतक वर्तमान 29,30 है। लिटिल नैदानिक ​​निष्कर्षों से परे है कि जननांग पथ सह-उपनिवेशवाद आलों के विषय में जाना जाता है एस ऑरियस एरोबिक योनिशोथ साथ जुड़ा हुआ है, जननांग सूजन, मुक्ति और dyspareunia के द्वारा होती है, जबकि सी सफेद मौखिक गुहा 31-35 में मनाया समान श्लैष्मिक घावों पैदा करता है। इस प्रकार, हालांकि मौखिक और जननांग microbi के इन सदस्योंome पार वर्गीकरण थोड़ा उनकी बातचीत के विषय में जाना जाता है राज्यों के रूप में यह प्रभावों मेजबान कोशिका की सतह से 5 पालन के माध्यम से biofilm गठन आरंभ करने की क्षमता। इस प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से सह-उपनिवेशवाद / संक्रमण के कार्यात्मक परिणाम निर्धारित करने के लिए लागू किया गया है।

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Protocol

1. एचएसवी खींच और हैंडलिंग

नोट: संयोजक गैर-प्रसार के एचएसवी -1 (कोस) gL86 और एचएसवी -2 (कोस) 333gJ - बीटा galactosidase संवाददाता इस्तेमाल किया वी Twiari 36,37 द्वारा प्रदान किया गया गतिविधि के साथ।

  1. एक 1 में -80 डिग्री सेल्सियस पर एक भी बहुत कुछ है और दुकान से वायरस का उपयोग करें: Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ (DMEM) की 1 के अनुपात और उपयोग करें जब तक दूध स्किम। वायरल बहुत भंडारण से पहले, -nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) और 5 ब्रोमो-4-क्लोरो-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (एक्स-लड़की) परख द्वारा वायरस एकाग्रता का निर्धारण।
  2. , संवाददाता वायरस प्रवेश परख का उपयोग कर प्रत्येक प्रयोगात्मक परख रन के लिए वायरस व्यवहार्यता और संक्रमण (MOI) की बहुलता एक्स-लड़की धुंधला द्वारा निर्धारित बनाने के रूप में पहले वर्णित (चित्रा 1) 14।
  3. वांछित MOI के वायरस (ऑप्ट सदस्य) पतला। फिक्स monolayers (paraformaldehyde, 0.5 मिलीग्राम / अच्छी तरह से) धुंधला होने से पहले। एक अलग microti में वायरस व्यवहार्यता नियंत्रण रखेंpolymicrobial परख प्लेटों के साथ समानांतर में आतंकवाद थाली।

2. हेला 299 सेल हैंडलिंग

  1. 4.5 छ / एल ग्लूकोज, 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), जेंटामाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) और एल glutamine के साथ 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 DMEM में से बढ़ता है। Trypsin समाधान के साथ 80% संगम पर पारित होने कोशिकाओं (; 0.05% trypsin; ethylenediaminetetraacetic एसिड, 0.53 एम EDTA 5 मिलीग्राम / कुप्पी)।

3. सी सफेद हैंडलिंग

नोट: सी एक नैदानिक ​​प्रयोगशाला स्रोत से प्राप्त albicans Remmel में -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जाता है मध्यम 2x दूध स्किम।

