Abstract
O estudo das interacções polimicrobianas através dos reinos taxonómicos que incluem fungos, bactérias e vírus não tenham sido previamente analisados no que diz respeito à forma como membros virais da microbiota afectar micróbio subsequentes com estas células hospedeiras infectadas pelo vírus. A co-habitação com o vírus de bactérias e fungos é principalmente presentes nas superfícies das mucosas da cavidade oral e do tracto genital. células da mucosa, particularmente aqueles com infecções virais latentes crónicas ou persistentes persistentes, poderia ter um impacto significativo sobre os membros do microbioma através da alteração vírus em número e tipo de receptores expressos. Modificação em arquitectura membrana celular do hospedeiro iria resultar em capacidade alterada dos membros posteriores da flora normal e patógenos oportunistas para iniciar o primeiro passo na formação de biofilme, ou seja, a adesão. Este estudo descreve um método para a quantificação e exame visual do efeito de HSV na iniciação de biofilm formação (aderência) do S. aureus e C. albicans.
Introduction
O microbioma humano inclui diversos organismos de vários reinos taxonômicos que compartilham regiões geográficas no corpo. Aderência a superfícies celulares é um primeiro passo essencial na formação de biofilme, que é parte do processo de microbioma colonização. Incluído no microbioma pode ser vírus que causam infecções crônicas e persistentes. A infecção crónica de células por estes vírus pode provocar uma alteração na disponibilidade de receptor putativo. 1,2 Além disso, a entrada celular por agentes patogénicos intracelulares podem também afectar a fluidez da membrana hospedeiro / hidrofobicidade, que por sua vez podem alterar a ligação de outros membros microbioma, incluindo bactérias e fungos . A fim de compreender as interações que podem ocorrer entre esses vários patógenos que co-localizam nas mesmas regiões geográficas do hospedeiro humano, devemos ser capazes de estudar a interação de agentes patogénicos que representam o espectro de reinos taxonômicos presentes na superfície da mucosa.
t "> O Herpesviridae é uma família de micróbios presentes em 100% dos seres humanos como membros permanentes da microbiota 3,4. Além disso, eles podem também ser persistentemente derramado ambos na presença e ausência de sintomas. Especificamente, o vírus herpes simplex-1 e vírus herpes simplex-2 (HSV-1 e HSV-2, respectivamente) são membros permanentes do microbioma na oronasopharynx e tracto genital. nos indivíduos imuno-competentes, ambos de HSV-1 e HSV-2 causa gengivoestomatites, bem como herpes genital 5-8. Nesses locais, HSV provoca uma infecção latente caracterizada por necrose tumoral crônica persistente assintomática viral derramamento 9. entrada de HSV em células resulta em alterações na expressão de superfície do nectins, sulfato de heparano, jangadas lipídicas e herpesvírus mediador de entrada / receptor do factor (HVEM / TNFr) 10-25. Estes receptores representam potencialmente partilhadas para algumas bactérias e fungos, por exemplo, S. aureus e C. albicans, enquanto que agentes patogénicos oportunistas,também pode residir como membros do microbioma da mucosa do oronasopharynx 26,27. Dentro do oronasopharynx S. aureus e C. albicans ocupar dois locais distintos de colonização. Em hospedeiros com os dentes naturais, a mucosa oral é partilhada por HSV-1 e C. albicans, enquanto as narinas nasais anteriores são ocupados por S. aureus 28. No entanto, apesar achados in vitro que S. aureus adere às células epiteliais bucais, 29,30 S. aureus é pouco isolado a partir de amostras orais quando o tecido normal está presente 29,30. Pouco se sabe a respeito genitais nichos co-colonização do trato além dos achados clínicos que S. aureus está associada com vaginite aeróbica, caracterizada por genital inflamação, descarga e dispareunia, enquanto C. albicans produz lesões nas mucosas semelhantes ao observado na cavidade oral 31-35. Assim, embora estes membros da Microbi oral e genitalome reinos taxonômicos transversais pouco se sabe sobre a sua interação como ele afeta a sua capacidade de iniciar a formação de biofilme através da adesão à superfície da célula hospedeira 5. Este protocolo tem sido efetivamente aplicada para determinar as consequências funcionais de co-colonização / infecção.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HSV Cepas e Manuseamento
Nota: recombinante não-invasiva de HSV-1 (KOS) gL86 e HSV-2 (KOS) 333gJ - com actividade repórter de beta-galactosidase utilizados foram fornecidos por V. Twiari 36,37.
