Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bestemmelse av Biofilm Initiation på virusinfiserte celler av bakterier og sopp

Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54162
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Midwestern University

Abstract

Studiet av interaksjonene polymikrobielle på tvers av de taksonomiske riker som omfatter sopp, bakterier og virus er ikke tidligere blitt undersøkt med hensyn til hvordan virale medlemmer av mikrobiomer påvirke etterfølgende mikrobe interaksjoner med disse virus-infiserte vertsceller. Den ko-bolig virus med bakterier og sopp er hovedsakelig til stede på de mucosale overflater i munnhulen og kjønnsorgan. Slimhinneceller, spesielt de med vedvarende kronisk eller vedvarende latente virusinfeksjoner, kan ha en betydelig innvirkning på medlemmer av mikrobiomer gjennom virus endring i antall og type reseptorer uttrykt. Modifikasjon i vertscellemembran arkitektur ville resultere i endrede egenskaper av etterfølgende medlemmer av den normale flora og opportunistiske patogener for å initiere den første trinnet i biofilmdannelse, dvs. tilslutning. Denne studien beskriver en fremgangsmåte for kvantifisering og visuell undersøkelse av HSV virkning på initiering av biofilm dannelse (etterlevelse) av S. aureus og C. albicans.

Introduction

Den menneskelige mikrobiomer omfatter ulike organismer fra flere taksonomiske riker som deler geografiske regioner i kroppen. Overholdelse av celleoverflater er et viktig første skritt i biofilmdannelse, som er en del av mikrobiomer kolonisering prosessen. Inkludert i mikrobiomer kan være virus som forårsaker kroniske og vedvarende infeksjoner. Den kroniske celle infeksjon av disse virusene kan føre til en endring i antatte reseptor tilgjengelighet. 1,2 I tillegg er celleinntrengning via intracellulære patogener kan også påvirke vert membranfluiditet / hydrofobisitet som igjen kan forandre feste av andre mikrobiomer medlemmer, inklusive bakterier og sopp . For å forstå samspillet som kan oppstå mellom disse flere patogener som co-lokalisere i de samme geografiske områder av den menneskelige vert, må vi være i stand til å studere samspillet mellom patogener som representerer hele spekteret av taksonomiske riker tilstede på slimhinneoverflaten.

t "> The herpesvirus er en familie av mikrober som er tilstede i 100% av menneskene som faste medlemmer av mikrobiomer 3,4. I tillegg kan de også bli vedvarende felle både i nærvær og fravær av symptomer. Nærmere bestemt, herpes simplex virus-1 og herpes simplex virus-2 (HSV-1 og HSV-2, henholdsvis) er faste medlemmer av mikrobiomer i oronasopharynx og kjønnsorgan. i immun-kompetente individer, både HSV-1 og HSV-2 årsak gingivostomatitis, samt genital herpes 5-8. på disse områdene, fører til HSV en latent infeksjon preget av kronisk vedvarende asymptomatisk viral Shedding 9. oppføring av HSV i cellene resulterer i endringer i overflaten uttrykk for nectins, heparansulfat, lipid flåter og herpesvirus oppføring megler / tumor nekrose faktor reseptor (HVEM / TNFR) 10-25. Disse potensielt representerer felles reseptorer for noen bakterier og sopp, for eksempel S. aureus og C. albicans, som samtidig opportunistiske patogenerkan også ligge som medlemmer av slimhinne mikrobiomer av oronasopharynx 26,27. Innenfor oronasopharynx S. aureus og C. albicans okkupere to forskjellige områder av kolonisering. I verter med naturlige tenner, er den orale mucosa deles av HSV-1 og C. albicans, mens de fremre nese svelget er okkupert av S. aureus 28. Men til tross for in vitro funn som S. aureus holder munnen epitelceller, 29,30 S. aureus er sjelden isolert fra muntlige prøver da normalt vev er til stede 29,30. Lite er kjent om kjønnsorgan co-kolonisering nisjer utover de kliniske funn som S. aureus er forbundet med aerob vaginitt, karakterisert ved genital inflammasjon, utslipp og dyspareuni, mens C. albicans produserer slimhinnere lignende den som ble observert i munnhulen 31-35. Derfor, selv om disse medlemmene av den muntlige og genital microbiome kryss taksonomiske riker lite er kjent om deres interaksjon som det påvirker deres evne til å initiere biofilmdannelse gjennom tilslutning til vertscelleoverflaten 5. Denne protokollen har blitt effektivt brukt til å bestemme de funksjonelle konsekvensene av co-kolonisering / infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. HSV Stammer og håndtering