  1. संस्कृति Sabouraud Dextrose मध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) पर जमे हुए शेयर। के बाद 24 घंटे उपसंस्कृति सी Fungisel माध्यम पर सफेद (37 डिग्री सेल्सियस, 48 घंटा) उपयोग के लिए।
  2. रोगाणु ट्यूब (जीटी) रूपों उत्पन्न (; 3 मिलीलीटर FBS; प्रतिनिधि कालोनियों लेने 3 घंटा, 37 डिग्री सेल्सियस, ABS 600, 0.3)। ऊष्मायन के बाद, जीटी धोने (HbSS, 2x, 4000 XG)। गरम HBSS को धोया जीटी जोड़ें (37 &# 176; सी; 0.32 पेट 600)। जीटी रूपों मनाया के रूप में hemocytometer गिनती द्वारा निर्धारित कोशिकाओं का 99% होना चाहिए।
  3. प्रतिनिधि Fungisel कालोनियों उठा द्वारा खमीर फॉर्म (YF) स्टॉक निलंबन बनाओ (HbSS, 3 मिलीग्राम; 0.32 पेट 600)। YF रूपों की संख्या की गणना / microscopically एक hemocytometer का उपयोग मिलीलीटर। YF रूपों मनाया के रूप में hemocytometer गिनती द्वारा निर्धारित कोशिकाओं का 99% होना चाहिए।
  4. फंगल शेयर काम कर बनाओ (25 मिलीलीटर HBSS में जीटी या YF शेयर के 250 μl; 37 डिग्री सेल्सियस, 10 5 CFU / एमएल)

4. एस ऑरियस हैंडलिंग

  1. स्टोर एस ऑरियस ATCC 25923 (-80 ° C, Remmel दूध 2x हवा में घूमना)। भेड़ रक्त अगर पर संस्कृति (5%; 37 डिग्री सेल्सियस, 24 घंटे)। प्रतिनिधि कालोनियों उठाओ और शेयर के लिए 2 दिनों के भीतर मध्यम लवण mannitol के लिए स्थानांतरण (; 18 घंटा 37 डिग्री सेल्सियस)।
  2. एस बनाओ ऑरियस शेयर निलंबन (3 मिलीलीटर HBSS; 1.32 पेट 600; 10 8 CFU / एमएल)
    1. काम कर रहा एस बनाओ ऑरियस शेयर (100 μl25 मिलीलीटर HBSS में शेयर की; 10 5 CFU / एमएल)।

5. कैंडिडा और एस ऑरियस निलंबन

  1. मिश्रित सी बनाओ सफेद और एस ऑरियस निलंबन (250 μl YF या जी.टी. शेयर और 25 मिलीलीटर HBSS में 100 μl एस ऑरियस शेयर)।

6. polymicrobial Biofilm परख

  1. 2 एक्स 10 5 हेला कोशिकाओं / एमएल के 200 μl (85% संगम स्तर) के साथ बीज 96 अच्छी तरह प्लेटें। रॉक प्लेटों (30 - 45 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस) ऊष्मायन से पहले (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर, 18 घंटा)। धो monolayers (1x; ऑप्ट सदस्य) तो एचएसवी के साथ बीज (एचएसवी -1 (कोस) gL86 या एचएसवी -2 (कोस) 33 GJ - 100 μl में ऑप्ट सदस्य; MOI 50 और 10)। प्लेटें सेते (3 घंटा, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2)। केवल एक ही प्रति दिन वायरल तनाव का प्रयोग करें।
  2. संक्रमित monolayers धो (1x, फॉस्फेट बफर खारा (मिलीग्राम + 2 + 2 और सीए के साथ पीबीएस), 100 μl)। 25 & # छोड़ने गर्म HBSS के साथ पीबीएस बदलें181; प्रत्येक कुएं में एल।
    1. YF, जी.टी. और / या एस जोड़े (; सेल अनुपात = 5 करने के लिए लक्ष्य 100 μl: 1; एन = 16) ऑरियस काम कर निलंबन। तालिका 1 में संकेत के रूप में प्लेटें सेते (स्थिर, 30 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2)।
  3. ऊष्मायन के बाद, महाप्राण एक समय में एक स्तंभ तुरंत मिलीग्राम + 2 + 2 और सीए के साथ 300 μl पीबीएस के साथ refilling। इस कदम दो बार दोहराएँ फिर जोड़ने के रेडियो-immunoprecipitation परख lysis बफर (RIPA, फिल्टर निष्फल, एक 1:50 कमजोर पड़ने के 200 μl)।
  4. तेजी से triturate हेला सेल lysate तो mannitol लवण (एमएस) और / या Fungisel (एफ) मीडिया (चित्रा 2) पर 50 μl जगह है। एक 90 डिग्री के कोण पर lysate एक गिलास छड़ी का उपयोग कर मुड़े बिखरा हुआ है। प्लेटें सेते (37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटा)। मैन्युअल प्रति प्लेट कालोनियों की संख्या गिनती। नियंत्रण एस से मिलकर बनता है ऑरियस और / या सी एचएसवी uninfected हेला कोशिकाओं को सफेद पालन।