- Use vírus a partir de um único lote e armazenar a -80 ° C a uma razão de 1: 1 de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com soro de bovino fetal a 20% (FBS) e leite desnatado até à sua utilização. Antes do armazenamento lote viral, determinar a concentração de vírus de o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido de ensaio (X-Gal).
- Determinar a viabilidade do vírus e a multiplicidade de infecção (MOI) por coloração X-Gal para cada ensaio experimental, utilizando um ensaio de entrada de vírus repórter, tal como anteriormente descrito (Figura 1) 14.
- Diluir vírus (Opt-MEM) para MOI desejada. Fix monocamadas (paraformaldeído; 0,5 ml / cavidade) antes da coloração. Colocar controles de viabilidade vírus em um microti separadaplaca ter em paralelo com placas de ensaio polimicrobianas.
2. HeLa 299 Manipulação celular
- Crescer a 37 ° C, 5% de CO 2 em meio DMEM com 4,5 g / L de glucose, 10% inactivado por calor soro fetal de bovino (FBS), gentamicina (50 ug / ml) e L-glutamina. células de passagem em 80% de confluência com uma solução de tripsina (ácido etilenodiaminotetra-acético, 0,53 M de EDTA; 0,05% de tripsina; 5 ml / frasco).
3. C. Manuseamento albicans
Nota: C. albicans obtidas a partir de uma fonte de laboratório clínico é armazenado a -80 ° C em 2x Remmel leite desnatado forma.
- Cultura congelada estoque em Sabouraud Dextrose médio (37 ° C). Após 24 h a subcultura C. albicans em meio Fungisel (37 ° C; 48 h) durante a utilização.
- Gerar tubo germinativo (GT) formas (escolher colónias representativos; 3 ml FBS; 3 horas; 37 ° C; Abs 600, 0,3). Após incubação, lava-GT (HBSS; 2x; 4000 xg). Adicionar GT lavada com HBSS aquecido (37 &# 176; C; 0,32 Abs 600). formas GT deve ser de 99% de células observadas como determinado pela contagem de hemocitómetro.
- Faça suspensões forma de levedura (FA) de ações, escolhendo colônias Fungisel representativos (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs 600). Contar o número de formas de YF / ml microscopicamente usando um hemocitômetro. formas de YF deve ser de 99% de células observadas como determinado pela contagem de hemocitómetro.
- Tornar o trabalho estoque fúngica (250 mL de GT ou estoque YF em 25 ml HBSS; 37 ° C; 10 5 UFC / ml)
4. S. Manuseamento aureus
- Loja S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel desnatado 2x leite). Cultura em agar de sangue de ovelha (5%; 37 ° C; 24 h). Escolha colónias representativos e transferir de mannitol sais médio prazo de 2 dias para estoque (37 ° C; 18 h).
- Faça S. aureus suspensão de ações (3 ml HBSS; 1,32 Abs 600; 10 8 UFC / ml)
- Tornar o trabalho S. Stock aureus (100 uldo estoque em 25 ml HBSS; 10 5 CFU / ml).
5. Candida e S. aureus Suspensões
- Faça misto C. albicans e S. suspensão aureus (250 mL YF ou estoque GT e 100 ul da S. aureus em 25 ml HBSS).