Merk: Rekombinant ikke-spredning HSV-1 (KOS) gL86 og HSV-2 (KOS) 333gJ - med beta-galaktosidase reporter aktivitet brukt ble gitt av V. Twiari 36,37.

  1. Bruk virus fra en enkelt masse og oppbevar ved -80 ° C ved et 1: 1 forhold av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 20% føtalt bovint serum (FBS) og skummet melk inntil bruk. Før viral masse lagring, bestemme viruskonsentrasjon av o-nitrofenyl-β-D-galaktopyranosid (ONPG) og 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-Gal) assay.
  2. Bestemme virus levedyktighet og multiplisitet av infeksjon (MOI) med X-gal farging for hver forsøksanalysekjøring ved hjelp av reporter virus adgang assay, som tidligere beskrevet (figur 1) 14.
  3. Fortynnet virus (Opt-MEM) til ønsket MOI. Fix monolag (paraformaldehyde 0,5 ml / brønn) før farging. Plasser virus levedyktighet kontroller i en egen microtiter plate parallelt med polymikrobielle analyseplater.

2. HeLa 299 Cell Håndtering

  1. Vokse ved 37 ° C, 5% CO2 i DMEM med 4,5 g / l glukose, 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), gentamicin (50 pg / ml) og L-glutamin. Passasje cellene ved 80% konfluens med Trypsin-oppløsning (etylendiamintetraeddiksyre, 0,53 M EDTA, 0,05% Trypsin; 5 ml / kolbe).

3. C. albicans Håndtering

Merk: C. albicans erholdt fra et klinisk laboratorium kilde blir lagret ved -80 ° C i skummet melk Remmel 2x medium.

  1. Kultur frosset lager på Sabouraud Dextrose-medium (37 ° C). Etter 24 timers subkultur C. albicans ut mot Fungisel medium (37 ° C, 48 timer) for bruk.
  2. Generer bakterie tube (GT) skjema (plukke representative kolonier, 3 ml FBS, 3 timer, 37 ° C, Abs 600, 0,3). Etter inkubasjon vaske GT (HBSS, 2x, 4000 xg). Legg vasket GT til varmet HBSS (37 &# 176; C; 0,32 Abs 600). GT former bør være 99% av celler observert som bestemt ved hemocytometer telling.
  3. Gjør gjær form (YF) massesuspensjoner ved å plukke representative Fungisel kolonier (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs 600). Tell antall YF skjemaer / ml mikroskopisk ved hjelp av en hemocytometer. YF former bør være 99% av celler observert som bestemt ved hemocytometer telling.
  4. Gjør arbeidssopp lager (250 mL av GT eller YF lager i 25 ml HBSS, 37 ° C, 10 5 CFU / ml)

4. S. aureus Håndtering

  1. Butikk S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel skummet melk 2x). Kultur på saueblodagar (5%; 37 ° C; 24 timer). Plukk representative kolonier og overføre til mannitol salter medium innen 2 dager for lager (37 ° C, 18 timer).
  2. Gjør S. aureus massesuspensjon (3 ml HBSS; 1,32 Abs 600; 10 8 CFU / ml)
    1. Gjør jobber S. aureus lager (100 plav bestanden i 25 ml HBSS; 10 5 CFU / ml).