7. इमेजिंग अध्ययन </ P>

  1. हर दौर गिलास coverslip धो (12 मिमी, 50 मिलीलीटर 100 मिलीलीटर बीकर में एसीटोन)। सूखी और बाँझ coverslips (Kimwipes, कांच पेट्री डिश)। सूखी बाँझ coverslips शराब लौ निष्फल संदंश के साथ बाँझ 24 अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं में रखें।
  2. 24 अच्छी तरह प्लेटें धोया बाँझ दौर कांच coverslips युक्त के कुओं के लिए, हेला कोशिकाओं (5 एक्स 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए इस्तेमाल मात्रा 1 मिलीग्राम) जोड़ें। वायरस, बैक्टीरिया और कवक टेम्पलेट (तालिका 2) 5 एक्स 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए इस्तेमाल की मात्रा के अनुसार जोड़ें, तो सेते हैं और प्रक्रिया कदम से ऊपर 6.4 6.2.1 में वर्णित है।
  3. अंतिम धोने के बाद, मेथनॉल के साथ स्लाइड में बाढ़ और यह लुप्त हो जाना करने की अनुमति देकर माइक्रोस्कोपी के लिए कोशिकाओं को ठीक। धुंधला जब तक आरटी पर प्लेटों स्टोर।
  4. उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी (1,000x अंतिम मूल बढ़ाई) के लिए विआयनीकृत पानी के साथ मेथनॉल तय coverslips युक्त कुओं भरें। इसके तत्काल बाद पानी aspirate। ग्राम क्रिस्टल वायलेट के साथ प्रत्येक coverslip कवर। धो गैर बाध्य दाग (विआयनीकृत पानी) से मुक्त coverslips। बगल में सूखी coverslips तो (चित्रा 3) हार्ड सेट बढ़ते एक लेबल स्लाइड के माध्यम के साथ उन्हें पालन करना।
  5. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (100x उद्देश्य; 1,000x अंतिम मूल बढ़ाई) के लिए धोने कदम 7.4 में वर्णित के रूप में अनिवार्य रूप से मेथनॉल के मुक्त coverslips। कुओं में coverslips सूखी।
    1. सूखने के बाद, कवर फिसल जाता है हटा दें और लेबल स्लाइड पर उन्हें जगह है। (- 5 μl 1) फिर से fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) संयुग्मित दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1:20 कमजोर पड़ने की coverslip कवर करने के लिए 1 + 2 जीडी एंटीबॉडी लिए पर्याप्त मात्रा में जोड़ें।
    2. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक नमी कक्ष में स्लाइड्स सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, पीबीएस के 4 परिवर्तन में coverslips धो लें।
    3. अंतिम धोने के बाद, लेबल स्लाइड के लिए coverslip वापसी। 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (; नमी कक्ष, 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस DAPI) के साथ दाग। ऊष्मायन के बाद 4 चान में coverslips धोनेपीबीएस के GES, तो बढ़ते मध्यम कठिन सेट के साथ लेबल स्लाइड करने के लिए प्रत्यय।
    4. बढ़ते मध्यम अंधेरे में आरटी पर 24 घंटे के लिए इलाज के लिए अनुमति दें। या तो एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप या FITC और DAPI कटऑफ फिल्टर के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर तेल उद्देश्य के तहत coverslips जांच करते हैं। सह स्थानीयकरण (चित्रा 4) के लिए कम से कम 50 क्षेत्रों (जीव न्यूनतम प्रति 100 कोशिकाओं) के चित्रों की जांच।