6. polimicrobiana biofilme Assay
- Semente de placas de 96 poços com 200 ul de 2 x 10 5 células HeLa / ml (nível de confluência de 85%). Placas de rocha (30 - 45 min; 37 ° C) antes da incubação (37 ° C; 5% de CO2; 18 h). Monocamadas de lavagem (1x; Opt-MEM), em seguida, semente com HSV (HSV-1 (KOS) gL86 ou HSV-2 (KOS) 33 GJ - em 100 ul Opt-MEM; MOI 50 e 10). Incubar as placas (3 h; 37 ° C; 5% de CO 2). Use apenas uma estirpe viral por dia.
- Lavar as monocamadas infectadas (1x; salina tamponada com fosfato (PBS) com Mg e Ca 2 2; 100 ul). Substitua PBS com HBSS quente deixando 25 & #181; L em cada poço.
- Adicionar YF, GT e / ou S. aureus suspensões de trabalho (100 ul; a proporção de células-alvo = 5: 1; n = 16). tal como indicado na Tabela 1 Incubar as placas (estáticos; 30 min; 37 ° C; 5% de CO 2).
- Após a incubação, aspirado de uma coluna de cada vez imediatamente reenchimento com 300 ul de PBS com 2 Mg e Ca + 2. Repetir este passo duas vezes e depois adicionar radio-imunoprecipitação tampão de ensaio de lise (RIPA; esterilizado por filtração; 200 ul de uma diluição de 1:50).
- Rapidamente triturar o ligado de células HeLa, em seguida, colocar 50 ul em sais de manitol (MS) e media / ou Fungisel (F) (Figura 2). Espalhe o lisado utilizando uma vareta de vidro dobrada a um ângulo de 90 °. Incubar as placas (18 hr a 37 ° C). contar manualmente o número de colónias por placa. Os controlos consistem em S. aureus e / ou C. albicans adesão a células HeLa HSV-não infectadas.
7. Estudos Imaging </ P>
- Lave cada lamela de vidro redonda (12 mm; 50 ml de acetona em 100 ml copo). lamelas secar e esterilizar (Kimwipes; placas de petri de vidro). Coloque lamelas estéreis secas nas cavidades da estéreis placas de 24 poços com álcool de chama fórceps esterilizados.
- Adicionar células HeLa (1 ml; volume de 5x usado para placas de 96 poços) para os poços de placas de 24 poços contendo as lamelas de vidro redondas esterilizadas lavadas. Adicionar o vírus, bactérias e fungos de acordo com o modelo (Tabela 2) em 5x o volume utilizado para as placas de 96 poços, depois incubar e processo, tal como descrito nos passos 6.2.1 a 6.4 acima.
- Após a lavagem final, fixar as células para microscopia inundando o diapositivo com metanol e deixando-se evaporar. Armazenar as placas à temperatura ambiente até a coloração.
- Para a microscopia de campo claro (1.000x última ampliação original) encher os poços contendo lamelas fixo-metanol com água deionizada. Imediatamente aspirar água. Cubra cada lamela com Grams cristal violeta. Wash lamelas livre mancha não ligada (água deionizada). Lamelas secas in situ, em seguida, aderir-los com um conjunto de dureza média a um slide marcado de montagem (Figura 3).
- Para a microscopia (objetiva de 100x; 1.000x original final ampliação) fluorescente lavagem lamelas livre de metanol essencialmente como descrito no passo 7.4. Secam-se as lamelas nos poços.
- Após a secagem, remover as lamelas e colocá-los em lâminas marcadas. Em seguida, adicionar uma quantidade suficiente de diluição de 1:20 de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated vírus herpes simplex tipo 1 + 2 gD anticorpo para cobrir a lamela (1-5 ul).
- Incubar as lâminas numa câmara de humidade a 37 ° C durante 30 min. Após a incubação, lavar as lamelas em 4 mudanças de PBS.