5. Candida og S. aureus utestengelse

  1. Gjør blandet C. albicans og S. aureus suspensjon (250 pl YF eller GT lager og 100 ul S. aureus lager i 25 ml HBSS).

6. polymikrobielle Biofilm analysen

  1. Seed 96-brønners plater med 200 ul av 2 x 10 5 HeLa-celler / ml (85% konfluens nivå). Helleplater (30 - 45 min, 37 ° C) før inkubering (37 ° C; 5% CO2-inkubator; 18 hr). Vask monolag (1x, Opt-MEM) så er primær med HSV (HSV-1 (KOS) gL86 eller HSV-2 (KOS) 33 Bemerk at - i 100 ul Opt-MEM, MOI 50 og 10). Inkuber platene (3 timer; 37 ° C; 5% CO2). Bruk bare en viral belastning per dag.
  2. Vask infiserte monosjikt (1 x; fosfat-bufret saltvann (PBS) med Mg og Ca 2 2; 100 ul). Erstatt PBS med varm HBSS forlater 25 & #181; l i hver brønn.
    1. Legg YF, GT og / eller S. aureus arbeidssuspensjoner (100 ul; mål-til-celle-forhold = 5: 1; n = 16). som angitt i tabell 1 Inkuber skålene (statisk, 30 min, 37 ° C; 5% CO2).
  3. Etter inkubasjon aspirer en kolonne om gangen umiddelbart påfylling med 300 mL PBS med Mg 2 og Ca 2. Gjenta dette trinnet to ganger deretter legge til radio-immunoprecipitation analyselysebuffer (RIPA, filter sterilisert, 200 ul av en 1:50 fortynning).
  4. Hurtig triturer HeLa cellelysat deretter plassere 50 pl på mannitol salter (MS) og / eller Fungisel (F) media (figur 2). Spre lysatet ved hjelp av en glasstav bøyd i en 90 ° vinkel. Inkuber platene (18 timer ved 37 ° C). telle antall kolonier per plate manuelt. Kontrollene består av S. aureus og / eller C. albicans tilslutning til HSV-uinfiserte HeLa-celler.

7. Imaging Studies </ P>

  1. Vask hver runde dekkglass (12 mm, 50 ml aceton i 100 ml begerglass). Tørr og sterilisere Dekk (Kimwipes, glass petriskåler). Plasser tørre sterile dekkglass i brønnene av sterile 24 brønners plater med alkohol flamme sterilisert pinsett.
  2. Legg HeLa-celler (1 ml; 5 x volum anvendes for 96-brønners plater) til brønnene i 24 brønners plater inneholdende de vaskede sterile runde dekkglass. Tilsett virus, bakterier og sopp i henhold til malen (tabell 2) ved 5 x volumet som brukes for 96-brønners plater, og deretter inkuberes og fremgangsmåte som beskrevet i trinn 6.2.1 til 6.4 ovenfor.
  3. Etter den siste vask, fikser cellene for mikroskopi ved flom sleiden med metanol og lar den fordampe. Oppbevar platene ved RT før farging.
  4. For lyse felt mikroskopi (1,000x endelig opprinnelige forstørrelse) fylle brønnene inneholder metanolfiksDekk med avionisert vann. Umiddelbart aspirer vann. Dekk hver dekkglass med Grams krystallfiolett. Vask Dekk fri for ikke-bundet flekk (avionisert vann). Tørre Dekk in situ og deretter holder dem med hardt sett monteringsmedium til en merket lysbilde (figur 3).
  5. For fluorescerende mikroskopi (100x objektiv; 1,000x endelig opprinnelige forstørrelse) vask Dekk fri metanol vesentlige som beskrevet i trinn 7.4. Tørk glassene i brønnene.
    1. Etter tørking fjerne dekkglass og plassere dem på merket lysbilder. Deretter tilsettes en tilstrekkelig mengde 1:20 fortynning av fluorescein-isothiocyanat (FITC) -konjugert Herpes simplex virus type 1 og 2 gD-antistoff for å dekke dekkglass (1 - 5 ul).
    2. Inkuber glir i et fuktkammer ved 37 ° C i 30 minutter. Etter inkubering vaskes Dekkglass i 4 endringer i PBS.
    3. Etter den siste vask, returnerer dekkglass til den merkede lysbildet. Flekken med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, fuktighet kammeret; 37 ° C i 30 minutter). Etter inkubasjonen vaskes Dekk i 4 chanGES PBS, deretter feste til den merkede lysbildet med hardt sett monteringsmedium.
    4. Tillat monteringsmedium for å herde i 24 timer ved romtemperatur i mørket. Undersøk Dekk henhold olje objektiv på enten en lysfelt mikroskop eller fluorescerende mikroskop med FITC og DAPI cutoff filtre. Undersøke bilder av minst 50 felt (100 celler per organisme minimum) for samlokalisering (figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nivået av robustheten av data som kan oppnås fra systemet som er beskrevet i denne publikasjonen er vist i figur 2 af 38. Ved hjelp av dette systemet modulering av stafylokokk og sopp interaksjon med virusinfiserte celler og deres innvirkning på hverandre tilslutning kan være avgrenset. Disse typer studier krever mikroskopisk undersøkelse av interaksjonen som vist i figurene 3 og 4 38 for å bestemme hvorvidt en blandingsflora bestående interaksjonen skjer på de samme celler. I denne studien differensial celleinteraksjon er observert som et resultat av HSV-modulering av stafylokokker og sopp tilslutning som er virale artsspesifikk.