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Representative Results

इस रिपोर्ट में वर्णित प्रणाली से प्राप्य डेटा की मजबूती के स्तर पर चित्रा 2 वायुसेना 38 में दिखाया गया है। इस प्रणाली के उपयोग के माध्यम virally संक्रमित कोशिकाओं और एक दूसरे के पालन पर उनके प्रभाव के साथ staphylococcal और कवक बातचीत के मॉडुलन चित्रित किया जा सकता है। अध्ययन के इन प्रकार की बातचीत का सूक्ष्म परीक्षण की आवश्यकता के रूप में निर्धारित करने के लिए polymicrobial बातचीत ही कोशिकाओं पर हो रहा है कि क्या में आंकड़े 3 और 4 38 में दिखाया गया है। इस अध्ययन में अंतर सेल बातचीत staphylococcal और कवक पालन के एचएसवी मॉडुलन विशिष्ट है कि वायरल प्रजातियों में से एक परिणाम के रूप में मनाया जाता है।

एस ऑरियस और सी सफेद (जी.टी. और YF) एक ही एचएसवी असंक्रमित हेला नियंत्रण कक्षों का पालन किया। कोशिकाओं पर यह सह स्थानीयकरण मानसिक की कमी को इंगित करता है अंतर पालन की मापा स्तर को मापा एक दूसरे के हेला सेल पालन के साथ और कहा कि राजनैतिक निष्कर्ष की संभावना एचएसवी की मध्यस्थता (चित्रा 3 ए, ए 1) 38 थे। हालांकि, एचएसवी -1 या एचएसवी -2 पर हेला कोशिकाओं को संक्रमित staphylococci और सी का कोई सह स्थानीयकरण सफेद मनाया गया। (आंकड़े 3 बी, बी 1, बी 2, बी 3, सी 1, सी 2)। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग (FITC संयुग्मित विरोधी एचएसवी जीडी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी) आगे की पुष्टि की है कि एस ऑरियस सी के साथ सह स्थानीय बनाना प्रकट नहीं किया था सफेद और न ही एचएसवी -1 या एचएसवी -2 (आंकड़े -4 ए, A1, A2, A3, A4, बी 1, बी 2, बी 3)। एचएसवी और कैंडिडा के बीच यह सहयोग दोनों खमीर और रोगाणु ट्यूब रूपों सी (आंकड़े 2A-एफ) के लिए बढ़ाया सफेद। रोगाणुओं के त्रय के बीच सहयोग की यह विशिष्टता मेजबान oronasopharynx म्यूकोसा में एक बहुत व्यापक पैमाने पर देखा उपनिवेशवाद की विशिष्टता को दर्शाता है।

