Abstract
De studie van polymicrobiale interacties langsheen de taxonomische rijken die schimmels, bacteriën en virussen omvatten niet eerder onderzocht met betrekking tot hoe virale leden van de microbiome invloed daaropvolgende microbe interacties met dit virus geïnfecteerde gastheercellen. De co-bewoning virus met bacteriën en schimmels is hoofdzakelijk aanwezig op de mucosale oppervlakken van de orale holte en voortplantingsorganen. Slijmvliescellen, met name die met aanhoudende chronische of persistente latente virale infecties, kan een aanzienlijke invloed op de leden van de microbiome virusoverdracht verandering in aantal en type receptoren tot expressie gebracht hebben. Wijziging in gastheercelmembraan architectuur zou resulteren in veranderde vermogen van verdere leden van de normale flora en opportunistische pathogenen aan de eerste stap van biofilmvorming, dwz hechting initiëren. Deze studie beschrijft een methode voor kwantificering en visueel onderzoek van het effect HSV op de inleiding van biofilformatie m (therapietrouw) van S. aureus en C. albicans.
Introduction
De menselijke microbiome omvat diverse organismen uit meerdere taxonomische koninkrijken die geografische regio's in het lichaam te delen. Aanhankelijkheid aan celoppervlakken is een essentiële eerste stap in de vorming van biofilm, die deel uitmaakt van de microbiome kolonisatie proces. In de microbiome kunnen virussen die chronische en persistente infecties. De chronische cel infectie door deze virussen kunnen een verandering veroorzaken bij vermoedelijke beschikbaarheid receptor. 1,2 Daarnaast celinvoer door intracellulaire pathogenen kan ook van invloed zijn gastheer membraan vloeibaarheid / hydrofobiciteit die op hun beurt de bevestiging van andere leden microbiome, waaronder bacteriën en schimmels kunnen veranderen . Om de interacties die optreden tussen deze meerdere pathogenen die co-lokaliseren in dezelfde geografische gebieden van de menselijke gastheer begrijpen moeten we in staat om de interactie van ziekteverwekkers die het spectrum van taxonomische rijken bij het slijmvliesoppervlak vertegenwoordigen bestuderen.
t "> De Herpesviridae zijn een familie van microben in 100% van de mens als permanente leden van de microbiome 3,4. Bovendien kunnen ze ook voortdurend vergoten zowel in de aanwezigheid en afwezigheid van symptomen. Specifiek, herpes simplex virus-1 en herpes simplex virus 2 (HSV-1 en HSV-2, respectievelijk) permanent lid van de microbiome in de oronasopharynx en voortplantingsorganen. in immuuncompetente individuen, zowel HSV-1 en HSV-2 veroorzaken gingivostomatitis, alsmede genitale herpes 5-8. op deze sites HSV veroorzaakt een latente infectie wordt gekenmerkt door chronische persistente asymptomatische virale verspreiding 9. notitie van HSV in cellen leidt tot veranderingen in oppervlakte-expressie van nectins, heparansulfaat, rafts en herpesvirus ingang mediator / tumornecrose factor receptor (HVEM / TNFr) 10-25. Deze potentieel vertegenwoordigen gedeeld receptoren voor bacteriën en schimmels, bijvoorbeeld S. aureus en C. albicans, terwijl die opportunistische pathogenen,kan ook wonen als lid van de mucosale microbiome van de oronasopharynx 26,27. Binnen de oronasopharynx S. aureus en C. albicans bezetten twee verschillende locaties van de kolonisatie. In gastheren met natuurlijke tanden, is het mondslijmvlies gedeeld door HSV-1 en C. albicans, terwijl de voorste neus neusgaten bezet door S. 28 aureus. Ondanks het in vitro onderzoek dat S. aureus hecht aan mond epitheelcellen, 29,30 S. aureus is zelden geïsoleerd van orale monsters als normaal weefsel aanwezig 29,30 is. Er is weinig bekend met betrekking tot het genitaal co-kolonisatie niches buiten de klinische bevindingen dat S. aureus wordt geassocieerd met aerobe vaginitis, gekenmerkt door genitale ontsteking, ontlading en dyspareunie, terwijl C. albicans produceert mucosalaesies vergelijkbaar met dat in de mondholte 31-35. Dus, hoewel deze leden van de mondelinge en genitale Microbiome kruis taxonomische rijken weinig bekend over hun interactie het invloed hun vermogen om biofilmvorming te leiden tot hechting aan de gastheercel oppervlak 5. Dit protocol daadwerkelijk is toegepast op de functionele gevolgen van co-kolonisatie / infectie te bepalen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HSV Stammen en Handling
Opmerking: Recombinant niet-verspreiding van HSV-1 (KOS) gL86 en HSV-2 (KOS) 333gJ - met beta-galactosidase reporter-activiteit gebruikt werden verstrekt door V. Twiari 36,37.