- Após a lavagem final, voltar a lamela ao slide marcado. Mancha com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; câmara de humidade; 37 ° C durante 30 min). Após a incubação, lavar as lamelas em 4 changes de PBS, em seguida, apor ao slide marcado com jogo duro meio de montagem.
- Permitir que o meio de montagem a curar durante 24 horas à TA no escuro. Examine as lamelas no âmbito do objectivo de óleo em cada um microscópio de campo claro ou um microscópio fluorescente com filtros de corte FITC e DAPI. Examinar imagens de pelo menos 50 campos (100 células por mínimos organismo) para co-localização (Figura 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O nível de robustez dos dados que podem ser obtidos a partir do sistema descrito neste relatório é mostrado na Figura 2 AF 38. Através da utilização deste sistema a modulação da interacção de estafilococos e fungos com células viralmente infectadas e o seu efeito sobre a adesão de cada um pode ser delineado. Estes tipos de estudos requerem um exame microscópico da interacção, como mostrado nas Figuras 3 e 4 38, a fim de determinar se a interacção polimicrobiana ocorre nas mesmas células. Neste estudo de interacção célula diferencial é observado como um resultado do HSV-modulação da adesão de estafilococos e fúngica que é específico de espécies virais.
S. aureus e C. albicans (GT e YF) aderido às mesmas células de controlo não infectadas por HSV-HeLa. Esta co-localização com células indica uma falta de Phys inferência iCal com a adesão de células do outro HeLa e que os níveis medidos de adesão diferencial medida era provável HSV-mediada (Figura 3A, A1) 38. No entanto, após o HSV-1 ou HSV-2 infectadas células HeLa não co-localização de estafilococos e C. Observou albicans. (Figuras 3B, B1, B2, B3, C1, C2). Utilizando microscopia de fluorescência (FITC-conjugado anti-HSV gD-anticorpo monoclonal) confirmaram ainda que S. aureus não pareceu co-localizam com C. albicans nem de HSV-1 ou HSV-2 (Figuras 4A, A1, A2, A3, A4, B1, B2, B3). Esta cooperação entre o HSV e Candida estendido para ambas levedura e germinais formas tubo (Figura 2A-F) de C. albicans. Esta especificidade de associação entre a tríade de micróbios reflete a especificidade da colonização visto em uma escala muito mais ampla na mucosa oronasopharynx host.
1 ">
Figura 1. Coloração com X-gal Imagens de Dosagem Dependente de HSV-1 de infecção em células HeLa. As células HeLa infectadas com o HSV-1 em diferentes MOI e de X-Gal coradas. (A) células HeLa em poço de placa de 96 poços com X-Gal controlo de células HeLa falsamente infectadas coradas; Ampliação de 20x inicial; (B) células HeLa em poço de placa de 96 poços com células HeLa X-Gal corado infectados com HSV-1 a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10; Ampliação de 20x inicial; Células (C) HeLa em poço de placa de 96 poços com células HeLa X-Gal corado infectados com HSV-1 a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 50; Ampliação de 20x inicial; barra de escala aplica-se a todos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
files / ftp_upload / 54162 / 54162fig2.jpg "/>
Figura 2. Efeito de HSV-1 (pains A, C, E) e o HSV-2 (painéis B, D, F) a multiplicidades de infecção (MOI) de 50 e 10 na adesão de S. aureus e / ou C. albicans a células HeLa. (A) S. aureus (Sa) ligação a HSV-1 de células infectadas na presença de C. tubos albicans germinativas (GT) ou formas de levedura (FA); (B) S. aureus (Sa) para ligação de HSV-2 de células infectadas na presença de C. tubos albicans germinativas (GT) ou formas de levedura (FA); (C) C. albicans tubos germinais (GT) que se ligam a HSV-1 em células infectadas na presença de S. aureus (Sa); (D) C. albicans tubos germinais (GT) que se ligam a 2 HSV-células infectadas na presença de S. aureus (Sa); (E) C. albicans formas de levedura (YF) que se ligam a HSV-1 em células infectadas na presença de S. aureus (Sa); (F) C. albicans formas de levedura (YF) que se ligam a 2 HSV-células infectadas na presença de S. aureus (Sa). Todos os pontos de dados são a média +/- SEM, n = 16 normalizados para controlo livre de vírus. * = Significativamente diferente (p <0,05) de controlo de células HeLa não infectadas. # = Significativamente diferente (p <0,05) do ponto emparelhado indicado pelo suporte; barra de escala aplica-se a todos. 