1 "> आकृति 1
हेला कोशिकाओं में खुराक निर्भर एचएसवी -1 संक्रमण के चित्र 1 एक्स-लड़की धुंधला चित्र। हेला विभिन्न MOI और एक्स-लड़की दाग पर एचएसवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं। एक्स-लड़की दाग नकली संक्रमित हेला सेल नियंत्रण के साथ 96 अच्छी तरह से थाली के कुएं में (ए) हेला कोशिकाओं; 20x बढ़ाई प्रारंभिक; (बी) हेला संक्रमण का एक बहुलता 10 के (MOI) पर एचएसवी -1 से संक्रमित एक्स-लड़की दाग हेला सेल के साथ 96 अच्छी तरह से थाली के कुएं में कोशिकाओं; 20x बढ़ाई प्रारंभिक; संक्रमण का एक बहुलता 50 के (MOI) पर एचएसवी -1 से संक्रमित एक्स-लड़की दाग हेला सेल के साथ 96 अच्छी तरह से थाली के कुएं में (सी) हेला कोशिकाओं; 20x बढ़ाई प्रारंभिक; पैमाने बार सभी के लिए लागू होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फ़ाइलें / ftp_upload / 54162 / 54162fig2.jpg "/>
चित्रा 2। एचएसवी -1 का प्रभाव (पैनल ए, सी, ई) और एचएसवी -2 (पैनल बी, डी, एफ) संक्रमण की multiplicities पर 50 और 10 के (MOI) एस के पालन पर ऑरियस और / या सी हेला कोशिकाओं को सफेद। (ए) एस ऑरियस (एसए) सी की मौजूदगी में एचएसवी -1 संक्रमित कोशिकाओं के लिए बाध्य सफेद रोगाणु ट्यूब (जीटी) या खमीर रूपों (YF); (बी) एस ऑरियस (एसए) सी की मौजूदगी में एचएसवी -2 संक्रमित कोशिकाओं के लिए बाध्य सफेद रोगाणु ट्यूब (जीटी) या खमीर रूपों (YF); (सी) सी सफेद रोगाणु ट्यूब (जीटी) एस की उपस्थिति में एचएसवी -1 संक्रमित कोशिकाओं के लिए बाध्य ऑरियस (एसए), (घ) सी सफेद रोगाणु ट्यूब (जीटी) एस की उपस्थिति में एचएसवी -2 संक्रमित कोशिकाओं के लिए बाध्य ऑरियस (एसए); (ई) सी albicans खमीर रूपों (YF) एस की उपस्थिति में एचएसवी -1 संक्रमित कोशिकाओं के लिए बाध्य ऑरियस (एसए); (एफ) सी albicans खमीर रूपों (YF) एस की उपस्थिति में एचएसवी -2 संक्रमित कोशिकाओं के लिए बाध्य ऑरियस (एसए)। सभी डेटा अंक मतलब हैं +/- SEM, N = 16 वायरस मुक्त नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत। * = काफी अलग (पी <0.05) असंक्रमित हेला सेल नियंत्रण से। # = काफी अलग ब्रैकेट ने संकेत दिया बनती बिंदु से (पी <0.05); पैमाने बार सभी के लिए लागू होता है। 38 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. एस की कमी ऑरियस और सी एचएसवी -1 और एचएसवी -2 संक्रमित हेला कोशिकाओं पर सफेद सहभागिता। एस के साथ एचएसवी -1 और एचएसवी -2 संक्रमित (MOI 50) हेला सेल monolayers ऑरियस और सी सफेद (5: सेल करने के लिए 1 लक्ष्य)। उज्ज्वल क्षेत्र के लिए माइक्रोस्कोपी, सेल monolayers ग्राम के क्रिस्टल बैंगनी, तो प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच के साथ दाग रहे थे। प्रकोष्ठों कि कैंडिडा या एस के लिए सकारात्मक थे ऑरियस (coverslip प्रति सूक्ष्म जीव संकेत प्रति 100 व्यक्ति कोशिकाओं /) गौणतः अतिरिक्त सूक्ष्म जीव सह स्थानीयकरण संकेतों की उपस्थिति (1,000x प्रारंभिक बढ़ाई) के लिए स्कैन किया गया। (ए एंड ए 1) एस ऑरियस (एसए) और सी albicans खमीर रूपों (YF) या रोगाणु ट्यूब रूपों (जीटी) असंक्रमित हेला कोशिकाओं पर सह स्थानीय बनाना; (A2, डालें)। सह स्थानीय या व्यक्तिगत रोगाणुओं के साथ हेला कोशिकाओं का प्रतिशत; (बी - बी 3) एस का अभाव। ऑरियस और सी एचएसवी -1 की उपस्थिति में सफेद सह स्थानीयकरण; (सी - सी 2) एस की कमी ऑरियस और सी एचएसवी -2 की उपस्थिति में सफेद सह स्थानीयकरण। ± SEM मतलब है, पैमाने बार सभी के लिए लागू होता है। 38rget = "_blank"> कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4 एस के सह स्थानीयकरण की कमी सी के साथ ऑरियस सफेद एचएसवी -1 या एचएसवी -2 संक्रमित हेला कोशिकाओं पर। एचएसवी संक्रमित एस के साथ हेला सेल monolayers चुनौती ऑरियस और सी सफेद (5: सेल करने के लिए 1 लक्ष्य) दाग (FITC संयुग्मित विरोधी एचएसवी जीडी एंटीबॉडी, और DAPI)। चित्र है कि संकेत एचएसवी तो कैंडिडा और एस के लिए स्कैन के लिए सकारात्मक थे कोशिकाओं की स्क्रीनिंग से निष्कर्षों के प्रतिनिधि हैं ऑरियस कि तब गौणतः अतिरिक्त सूक्ष्म जीव सह स्थानीयकरण संकेतों की उपस्थिति के लिए स्कैन किया गया (coverslip प्रति सूक्ष्म जीव संकेत प्रति 100 व्यक्ति की कोशिकाओं) (1,000x प्रारंभिक बढ़ाई, निकॉन)। (ए - ए 4) सी सफेद (A2, डालें, DAPI धुंधला) के सह स्थानीय बनाना एचएसवी -1 के साथ; (बी- बी 3) सी सफेद सह स्थानीय एचएसवी -2 (बी 1, डालें, सी। DAPI धुंधला albicans) के साथ। ± SEM मतलब है, पैमाने बार सभी के लिए लागू होता है। 38 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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ट्यूब जी.टी. YF MSSA जीटी / MSSA YF / MSSA जी.टी. YF MSSA जीटी / MSSA YF / MSSA
मीडिया एफ एफ सुश्री सुश्री एफ सुश्री एफ एफ एफ सुश्री सुश्री एफ सुश्री एफ
बी
सी
डी
एफ
जी
एच