S. aureus og C. albicans (GT og YF) levd opp til de samme HSV-infiserte HeLa kontrollceller. Dette samlokalisering på celler indikerer en mangel på Phys ical slutning med hverandre HeLa cellene skulle vedhefte og at de målte nivåene av differensial tilslutning målte sannsynligvis var HSV-formidlet (figur 3A, A1) 38. Imidlertid ved HSV-1 eller HSV-2-infiserte HeLa-celler som ikke ko-lokalisering av stafylokokker og C. albicans ble observert. (Figurene 3B, B1, B2, B3, C1, C2). Ved hjelp av fluoriserende mikroskopi (FITC-konjugert anti-HSV-gD monoklonalt antistoff) videre bekreftet at S. aureus så ikke ut til å co-lokalisere med C. albicans eller HSV-1 eller HSV-2 (figurene 4A, A1, A2, A3, A4, B1, B2, B3). Dette samarbeidet mellom HSV og Candida utvidet til både gjær og bakterie tube former (figurene 2A-F) av C. albicans. Dette spesifisitet av sammenhengen mellom triaden av mikrober reflekterer det spesielle ved kolonisering sett på en mye bredere skala i verts oronasopharynx slimhinnen.

1 "> Figur 1
Figur 1. X-gal farging Bilder av Dosering Dependent HSV-1 infeksjon i HeLa-celler. HeLa-celler infisert med HSV-1 ved forskjellige MOI og X-Gal farget. (A) HeLa celler i godt over 96 godt plate med X-Gal farget mock-infiserte HeLa cellekontroll; 20x første forstørrelse; (B) HeLa-celler i brønn av 96-brønners plate med X-Gal farget HeLa celle infisert med HSV-1 ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 10; 20x første forstørrelse; (C) HeLa-celler i brønn av 96-brønners plate med X-Gal farget HeLa celle infisert med HSV-1 ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 50; 20x første forstørrelse; skala bar gjelder for alle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