38 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A falta de S. aureus e C. Interacções albicans em HSV-1 e HSV-2 infectaram células HeLa. As monocamadas de células HeLa de HSV-1 e HSV-2 infectadas (MOI 50) com S. aureus e C. albicans (5: 1 alvo a célula). Para o campo brilhante microscopia, as monocamadas de células foram coradas com violeta de cristal de Gram, em seguida, examinadas por microscopia de luz. As células que eram positivas para Candida ou S. aureus (100 células individuais por cada sinal de micróbio / por lamela) foram secundariamente verificados quanto à presença de sinais co-localização micróbio adicionais (1.000X ampliação inicial). (A & A1) S. aureus (Sa) e C. formas albicans levedura (FA) ou formas tubo germinativo (GT) co-localizam em células HeLa não infectadas; (A2, insira). Por cento das células HeLa com co-localizado ou individuais micróbios; (B - B3) Falta de S.. aureus e C. albicans co-localização, na presença do HSV-1; (C - C2) Falta de S. aureus e C. albicans co-localização, na presença do HSV-2. Média ± SEM; barra de escala aplica-se a todos os 38.rget = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Falta de Co-localização de S. aureus com C. albicans em HSV-1 ou HSV-2 infectaram células HeLa. HSV-HeLa infectadas monocamadas de células desafio com S. aureus e C. albicans (5: 1 para células alvo) corado (anticorpo anti gD de HSV conjugado com FITC, e DAPI). Pictures são representativos dos resultados do rastreio de células que eram sinal positivo para HSV varredura então para Candida e S. aureus (100 células individuais por cada sinal de micróbios por lamela) que foram em seguida secundariamente verificados quanto à presença de sinais co-localização micróbio adicionais (1.000x de ampliação iniciais; Nikon). (A - A4) C. albicans (A2, inserção; coloração DAPI) co-localizam com HSV-1; (B- B3) C. co-localizada com o HSV-2 (B1, inserção, C. albicans coloração DAPI) albicans. Média ± SEM; barra de escala aplica-se a todos. 38 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||||||
| Tubes | GT | YF | MSSA | GT / MSSA | YF / MSSA | GT | YF | MSSA | GT / MSSA | YF / MSSA | ||||||
| MEIOS DE COMUNICAÇÃO | F | F | SENHORA | SENHORA | F | SENHORA | F | F | F | SENHORA | SENHORA | F | SENHORA | F | ||
| UMA | ||||||||||||||||
| B | ||||||||||||||||
| C | ||||||||||||||||
| D | ||||||||||||||||
| E | ||||||||||||||||
| F | ||||||||||||||||
| G | ||||||||||||||||
| H | ||||||||||||||||
Tabela 1.
Determinação Template Geral da Microbial adesão em polimicrobianas Interações GT = Candida albicans tubo germinativo fenótipo.; YF = C. albicans forma de levedura fenótipo; MSSA = meticilina Staphylococcus aureus sensíveis; MS = sais de manitol médio; F = Fungisel médio. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
| placa 1 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Apenas as células HeLa | HeLa + GT | HeLa + YF | HeLa + Sa | HeLa + GT + Sa | HeLa + YF + Sa | |
| UMA | ||||||
| B | ||||||
| C | ||||||
| D | ||||||
| placa 2 | ||||||
| HSV | células HeLa + HSV | HSV + HeLa + GT > | HSV + HeLa + YF | HSV + HeLa + Sa | HSV + HeLa + GT + Sa | HSV + HeLa + YF + Sa |
| UMA | ||||||
| B | ||||||
| C | ||||||
| D |
Mesa 2.