तालिका एक।
Polymicrobial सहभागिता में माइक्रोबियल पालन के जनरल खाका निर्धारण जीटी = कैंडिडा सफेद रोगाणु ट्यूब फेनोटाइप। YF = सी albicans खमीर प्रपत्र phenotype; MSSA = संवेदनशील स्ताफ्य्लोकोच्चुस मेथिसिलिन; एमएस mannitol लवण = मध्यम; एफ = Fungisel मध्यम। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

प्लेट 1 1 2 3 4 5 6
केवल हेला कोशिकाओं हेला + जी.टी. हेला + YF हेला + एसए हेला + जीटी + एसए हेला + YF + एसए
बी
सी
डी
प्लेट 2
एचएसवी हेला कोशिकाओं + एचएसवी एचएसवी + हेला + जी.टी. > एचएसवी + हेला + YF एचएसवी + हेला + एसए एचएसवी + हेला + जीटी + एसए एचएसवी + हेला + YF + एसए
बी
सी
डी

सारणी 2।
एचएसवी संक्रमित और असंक्रमित हेला कोशिकाओं के साथ polymicrobial सहभागिता के दृश्य विश्लेषण के लिए जनरल खाका जीटी = कैंडिडा सफेद रोगाणु ट्यूब फेनोटाइप। YF = सी albicans खमीर प्रपत्र phenotype; SA = मेथिसिलिन संवेदनशील स्ताफ्य्लोकोच्चुस; एचएसवी = दाद सिंप्लेक्स वायरस।ve.com/files/ftp_upload/54162/54162table2.xlsx "लक्ष्य =" _blank "> इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्तमान में कोई जानकारी होस्ट Microbiome की अर्द्ध स्थायी सदस्यों को बताया कि कई वर्गीकरण डोमेन, यानी, प्रोकार्योटिक यूकेरियोटिक और वायरल पार करने के लिए स्थायी बीच जटिल संबंधों पर उपलब्ध है। इसलिए हम एस द्वारा biofilm दीक्षा अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल प्रणाली में एक उपन्यास विकसित ऑरियस और सी सफेद एचएसवी -1 या एचएसवी -2 पर संक्रमित हेला 229 (हेला) कोशिकाओं 38। हेला सेल मॉडल प्रणाली एक अनूठा लाभ प्रस्तुत करता है। इस सतह फ़ाइब्रोनेक्टिन अभिव्यक्ति की कमी है, जो दोनों एस के लिए एक रिसेप्टर के रूप में कार्य करता है की वजह से है ऑरियस और सी सफेद 39-41। चूंकि श्लैष्मिक epithelia के शिखर 42 सतह सामान्य रूप से और अधिक बारीकी से mimics कि प्राकृतिक संक्रमण और उपनिवेशवाद 43-47 में मनाया फ़ाइब्रोनेक्टिन, इस प्रणाली का अभाव है। इस प्रकार, हम अधिक से सीधे Microbiome के अन्य सदस्यों द्वारा बाद में पालन में भूमिका विशिष्ट वायरल प्रविष्टि रिसेप्टर कारोबार नाटकों की जांच करने में सक्षम हैं।