filer / ftp_upload / 54162 / 54162fig2.jpg "/>
Figur 2. Effekt av HSV-1 (panelene A, C, E) og HSV-2 (panel B, D, F) ved multiplisiteter av infeksjon (MOI) på 50 og 10 på Adherens av S. aureus og / eller C. albicans til HeLa celler. (A) S. aureus (Sa) binding til HSV-1-infiserte celler i nærvær av C. albicans bakterie rør (GT) eller gjær former (YF); (B) S. aureus (Sa) binding til HSV-2-infiserte celler i nærvær av C. albicans bakterie rør (GT) eller gjær former (YF); (C) C. albicans bakterie rør (GT) som binder til HSV-1-infiserte celler i nærvær av S. aureus (Sa), (D) C. albicans bakterie rør (GT) som binder til HSV-2-infiserte celler i nærvær av S. aureus (Sa); (E) C. albicans gjær former (YF) som binder til HSV-1-infiserte celler i nærvær av S. aureus (Sa); (F) C. albicans gjær former (YF) som binder til HSV-2-infiserte celler i nærvær av S. aureus (Sa). Alle datapunktene er middelverdi +/- SEM, n = 16 normalisert til virus-fri kontroll. * = Signifikant forskjellig (p <0,05) fra uinfiserte HeLa cellekontroll. # = Signifikant forskjellige (p <0,05) fra sammenkoblet punkt indikert med klamme; skala bar gjelder for alle. 38 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Mangel på S. aureus og C. albicans Interaksjoner med HSV-1 og HSV-2-infiserte HeLa-celler. HSV-1 og HSV-2-infeksjon (MOI 50) HeLa-cellemonolagene med S. aureus og C. albicans (5: 1 til target celle). For lyse felt mikroskopi, ble cellemonolagene farget med Grams krystallfiolett, og deretter undersøkt ved hjelp av lysmikroskopi. Celler som var positive for Candida eller S. aureus (100 individuelle celler per mikrobe signal / per dekkglass) ble sekundært skannet for tilstedeværelsen av ytterligere mikrobe samlokalisering signaler (1,000x første forstørrelse). (A & A1) S. aureus (Sa) og C. albicans gjær former (YF) eller bakterie tube former (GT) co-lokalisere på uinfiserte HeLa-celler; (A2, sett). Prosent av HeLa celler med co-lokalisert eller individuelle mikrober; (B - B3) Manglende S.. aureus og C. albicans co-lokalisering i nærvær av HSV-1; (C - C2) Manglende S. aureus og C. albicans co-lokalisering i nærvær av HSV-2. Gjennomsnitt ± SEM; skala bar gjelder for alle. 38rFå = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Mangel på co-lokalisering av S. aureus med C. albicans på HSV-1 eller HSV-2-infiserte HeLa-celler. HSV-infiserte HeLa-cellemonolagene utfordring med S. aureus og C. albicans (5: 1 til target celle) farget (FITC-konjugert anti HSV gD-antistoff, og DAPI). Bilder er representative for funn fra screening av celler som var signal positivt for HSV deretter skannet for Candida og S. aureus (100 individuelle celler per mikrobe signal per dekkglass) som ble deretter sekundært skannet for tilstedeværelsen av ytterligere mikrobe samlokalisering signaler (1,000x første forstørrelse, og Nikon). (A - A4) C. albicans (A2, sette inn, DAPI flekker) co-lokalisere med HSV-1; (B- B3) C. albicans samlokalisert med HSV-2 (B1, sett inn, C. albicans DAPI flekker). Gjennomsnitt ± SEM; skala bar gjelder for alle. 38 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1 2 3 4 6 7 8 9 10 11 12
rør GT YF MSSA GT / MSSA YF / MSSA GT YF MSSA GT / MSSA YF / MSSA
MEDIA F F MS MS F MS F F F MS MS F MS F
EN
B
C
D
E
F
G
H

Tabell 1.
Generelt Mal Fastsettelse av Microbial Etterlevelse i polymikrobielle Interaksjoner GT = Candida albicans bakterie tube fenotype.; YF = C. albicans gjær skjema fenotype; MSSA = meticillin sensitive Staphylococcus aureus; MS = mannitol salter medium; F = Fungisel medium. Klikk her for å laste ned denne filen.

plate 1 1 2 3 4 5 6
bare HeLa-celler HeLa + GT HeLa + YF HeLa + Sa HeLa + GT + Sa HeLa + YF + Sa
EN
B
C
D
plate 2
HSV HeLa-celler + HSV HSV + HeLa + GT > HSV + HeLa + YF HSV + HeLa + Sa HSV + HeLa + GT + Sa HSV + HeLa + YF + Sa
EN
B
C
D