Modelo Geral de Análise Visual de polimicrobianas interações com células HSV-infectados e não infectados HeLa GT = Candida albicans tubo germinativo fenótipo.; YF = C. albicans forma de levedura fenótipo; SA = meticilina sensíveis Staphylococcus aureus; HSV = vírus herpes simplex.ve.com/files/ftp_upload/54162/54162table2.xlsx "target =" _ blank "> Clique aqui para baixar esse arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Actualmente não há informações disponíveis sobre as interacções complexas entre permanente aos membros semi-permanentes do microbioma acolhimento que atravessam vários domínios taxonómico, ou seja, procariotas, eucariotas e virais. Por isso, desenvolvemos um romance no sistema de modelo in vitro para estudar a iniciação biofilme por S. aureus e C. albicans em HSV-1 ou HSV-2 infectadas células HeLa (HeLa 229) 38. O sistema modelo de células HeLa apresenta uma vantagem única. Isto é devido à sua falta de expressão superficial de fibronectina, que serve como um receptor para ambos S. aureus e C. albicans 39-41. Uma vez que a 42 superfície apical do epitélio das mucosas, normalmente carece de fibronectina, este sistema imita mais de perto a observada na infecção natural e colonização 43-47. Assim, somos capazes de examinar mais diretamente as jogadas volume de negócios receptor de entrada viral específicos papel na adesão posterior de outros membros do microbioma.
Usando proficiente entrada não-propagação de HSV-1 e HSV-2, esses resultados mostram que a entrada na célula de HSV-1 ou HSV-2 torna as células refractários para a super-infecção com S. aureus, reforçando simultaneamente a C. albicans adesão de um modo dependente da concentração de vírus (Figura 4). Curiosamente, os efeitos de HSV-1 em formas GT comparada YF, foi o inverso do que a medida para o HSV-2, uma descoberta que pode ter um impacto significativo na promoção da candidiase vaginal em apresentações clínicas 48-51. De uma perspectiva patogénese, é geralmente aceite que o fenótipo de GT C. albicans é a forma patogênica, com o YF o estado commensal 51-54. A adesão de C. albicans GT que foram co-incubadas com S. aureus mostrou um padrão alterado de se ligar a células HeLa infectadas pelo HSV, quando comparado com o medido para YF - S. vinculativo aureus. HSV-1 melhorada aderência de GT para células HeLa, mas a um sigficativamente menor grau (p <0,05) do que o medido para aderência YF, como discutido acima, isto é, 270% de controlo da adesão para a FA e o controlo de 190% para a adesão GT. Além disso, enquanto que S. aureus não teve efeito sobre o HSV-1 reforço da ligação GT, o coccus negada a um aumento da adesão mediada pela presença de HSV-2. O padrão inverso foi observado para S. efeito aureus na interação YF com células infectadas por vírus. Esta predilecção para diferentes formas de fungos por HSV-1 (YF) contra o HSV-2 (GT) podem desempenhar um papel gerir a manutenção do estado comensais in vivo. No que diz respeito ao efeito da forma GT na S. ligação aureus, o GT aboliu quase completamente a inibição do HSV-1 de adesão a células HeLa estafilocócica. Em contraste, embora a capacidade de se associar com GT 2 HSV-células infectadas foi significativamente aumentada em comparação com HSV-1, a presença de S. aureus bloqueou o aumento mediado por HSV-2 em aderência.
S. aureus -cell interação, uma vez que S. aureus adere unicamente para as células HeLa não infectadas. Além disso, o exame microscópico das células mostram que a Cândida e o HSV-1 e HSV-2 co-localizado. Usados em conjunto aqui os resultados deste estudo paralelo in vivo observações site de especificidade para a colonização indicando a utilidade deste modelo para o estudo das interações polimicrobianas.