का प्रयोग प्रविष्टि कुशल गैर-प्रसार के एचएसवी -1 और एचएसवी -2, ये निष्कर्ष बताते हैं कि एचएसवी -1 या एचएसवी -2 की सेल प्रविष्टि एस के साथ सुपर संक्रमण के लिए आग रोक कोशिकाओं renders ऑरियस, सी बढ़ाने, जबकि एक वायरस एकाग्रता निर्भर तरीके से सफेद पालन (चित्रा 4)। दिलचस्प है, जीटी रूपों बनाम YF पर एचएसवी -1 के प्रभाव, एचएसवी -2, एक खोज जो नैदानिक ​​प्रस्तुतियों 48-51 में योनि कैंडिडिआसिस को बढ़ावा देने पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है के लिए मापा है कि रिवर्स था। एक रोगजनन दृष्टिकोण से, यह आम तौर पर स्वीकार किया है कि सी के जीटी phenotype सफेद YF खानेवाला राज्य 51-54 के साथ रोगजनक रूप है। सी का पालन सफेद जीटी कि एस के साथ सह incubated रहे थे ऑरियस, एचएसवी संक्रमित हेला कोशिकाओं के लिए बाध्य YF के लिए मापा तुलना में से एक बदल पैटर्न से पता चला है - एस ऑरियस बाध्यकारी। एचएसवी -1 हेला कोशिकाओं को बढ़ाया जीटी का पालन, लेकिन एक हस्ताक्षर करने के लिएnificantly हद तक कम (पी <0.05) से अधिक है कि, जैसा कि ऊपर चर्चा की YF पालन के लिए मापा जाता है, यानी, 270% YF पालन और जीटी पालन के लिए 190% नियंत्रण के लिए नियंत्रण। इसके अलावा, जबकि एस ऑरियस जीटी बंधन के एचएसवी -1 वृद्धि पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, coccus एचएसवी -2 की उपस्थिति द्वारा मध्यस्थता बढ़ाया पालन नकार दिया। रिवर्स पैटर्न एस के लिए मनाया गया वायरस संक्रमित कोशिकाओं के साथ बातचीत पर YF ऑरियस प्रभाव। एचएसवी -1 (YF) बनाम एचएसवी -2 (जीटी) द्वारा अलग कवक रूपों के लिए यह झुकाव विवो में खानेवाला राज्य की भूमिका निर्देशन रखरखाव निभा सकते हैं। साथ एस पर जीटी प्रपत्र के प्रभाव के संबंध ऑरियस बंधन, जीटी लगभग पूरी तरह से हेला कोशिकाओं को staphylococcal पालन के एचएसवी -1 निषेध समाप्त कर दिया। इसके विपरीत, हालांकि एचएसवी -2 संक्रमित कोशिकाओं के साथ संबद्ध करने के लिए जीटी की क्षमता काफी एचएसवी -1, एस की उपस्थिति की तुलना में वृद्धि की गई थी ऑरियस पालन में एचएसवी -2 मध्यस्थता वृद्धि अवरुद्ध।