- Gebruik virus van eenzelfde partij en bewaar bij -80 ° C met een 1: 1 verhouding van Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 20% foetaal runderserum (FBS) en magere melk tot gebruik. Voordat virale veel opslag bepalen virusconcentratie met o-nitrofenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) en 5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) assay.
- Bepalen virus levensvatbaarheid en multipliciteit van infectie (MOI) van X-Gal kleuring voor elke experimentele test run behulp reporter virusingang assay zoals eerder beschreven (figuur 1) 14.
- Verdunde virus (Opt-MEM) gewenste MOI. Fix monolagen (paraformaldehyde; 0,5 ml / putje) voor kleuring. Plaats virus levensvatbaarheid controles in een andere microtiter plaat parallel met polymicrobiële assay platen.
2. HeLa 299 Cell Handling
- Groeien bij 37 ° C, 5% CO2 in DMEM met 4,5 g / l glucose, 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), gentamicine (50 ug / ml) en L-glutamine. Passage cellen bij 80% confluentie met trypsine oplossing (ethyleendiaminetetra-azijnzuur, 0,53 M EDTA, 0,05% trypsine; 5 ml / fles).
3. C. albicans Handling
Opmerking: C. albicans verkregen uit een klinisch laboratorium bron wordt bewaard bij -80 ° C in Remmel taptemelk 2x medium.
- Cultuur bevroren voorraad op Sabouraud Dextrose Medium (37 ° C). Na 24 uur subcultuur de C. albicans op Fungisel medium (37 ° C, 48 uur) gebruikt.
- Genereer kiem buis (GT) vormen (pick representatieve koloniën, 3 ml FBS, 3 uur, 37 ° C, Abs 600, 0,3). Na incubatie, wassen GT (HBSS; 2x, 4000 XG). Voeg gewassen GT aan opgewarmd HBSS (37 &# 176; C; 0,32 Abs 600). GT formulieren 99% van de cellen waargenomen zoals bepaald door telling hemocytometer.
- Maak gistvorm (YF) stock suspensies door het oppakken vertegenwoordiger Fungisel kolonies (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs 600). Tel het aantal formulieren YF / ml microscopisch met behulp van een hemocytometer. YF formulieren 99% van de cellen waargenomen zoals bepaald door telling hemocytometer.
- Maak werken schimmel voorraad (250 ul van GT of YF voorraad in 25 ml HBSS; 37 ° C; 10 5 CFU / ml)
4. S. aureus Handling
- Store S. aureus ATCC 25.923 (-80 ° C; Remmel magere melk 2x). Cultuur op schapenbloed-agar (5%; 37 ° C, 24 uur). Pick representatieve koloniën en over te dragen aan zouten medium mannitol binnen 2 dagen voor de voorraad (37 ° C, 18 uur).
- Maak S. aureus voorraad suspensie (3 ml HBSS; 1,32 Abs 600; 10 8 CFU / ml)
- Het werken S. aureus voorraad (100 plvan de voorraad in 25 ml HBSS; 10 5 CFU / ml).
5. Candida en S. aureus Schorsingen
- Maak gemengde C. albicans en S. aureus suspensie (250 pl YF of GT voorraad en 100 ui S. aureus voorraad in 25 ml HBSS).
6. polymicrobiologische Biofilm Assay
- Zaad 96 putjes met 200 ui 2 x 10 5 HeLa cellen / ml (85% confluentie niveau). Rotsplaten (30 - 45 min, 37 ° C) voor incubatie (37 ° C, 5% CO2 incubator 18 uur). Wassen monolagen (1x, Opt-MEM) dan zaad met HSV (HSV-1 (KOS) gL86 of HSV-2 (KOS) 33 gJ - in 100 gl Opt-MEM, MOI 50 en 10). Incubeer de platen (3 uur; 37 ° C, 5% CO2). Gebruik slechts één virale stam per dag.
- Wassen geïnfecteerde monolagen (1x Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 2 Mg en Ca 2; 100 ui). Vervang PBS met warm HBSS verlaten van 25 & #181; l in elk putje.
- Voeg YF, GT en / of S. aureus werkende suspensies (100 ul, doelgroep tot cel verhouding = 5: 1; n = 16). zoals aangegeven in tabel 1 Incubeer de platen (statisch 30 min, 37 ° C, 5% CO2).
- Na incubatie, zuig één kolom tegelijk onmiddellijk navullen met 300 ul PBS met Mg 2 en Ca 2. Herhaal deze stap twee keer voeg dan radio-immunoprecipitatie assay lysisbuffer (RIPA; filter gesteriliseerd; 200 ui van een 1:50 verdunning).
- Snel vermaal de HeLa cellysaat plaats dan 50 gl op mannitol zouten (MS) en / of Fungisel (F) media (figuur 2). Spreid het lysaat met behulp van een glazen staaf gebogen in een hoek van 90 °. Incubeer de platen (18 uur bij 37 ° C). Handmatig tellen het aantal kolonies per plaat. Controles bestaan uit S. aureus en / of C. albicans naleving van HSV-niet-geïnfecteerde HeLa-cellen.
7. Imaging Studies </ P>
- Was elke ronde glazen dekglaasje (12 mm, 50 ml aceton in bekerglas van 100 ml). Droog en steriliseer dekglaasjes (Kimwipes; glas petrischaaltjes). Plaats droge steriele dekglaasjes in de putjes van steriele 24 wells platen met alcohol vlammen gesteriliseerde pincet.
- Voeg HeLa-cellen (1 ml, 5 x volume voor 96 putjes) aan de wells van 24 well platen bevattende de gewassen steriele ronde glazen dekglaasjes. Voeg het virus, bacteriën en schimmels volgens de template (tabel 2) aan 5x het volume voor de 96 well platen, vervolgens incubeer en zoals beschreven in de stappen 6.2.1 tot 6.4.
- Na de laatste wasbeurt, bevestig de cellen voor microscopie door overstromingen van de dia met methanol en te laten verdampen. Bewaar de platen bij RT tot kleuring.
- Voor helder veld microscopie (1000x finale oorspronkelijke vergroting) vult de putjes die-methanol gefixeerd dekglaasjes met gedemineraliseerd water. Onmiddellijk aspireren water. Bedek elk dekglaasje met Gram kristalviolet. Wash coverslips vrij van niet-gebonden vlek (gedemineraliseerd water). Droge dekglaasjes in situ dan houden ze met harde set montage medium om een label dia (figuur 3).
- Voor fluorescentie microscopie (100x objectief; 1000x laatste oorspronkelijke vergroting) coverslips vrij van methanol in wezen wassen zoals beschreven in stap 7.4. Droog de dekglaasjes in de putjes.
- Na het drogen, verwijder de dekglaasjes en plaats ze op het label dia's. voeg een voldoende 1:20 verdunning van fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd Herpes Simplex Virus type 1 + 2 gD antilichaam aan het dekglaasje dekking (1-5 ui).
- Incubeer de glaasjes in een vochtkamer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Na incubatie was de dekglaasjes in 4 veranderingen van PBS.
- Na de laatste wasbeurt, de terugkeer van de dekglaasje aan de gelabelde dia. Kleuren met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; vochtkamer; 37 ° C gedurende 30 min). Na incubatie was de dekglaasjes in 4 chanGES van PBS, vervolgens aan te brengen op de gelabelde dia met harde set montage medium.
- Laat het fixeermiddel uitharden gedurende 24 uur bij KT in het donker. Onderzoek de dekglaasjes onder olie doelstelling op ofwel een helder veld microscoop of fluorescentiemicroscoop met FITC en DAPI cutoff filters. Onderzoek Foto ten minste 50 gebieden (100 cellen per organisme minimum) voor co-lokalisatie (figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hoe betrouwbaar gegevens verkrijgbaar uit op dit rapport beschreven wordt getoond in figuur 2 af 38. Door het gebruik van dit systeem de modulatie op Staphylococcus en schimmel interactie met viraal geïnfecteerde cellen en hun effect op elkaars hechting kan worden afgebakend. Deze types van studies nodig microscopisch onderzoek van de interactie is getoond in figuren 3 en 4 38 om te bepalen of de polymicrobiële interactie plaatsvindt op dezelfde cellen. In deze studie differentiële celtelling interactie waargenomen als gevolg van HSV-modulatie op Staphylococcus en fungale hechting die virale soortspecifiek.
S. aureus en C. albicans (GT en YF) gehecht aan dezelfde HSV-geïnfecteerde HeLa controlecellen. Deze co-lokalisering op cellen wijst op een gebrek aan phys ical gevolgtrekking elkaars HeLa celadhesie en dat de gemeten differentiële hechting gemeten waren waarschijnlijk HSV gemedieerde (Figuur 3A, A1) 38. Echter, bij HSV-1 of HSV-2 geïnfecteerde HeLa-cellen geen co-lokalisatie van stafylokokken en C. albicans werd waargenomen. (Figuren 3B, B1, B2, B3, C1, C2). Middels fluorescentiemicroscopie (FITC-geconjugeerd anti-HSV-gD monoklonaal antilichaam) verder bevestigd dat S. aureus bleek niet samen te lokaliseren met C. albicans of HSV-1 of HSV-2 (Figuren 4A, A1, A2, A3, A4, B1, B2, B3). Deze samenwerking tussen HSV en Candida uitgebreid zowel gist en kiembuis vormen (figuren 2A-F) van C. albicans. Deze specificiteit van associatie tussen de triade van microben weerspiegelt de specificiteit van de kolonisatie gezien op een veel bredere schaal in de ontvangende oronasopharynx slijmvlies.
1 ">
Figuur 1. X-gal kleuring's dosisafhankelijke HSV-1 infectie in HeLa-cellen. HeLa-cellen geïnfecteerd met HSV-1 bij verschillende MOI en X-Gal bevlekt. (A) HeLa-cellen in putje van 96 goed plaat met X-Gal gekleurd mock-geïnfecteerde HeLa-cellen controle; 20x initiële vergroting; (B) HeLa-cellen in putje van 96 wells plaat met X-gal gekleurde HeLa cellen geïnfecteerd met HSV-1 bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 10; 20x initiële vergroting; (C) HeLa-cellen in putje van 96 wells plaat met X-gal gekleurde HeLa cellen geïnfecteerd met HSV-1 bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 50; 20x initiële vergroting; schaal bar geldt voor iedereen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
bestanden / ftp_upload / 54162 / 54162fig2.jpg "/>
Figuur 2. Effect van HSV-1 (kaders A, C, E) en HSV-2 (kaders B, D, F) bij veelvouden van infectie (MOI) van 50 en 10 op Hechting van S. aureus en / of C. albicans aan HeLa cellen. (A) S. aureus (Sa) binding aan HSV-1 geïnfecteerde cellen in de aanwezigheid van C. albicans kiem buizen (GT) of gist vormen (YF); (B) S. aureus (Sa) binding aan HSV-2 geïnfecteerde cellen in de aanwezigheid van C. albicans kiem buizen (GT) of gist vormen (YF); (C) C. albicans kiembuisjes (BT) binden aan HSV-1 geïnfecteerde cellen in de aanwezigheid van S. aureus (SA), (D) C. albicans kiembuisjes (GT) binding aan HSV-2 geïnfecteerde cellen in de aanwezigheid van S. aureus (SA); (E) C. albicans gistvormen (YF) binding aan HSV-1 geïnfecteerde cellen in de aanwezigheid van S. aureus (SA); (F) C. albicans gistvormen (YF) binding aan HSV-2 geïnfecteerde cellen in de aanwezigheid van S. aureus (SA). Alle datapunten zijn het gemiddelde +/- SEM, n = 16 genormaliseerd virusvrij control. * = Significant verschillend (p <0,05) van ongeïnfecteerde HeLa celcontrole. # = Significant verschillend (p <0,05) van gepaarde punt aangegeven met beugel; schaal bar van toepassing op alle. 38 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Gebrek aan S. aureus en C. albicans interacties op HSV-1 en HSV-2 geïnfecteerde HeLa-cellen. HSV-1 en HSV-2 infectie (MOI 50) HeLa celmonolagen met S. aureus en C. albicans (5: 1 tot doel cel). Voor helder veld microscopie, celmonolagen werden gekleurd met Gram's kristalviolet, vervolgens onderzocht door het licht microscopie. Cellen die Candida of S. positief waren aureus (100 individuele cellen per microbe signaal / per dekglaasje) werden secundair gescand op de aanwezigheid van extra microbe co-lokalisatie signalen (1000x aanvangsvergroting). (A en A1) S. aureus (SA) en C. albicans gistvormen (YF) of kiembuis formulieren (GT) co-lokaliseren op ongeïnfecteerde HeLa-cellen; (A2, plaatst). Procent van de HeLa-cellen met co-gelokaliseerde of individuele microben; (B - B3) Gebrek aan S.. aureus en C. albicans co-lokalisatie in aanwezigheid van HSV-1; (C - C2) Gebrek aan S. aureus en C. albicans co-lokalisatie in aanwezigheid van HSV-2. Mean ± SEM; schaal bar geldt voor alle. 38rGebruik = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Gebrek aan Co-localisatie van S. aureus met C. albicans HSV-1 of HSV-2 geïnfecteerde HeLa-cellen. HSV-geïnfecteerde HeLa celmonolagen prikkeling met S. aureus en C. albicans (5: 1 tot doel cel) gekleurd (FITC-geconjugeerd anti HSV-gD antilichaam en DAPI). Foto's zijn representatief voor de bevindingen van de screening van cellen die het signaal waren positief voor HSV vervolgens gescand op Candida en S. aureus (100 individuele cellen per microbe signaal per dekglaasje), die vervolgens secundair werden gescand op de aanwezigheid van extra microbe co-lokalisatie signalen (1000x aanvangsvergroting, Nikon). (A - A4) C. albicans (A2, insert; DAPI kleuring) co-lokaliseren met HSV-1; (B- B3) C. albicans co-gelokaliseerd met HSV-2 (B1, insert, C. albicans DAPI kleuring). Mean ± SEM; schaal bar van toepassing op alle. 38 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||||||
| tubes | GT | YF | MSSA | GT / MSSA | YF / MSSA | GT | YF | MSSA | GT / MSSA | YF / MSSA | ||||||
| MEDIA | F | F | MEVROUW | MEVROUW | F | MEVROUW | F | F | F | MEVROUW | MEVROUW | F | MEVROUW | F | ||
| EEN | ||||||||||||||||
| B | ||||||||||||||||
| C | ||||||||||||||||
| D | ||||||||||||||||
| E | ||||||||||||||||
| F | ||||||||||||||||
| G | ||||||||||||||||
| H | ||||||||||||||||
Tafel 1.
General Template Bepaling van Microbiële Adherence in polymicrobiologische Interacties GT = Candida albicans kiembuis fenotype.; YF = C. albicans gistvorm fenotype; MSSA = methicilline gevoelige Staphylococcus aureus; MS = mannitol zouten medium; F = Fungisel medium. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| plaat 1 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| alleen HeLa-cellen | HeLa + GT | HeLa + YF | HeLa + Sa | HeLa + GT + Sa | HeLa + YF + Sa | |
| EEN | ||||||
| B | ||||||
| C | ||||||
| D | ||||||
| plaat 2 | ||||||
| HSV | HeLa-cellen + HSV | HSV + HeLa + GT > | HSV + HeLa + YF | HSV + HeLa + Sa | HSV + HeLa + GT + Sa | HSV + HeLa + YF + Sa |
| EEN | ||||||
| B | ||||||
| C | ||||||
| D |
Tabel 2.
General Template voor Visuele Analyse van polymicrobiologische Interacties met HSV-geïnfecteerde en geïnfecteerde HeLa-cellen GT = Candida albicans kiembuis fenotype.; YF = C. albicans gistvorm fenotype; SA = methicilline gevoelige Staphylococcus aureus; HSV = herpes simplex virus.ve.com/files/ftp_upload/54162/54162table2.xlsx "target =" _ blank "> Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Momenteel is er geen informatie beschikbaar over complexe interacties tussen vaste semi-permanente leden van de ontvangende microbiome taxonomische die meerdere domeinen, dat wil zeggen, prokaryotische, eukaryotische en virale steken. Daarom ontwikkelden we een nieuw in vitro model systeem om biofilm initiatie door S. bestuderen aureus en C. albicans HSV-1 of HSV-2 geïnfecteerde HeLa 229 (HeLa) cellen 38. De HeLa cel modelsysteem presenteert een uniek voordeel. Dit is te wijten aan hun gebrek aan oppervlakte fibronectine-expressie, die dient als een receptor voor zowel S. aureus en C. albicans 39-41. Aangezien het apicale oppervlak 42 van mucosale epitheel normaal ontbreekt fibronectine, dit systeem beter nabootst die waargenomen bij natuurlijke infectie en kolonisatie 43-47. Zo zijn wij in staat om de rol van specifieke virale omzet binnenkomst receptor speelt in de daaropvolgende aanhechting meer rechtstreeks te onderzoeken door andere leden van de microbiome.
Via invoer bedreven zonder verspreiding HSV-1 en HSV-2, deze bevindingen blijkt dat celinvoer van HSV-1 of HSV-2 maakt cellen ongevoelig superinfectie met S. aureus, terwijl het verbeteren van C. albicans hechting in een virus concentratie afhankelijke wijze (Figuur 4). Interessant is dat de effecten van HSV-1 op GT vormen vs. YF, is het omgekeerde van die gemeten voor HSV-2, een bevinding die een significante invloed op bevordering van vaginale candidiasis in klinische presentaties 48-51 hebben. Vanuit een oogpunt pathogenese, wordt algemeen aangenomen dat de GT fenotype van C. albicans is de pathogene vorm, met de YF de commensale staat 51-54. Hechting van C. albicans GT die werden samen geïncubeerd met S. aureus vertoonden een veranderd bindingspatroon HSV-geïnfecteerde HeLa-cellen, in vergelijking met die gemeten YF - S. aureus bindend. HSV-1 verbeterde hechting van GT HeLa-cellen, maar een sigaanzienlijk moet mindere mate (p <0,05) dan die gemeten voor YF hechting, zoals hierboven besproken, namelijk 270% controle voor YF hechting en 190% controle GT hechting. Bovendien, terwijl S. aureus geen effect op HSV-1 versterking van GT binding had de coccus genegeerd de verbeterde hechting gemedieerd door de aanwezigheid van HSV-2. Het omgekeerde patroon werd waargenomen voor S. aureus effect op YF interactie met virus geïnfecteerde cellen. Deze voorliefde voor verschillende schimmels vormen van HSV-1 (YF) vs. HSV-2 (GT) kan een rol leiden van het onderhoud van de commensale staat te spelen in vivo. Met betrekking tot het effect van de GT formulier S. aureus binden, de GT bijna volledig afgeschaft het HSV-1 remming van staphylococcen hechting aan HeLa-cellen. Daarentegen, hoewel het vermogen van GT te associëren met HSV-2 geïnfecteerde cellen significant verhoogd in vergelijking met HSV-1, de aanwezigheid van S. aureus blokkeerde de HSV-2-gemedieerde toename van de therapietrouw.