Tabell 2.
Generelt Mal for visuell analyse av polymikrobielle Interaksjoner med HSV-infiserte og ikke-infiserte HeLa celler GT = Candida albicans bakterie tube fenotype.; YF = C. albicans gjær skjema fenotype; SA = meticillin sensitive Staphylococcus aureus; HSV = herpes simplex virus.ve.com/files/ftp_upload/54162/54162table2.xlsx "target =" _ blank "> Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Foreløpig ingen informasjon er tilgjengelig på komplekse interaksjoner mellom permanent til semi-faste medlemmer av verts mikrobiomer som krysser flere taksonomiske domener, dvs. prokaryote, eukaryote og virale. Derfor utviklet vi en roman in vitro modellsystem for å studere biofilm initiering av S. aureus og C. albicans på HSV-1 eller HSV-2-infiserte HeLa-229 (HeLa celler) 38. Den HeLa cellemodellsystem presenterer en unik fordel. Dette er på grunn av deres mangel på overflaten fibronektin uttrykk, som fungerer som en reseptor for både S. aureus og C. albicans 39-41. Siden den apikale overflate 42 av mukosale epitel som normalt mangler fibronektin, dette system nærmere etterligner det som observeres i naturlig infeksjon og kolonisering 43-47. Dermed er vi i stand til mer direkte undersøke rollespesifikke viral oppføring reseptor omsetning spiller i påfølgende tilslutning av andre medlemmer av mikrobiomer.

Bruke entry dyktigere ikke-spredning HSV-1 og HSV-2, disse funnene viser at celle oppføring av HSV-1 eller HSV-2 gjengir celler ildfaste til super-infeksjon med S. aureus, og samtidig forbedre C. albicans tilslutning i et virus konsentrasjonsavhengig måte (figur 4). Interessant, effekten av HSV-1 på GT former vs YF, var det motsatte av det som ble målt for HSV-2, et funn som kan ha en betydelig innvirkning på markedsføring av vaginal candidiasis i kliniske presentasjoner 48-51. Fra et patogenese perspektiv, er det generelt akseptert at det GT fenotype av C. albicans er sykdomsfremkallende form, med YF den commensal staten 51-54. Overholdelse av C. albicans GT som ble co-inkubert med S. aureus viste et endret mønster av binding til HSV-infiserte HeLa-celler, sammenlignet med det som ble målt for YF - S. aureus bindende. HSV-1 forbedret adhesjon GT til HeLa-celler, men til en sigdelig mindre grad (p <0,05) enn den som ble målt for YF tilslutning, som omtalt ovenfor, dvs. 270% kontroll for YF tilslutning og 190% kontroll for GT tilslutning. I tillegg, mens S. aureus hadde ingen effekt på HSV-1 forbedring av GT binding coccus negerte den forbedrede tilslutning mediert ved nærvær av HSV-2. Det omvendte mønster ble observert for S. aureus effekt på YF interaksjon med virusinfiserte celler. Denne forkjærlighet for forskjellige soppformer av HSV-1 (YF) mot HSV-2 (GT) kan spille en rolle med å styre vedlikehold av kommensal tilstand in vivo. Med hensyn til virkningen av GT formen på S. aureus bindende, GT nesten fullstendig avskaffet HSV-1 hemming av stafylokokk tilslutning til HeLa-celler. I motsetning til dette, selv om muligheten for GT til å assosiere med HSV-2-infiserte celler ble betydelig forøket sammenlignet med HSV-1, tilstedeværelsen av S. aureus blokkerte HSV-2-mediert økning i tilslutning.

S. aureus-celle interaksjon, ettersom S. aureus levd utelukkende til uinfiserte HeLa-celler. Videre mikroskopisk undersøkelse av celler viser at Candida og HSV-1 og HSV-2 samlokalisert. Brukes sammen her funnene fra denne studien parallell in vivo observasjoner nettstedet spesifisitet for kolonisering indikerer nytten av denne modellen for studiet av polymikrobielle interaksjoner.