एस ब्लॉक करने के लिए दिखाई सक्षम थे ऑरियस बातचीत सेल, एस के बाद से ऑरियस असंक्रमित हेला कोशिकाओं को पूरी तरह से पालन किया। इसके अलावा, कोशिकाओं का सूक्ष्म परीक्षण बताते हैं कि Candida और एचएसवी -1 और एचएसवी -2 सह स्थानीय। एक साथ यहां इस्तेमाल इस अध्ययन से निष्कर्ष polymicrobial बातचीत के अध्ययन के लिए इस मॉडल की उपयोगिता का संकेत उपनिवेशन के लिए इन विवो टिप्पणियों साइट विशिष्टता समानांतर।

प्रोटोकॉल यहाँ बताया के प्रभावी उपयोग कारकों की एक किस्म पर निर्भर है। सबसे पहले, प्रसार की कमी वायरस का उपयोग करें। यह एक स्वच्छ परीक्षा में सक्षम बनाता हैप्रभाव वायरल प्रवेश और संकेतन सेल के tion परिवर्तन है कि आवृत-अधिग्रहण के लिए सेल छोड़ने से पहले कारण हो सकता है की जटिलता के बिना बाद में सूक्ष्म जीव बातचीत पर है। इसके अलावा, दोषपूर्ण वायरस का उपयोग जैव सुरक्षा कक्षा दो रोगज़नक़ों से निपटने के लिए एक सुरक्षित वातावरण के लिए अनुमति देता है। दूसरे, इस प्रोटोकॉल दोनों वायरल और सूक्ष्म जीव पालन वेरिएंट के उपयोग के लिए अनुमति देता है। वेरिएंट के उपयोग कि केवल विशिष्ट रिसेप्टर्स के लिए बाध्य रोगाणुओं, या, वैकल्पिक उपन्यास रिसेप्टर्स का पता लगाने के बीच साझा रिसेप्टर्स के चित्रण के लिए परमिट। रिसेप्टर्स करने के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के उपयोग के माध्यम से, वहाँ सूक्ष्म जीव सतह पर adhesin स्थानीयकरण के दृश्य के लिए संभावित है और बदल adhesin अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल रोगाणुओं के अध्ययन है कि चुनिंदा अंतर माध्यम पर अलग-थलग नहीं किया जा सकता है के लिए उपयुक्त नहीं है। कार्यप्रणाली भी वायरस-विशिष्ट प्रोटीन के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की उपलब्धता पर निर्भर है। हालांकि एकइस अध्ययन में nalysis खमीर और बैक्टीरिया के विभिन्न fluorescently टैग का प्रयोग करें, जैसे टेक्सास लाल, सूक्ष्म जीव विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के बीच अंतर आकार द्वारा बढ़ाया गया था सवाल में रोगाणुओं आकृति विज्ञान और आकार में समान होना चाहिए होगा एक प्रभावी कार्य के आसपास।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose BD 211584
Fungisel Agar Dot Scientific 7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar Troy Biologicals 7143B
Sheep blood agar Troy Biologicals 221239
Hela cells
1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate Corning 10-017-CM
Gentamicin 50 mg/ml Sigma 1397 50 µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x Corning 25-052-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150 10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG Thermo Scientific 34055
Ultra-Pure X gal Invitrogen 15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) Corning 20-021-CV
1x PBS Dot Scientific 30042-500
RIPA Lysis Life Technologies 89901
Staining
Methanol Fisher Scientific A433P-4
HSV 1&2, specific for gD ViroStat 196
DAPI SIGMA D8417-5MG
Gram Crystal Violet Troy Biologicals 212527
Supplies
Petri dish 100 x 15 Dot Scientific 229693 
Petri dish 150 x 15 Kord Valmark 2902
96-Well plates Evergreen Scientific 222-8030-01F
24-well plates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Culture tubes 100 x 13 Thomas Scientific 9187L61
Cover slip circles, 12 mm Deckglaser CB00120RA1

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संक्रमण अंक 113 polymicrobial biofilm दाद सिंप्लेक्स वायरस, पालन
जीवाणु और कवक द्वारा वायरस से संक्रमित कोशिकाओं पर Biofilm दीक्षा का निर्धारण
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Plotkin, B. J., Sigar, I. M.,More

Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).

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