S. blokkeren aureus-cel interactie, aangezien S. aureus gehecht uitsluitend ongeïnfecteerde HeLa-cellen. Verder microscopisch onderzoek van cellen blijkt dat Candida en HSV-1 en HSV-2 co-gelokaliseerd. Gebruikt samen hier de bevindingen van deze studie parallel de in vivo waarnemingen ter plaatse specificiteit voor kolonisatie met vermelding van het nut van dit model voor de studie van polymicrobiële interacties.
Effectief gebruik van de hierin beschreven protocol is afhankelijk van een aantal factoren. Ten eerste, het gebruik van verspreiding deficiënt virus. Dit maakt een schone examinatie van het effect virale binnenkomst en cell signaling heeft op latere microbe interacties, zonder de complicatie van veranderingen die als gevolg van omhullen-overname voorafgaand aan het verlaten van de cel kan optreden. Daarnaast is het gebruik van defecte virus zorgt voor een veiliger omgeving voor de afhandeling van bioveiligheid klasse twee Pathogens. Ten tweede is dit protocol maakt het gebruik van zowel virale en microben hechting varianten. Varianten gebruik die binden aan specifieke receptoren maakt afbakening gedeelde receptoren tussen microben, of anders de detectie van nieuwe receptoren. Door het gebruik van monoklonale antilichamen voor de receptoren, is het potentieel voor visualisatie van adhesine lokalisatie op de microbe oppervlak en verschaft een middel om adhesine veranderde expressie bestuderen. Dit protocol is niet geschikt voor de studie van microben die niet selectief kan worden geïsoleerd op differentiële medium. De methode is ook afhankelijk van de beschikbaarheid van monoklonale antilichamen tegen virus-specifieke proteïnen. Hoewel eenNALYSE in deze studie was door de grootte verschil tussen gist en bacteriën, het gebruik van differentieel fluorescent gelabeld, bijv Texas rood, microbe specifiek monoklonaal antilichaam zou een effectieve work-rond moet microben in kwestie qua morfologie en grootte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C.albicans | |||
| BBL Sabouraud Dextrose | BD | 211584 | |
| Fungisel Agar | Dot Scientific | 7205A | |
| S.aureus | |||
| Mannitol Salt Agar | Troy Biologicals | 7143B | |
| Sheep blood agar | Troy Biologicals | 221239 | |
| Hela cells | |||
| 1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CM | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Sigma | 1397 | 50 µg/ml final concentration in the complete DMEM |
| Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% final concentration in the complete DMEM |
| Other medium and reagents | |||
| ONPG | Thermo Scientific | 34055 | |
| Ultra-Pure X gal | Invitrogen | 15520-018 | |
| 1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) | Corning | 20-021-CV | |
| 1x PBS | Dot Scientific | 30042-500 | |
| RIPA Lysis | Life Technologies | 89901 | |
| Staining | |||
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| HSV 1&2, specific for gD | ViroStat | 196 | |
| DAPI | SIGMA | D8417-5MG | |
| Gram Crystal Violet | Troy Biologicals | 212527 | |
| Supplies | |||
| Petri dish 100 x 15 | Dot Scientific | 229693 | |
| Petri dish 150 x 15 | Kord Valmark | 2902 | |
| 96-Well plates | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | |
| 24-well plates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Culture tubes 100 x 13 | Thomas Scientific | 9187L61 | |
| Cover slip circles, 12 mm | Deckglaser | CB00120RA1 |
References
- Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
- Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
- Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
- Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
- Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
- Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
- Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
- Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
- Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
- Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
- Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
- Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
- Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
- Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
- Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
- Hauck, C. R. Cell adhesion receptors - signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
- Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
- Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
- Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
- Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, http://dx.doi.org/10.1016/j.expneurol.2006.04.026 461-469 (2006).
- Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
- Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
- National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
- Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
- Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
- Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
- Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
- Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
- Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
- Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
- Nenoff, P., et al. Mycology - an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
- Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
- Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. , (2016).
- Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. , (2014).
- Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, Suppl 4 400-403 (1987).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
- Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
- Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, (Pt 5) 569-581 (1997).
- Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
- Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, http://dx.doi.org/10.1016/j.matbio.2005.06.008 389-399 (2005).
- Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
- Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
- Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
- Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
- Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
- Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
- Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).