A utilização eficaz do protocolo aqui descrito é dependente de uma variedade de factores. Em primeiro lugar, o uso da propagação do vírus deficiente. Isso permite que um Examina limpação da sinalização de entrada e de células viral tem efeito sobre micróbio posteriores, sem a complicação de mudanças que podem ocorrer devido a envolver-aquisição antes de sair da célula. Além disso, a utilização de um vírus defeituoso permite um ambiente mais seguro para o tratamento da classe Segurança Biológica Dois agentes patogénicos. Em segundo lugar, este protocolo permite o uso de ambas as variantes virais de adesão e de micróbios. Utilização de variantes que só se ligam a receptores específicos permite a delineação dos receptores partilhados entre os micróbios, ou, alternativamente, a detecção de novos receptores. Através da utilização de anticorpos monoclonais para os receptores, existe o potencial para a visualização de adesina localização na superfície do micróbio e fornece uma ferramenta para estudar a expressão alterada de adesina. Este protocolo não é apropriado para o estudo dos micróbios que não pode ser isolado selectivamente em meio diferencial. A metodologia é também dependente da disponibilidade do anticorpo monoclonal para as proteínas específicas do vírus. embora umnálise neste estudo foi reforçada por diferencial de tamanho entre leveduras e bactérias, o uso de diferencialmente fluorescentemente marcado, por exemplo, vermelho Texas, anticorpo monoclonal específico micróbio seria uma forma eficaz de contornar deve os micróbios em questão ser semelhantes na morfologia e tamanho.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C.albicans | |||
| BBL Sabouraud Dextrose | BD | 211584 | |
| Fungisel Agar | Dot Scientific | 7205A | |
| S.aureus | |||
| Mannitol Salt Agar | Troy Biologicals | 7143B | |
| Sheep blood agar | Troy Biologicals | 221239 | |
| Hela cells | |||
| 1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CM | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Sigma | 1397 | 50 µg/ml final concentration in the complete DMEM |
| Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% final concentration in the complete DMEM |
| Other medium and reagents | |||
| ONPG | Thermo Scientific | 34055 | |
| Ultra-Pure X gal | Invitrogen | 15520-018 | |
| 1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) | Corning | 20-021-CV | |
| 1x PBS | Dot Scientific | 30042-500 | |
| RIPA Lysis | Life Technologies | 89901 | |
| Staining | |||
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| HSV 1&2, specific for gD | ViroStat | 196 | |
| DAPI | SIGMA | D8417-5MG | |
| Gram Crystal Violet | Troy Biologicals | 212527 | |
| Supplies | |||
| Petri dish 100 x 15 | Dot Scientific | 229693 | |
| Petri dish 150 x 15 | Kord Valmark | 2902 | |
| 96-Well plates | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | |
| 24-well plates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Culture tubes 100 x 13 | Thomas Scientific | 9187L61 | |
| Cover slip circles, 12 mm | Deckglaser | CB00120RA1 |
References
- Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
- Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
- Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
- Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
- Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
- Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
- Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
- Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
- Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
- Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
- Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
- Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
- Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
- Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
- Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
- Hauck, C. R. Cell adhesion receptors - signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
- Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
- Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
- Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
- Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, http://dx.doi.org/10.1016/j.expneurol.2006.04.026 461-469 (2006).
- Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
- Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
- National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
- Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
- Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
- Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
- Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
- Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
- Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
- Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
- Nenoff, P., et al. Mycology - an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
- Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
- Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. , (2016).
- Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. , (2014).
- Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, Suppl 4 400-403 (1987).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
- Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
- Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, (Pt 5) 569-581 (1997).
- Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
- Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, http://dx.doi.org/10.1016/j.matbio.2005.06.008 389-399 (2005).
- Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
- Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
- Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
- Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
- Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
- Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
- Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).