Effektiv bruk av protokollen som er beskrevet heri er avhengig av en rekke faktorer. Først, ved bruk av spredt mangelvirus. Dette gjør at en ren examinasjon av effekten viral oppføring og cellesignalisering har på etterfølgende mikrobe interaksjoner, uten komplikasjon av endringer som kan oppstå på grunn av innhylle-oppkjøpet før du forlater cellen. I tillegg er bruk av defekte virus muliggjør et sikrere miljø for håndtering av biosikkerhet klasse to patogener. For det andre gir denne protokoll for bruk av både virale og mikrobe adherens varianter. Bruk av varianter som bare binder seg til spesifikke reseptorer muliggjør avbildning av de delte reseptorer mellom mikrober, eller alternativt påvisning av nye reseptorer. Ved bruk av monoklonale antistoffer mot reseptorene, er det mulighet for visualisering av adhesin lokalisering på mikroben overflaten og et verktøy for å studere endret adhesin uttrykk. Denne protokollen er ikke egnet for studier av mikrober som ikke kan bli selektivt isolert på differensial medium. Metodikken er også avhengig av tilgjengeligheten av monoklonale antistoffer til virus-spesifikke proteiner. selv om ennalysis i denne studien ble forsterket av størrelsen forskjellen mellom gjær og bakterier, anvendelse av forskjellig fluorescerende merket, f.eks Texas rød, mikrobe spesifikt monoklonalt antistoff ville være en effektiv arbeids rundt bør mikrobene aktuelle være lik i morfologi og størrelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose BD 211584
Fungisel Agar Dot Scientific 7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar Troy Biologicals 7143B
Sheep blood agar Troy Biologicals 221239
Hela cells
1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate Corning 10-017-CM
Gentamicin 50 mg/ml Sigma 1397 50 µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x Corning 25-052-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150 10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG Thermo Scientific 34055
Ultra-Pure X gal Invitrogen 15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) Corning 20-021-CV
1x PBS Dot Scientific 30042-500
RIPA Lysis Life Technologies 89901
Staining
Methanol Fisher Scientific A433P-4
HSV 1&2, specific for gD ViroStat 196
DAPI SIGMA D8417-5MG
Gram Crystal Violet Troy Biologicals 212527
Supplies
Petri dish 100 x 15 Dot Scientific 229693 
Petri dish 150 x 15 Kord Valmark 2902
96-Well plates Evergreen Scientific 222-8030-01F
24-well plates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Culture tubes 100 x 13 Thomas Scientific 9187L61
Cover slip circles, 12 mm Deckglaser CB00120RA1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
  2. Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
  3. Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
  4. Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
  5. Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
  6. Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
  7. Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
  8. Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
  9. Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
  10. Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
  11. Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
  12. Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
  13. Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
  14. Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
  15. Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
  16. Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
  17. Hauck, C. R. Cell adhesion receptors - signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
  18. Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
  19. Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
  20. Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
  21. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
  22. Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
  23. Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, http://dx.doi.org/10.1016/j.expneurol.2006.04.026 461-469 (2006).
  24. Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
  25. Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
  26. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
  27. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
  28. Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
  29. Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
  30. Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
  31. Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
  32. Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
  33. Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
  34. Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
  35. Nenoff, P., et al. Mycology - an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
  36. Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
  37. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
  38. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. , (2016).
  39. Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. , (2014).
  40. Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, Suppl 4 400-403 (1987).
  41. Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
  42. Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
  43. Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, (Pt 5) 569-581 (1997).
  44. Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
  45. Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
  46. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, http://dx.doi.org/10.1016/j.matbio.2005.06.008 389-399 (2005).
  47. Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
  48. Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
  49. Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
  50. Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
  51. Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
  52. Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
  53. Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
  54. Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).

Tags

Infeksjon blandingsflora bestående biofilm herpes simplex virus, Etterlevelse
Bestemmelse av Biofilm Initiation på virusinfiserte celler av bakterier og sopp
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Plotkin, B. J., Sigar, I. M.,… More

Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter