Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Détermination de biofilm Initiation sur les cellules infectées par le virus par les bactéries et les champignons

doi: 10.3791/54162 Published: July 6, 2016

Abstract

L'étude des interactions polymicrobienne à travers les royaumes taxonomiques qui incluent les champignons, les bactéries et les virus n'ont pas été examinés précédemment en ce qui concerne la façon dont les membres virales du microbiome affectent les interactions microbiennes ultérieures avec ces cellules hôtes infectées par le virus. La cohabitation de virus avec des bactéries et des champignons est principalement présent sur les surfaces muqueuses de la cavité buccale et du tractus génital. les cellules des muqueuses, en particulier ceux avec des infections virales latentes chroniques ou persistantes persistants, pourraient avoir un impact significatif sur les membres du microbiome par altération du virus en nombre et le type de récepteurs exprimés. La modification de l'architecture de la membrane de la cellule hôte entraînerait une capacité altérée de nouveaux membres de la flore normale et des agents pathogènes opportunistes pour initier la première étape dans la formation de biofilm, à savoir l' adhérence. Cette étude décrit une méthode pour la quantification et l'examen visuel de l'effet de HSV sur l'ouverture de BIOFILla formation de m (d'adhésion) de S. aureus et C. albicans.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Le microbiome humain comprend divers organismes provenant de plusieurs royaumes taxonomiques qui partagent des régions géographiques dans le corps. L'adhésion à la surface des cellules est une première étape essentielle dans la formation de biofilm, qui fait partie du processus de colonisation microbiome. Inclus dans le microbiome peuvent être des virus qui causent des infections chroniques et persistantes. L'infection chronique des cellules par ces virus peut provoquer une altération de la disponibilité du récepteur putatif. 1,2 En outre, l' entrée de la cellule par des agents pathogènes intracellulaires pourrait également affecter la fluidité de la membrane hôte / hydrophobie qui à son tour peut modifier l' attachement des autres membres du microbiome, y compris les bactéries et les champignons . Afin de comprendre les interactions qui peuvent se produire entre ces multiples agents pathogènes qui co-localisent dans les mêmes régions géographiques de l'hôte humain, nous devons être en mesure d'étudier l'interaction des agents pathogènes qui représentent le spectre des royaumes taxonomiques présents à la surface de la muqueuse.

t "> Le Herpesviridae sont une famille de microbes présents dans 100% des humains en tant que membres permanents du microbiome 3,4. En outre , ils peuvent également être constamment versé à la fois en présence et en l' absence de symptômes. Plus précisément, l' herpès simplex virus-1 et l'herpès simplex virus 2 (HSV-1 et HSV-2, respectivement) sont membres permanents du microbiome dans le oronasopharynx et l'appareil génital. chez les personnes immunocompétentes, HSV-1 et HSV-2 provoquent gingivostomatite, ainsi que herpès génital 5-8. sur ces sites, HSV provoque une infection latente caractérisée par une nécrose chronique persistante virale asymptomatique excrétion 9. entrée de HSV dans des cellules conduit à des altérations de l' expression de surface de nectins, l' héparane sulfate, les radeaux lipidiques et herpesvirus entrée médiateur / tumeur récepteur du facteur (HVEM / TNFR) 10-25. Ces récepteurs potentiellement représentent partagés pour certaines bactéries et les champignons, par exemple S. aureus et C. albicans, qui , bien que des agents pathogènes opportunistes,peuvent également résider en tant que membres du microbiome de la muqueuse de l'oronasopharynx 26,27. Au sein de la oronasopharynx S. aureus et C. Albicans occupent deux sites distincts de la colonisation. Dans des hôtes avec des dents naturelles, la muqueuse buccale est partagée par le HSV-1 et C. albicans, tandis que les nares nasales antérieures sont occupées par S. aureus 28. Cependant, les résultats malgré in vitro que S. aureus adhère aux cellules épithéliales de la bouche, 29,30 S. aureus est rarement isolé à partir d' échantillons oraux lorsque le tissu normal est présent 29,30. On sait peu concernant génitales niches voies co-colonisation au - delà des résultats cliniques que S. aureus est associé à la vaginite aérobie, caractérisée par une inflammation génitale, la décharge et la dyspareunie, tandis que C. Albicans produit des lésions des muqueuses semblables à celles observées dans la cavité buccale 31-35. Ainsi, bien que ces membres de la microbi orale et génitaleertains royaumes taxonomiques croisées peu est connu au sujet de leur interaction que son impact sur ​​leur capacité à initier la formation de biofilm par l' adhésion à la surface de la cellule hôte 5. Ce protocole a été appliqué de manière efficace afin de déterminer les conséquences fonctionnelles de co-colonisation / infection.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. HSV Souches et Manipulation

Note: Recombinant non-propagation de HSV-1 (KOS) gL86 et HSV-2 (KOS) 333gJ - avec l' activité du rapporteur bêta-galactosidase utilisés ont été fournis par V. Twiari 36,37.

  1. Utiliser des virus à partir d'un lot unique et stocker à -80 ° C, à un rapport 1: 1 de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 20% de sérum de fœtus bovin (FBS) et le lait écrémé jusqu'à utilisation. Avant le stockage du lot viral, déterminer la concentration du virus par o - nitrophényl-β-D-galactopyranoside (ONPG) et de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) dosage.
  2. Déterminer la viabilité du virus et de la multiplicité d'infection (MOI) par X-Gal coloration pour chaque série de test expérimental utilisant un test d'entrée du virus de la reporter, comme décrit précédemment (Figure 1) 14.
  3. Diluer virus (Opt-MEM) à MOI désiré. Fix monocouches (paraformaldéhyde; ainsi 0,5 ml /) avant la coloration. Placez les contrôles de viabilité du virus dans un microti séparéplaque de ter en parallèle avec des plaques d'essai polymicrobienne.

2. HeLa 299 cellules Manipulation

  1. Croissance à 37 ° C, 5% de CO2 dans du DMEM avec 4,5 g / L de glucose, 10% de sérum fœtal bovin (FBS), de la gentamicine (50 pg / ml) et de L-glutamine inactivé par la chaleur. cellules Passage à 80% de confluence avec une solution de trypsine (acide éthylènediaminetétraacétique, 0,53 M EDTA, 0,05% de trypsine, 5 ml / flacon).

3. C. albicans Manutention

Remarque: C. albicans obtenus à partir d' une source de laboratoire clinique est stocké à -80 ° C dans Remmel lait écrémé 2x moyen.

  1. Culture gelé pâte sur Sabouraud Dextrose Medium (37 ° C). Après 24 heures sous - culture de la C. albicans sur le milieu Fungisel (37 ° C; 48 h) pour une utilisation.
  2. Générer tube germinatif (GT) des formes (choisir colonies représentatives; 3 ml de FBS, 3 h; 37 ° C; Abs 600, 0,3). Après incubation, laver GT (HBSS; 2x; 4000 g). Ajouter GT lavé pour réchauffé HBSS (37 &# 176; C; 0,32 Abs 600). formes GT devraient être 99% des cellules observées tel que déterminé par le nombre de hémocytomètre.
  3. Faire forme de levure (YF) actions suspensions en choisissant des colonies de Fungisel représentatives (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs 600). Comptez le nombre de formes YF / ml au microscope en utilisant un hémocytomètre. formes de YF devraient être 99% des cellules observées tel que déterminé par le nombre de hémocytomètre.
  4. Faire stock de travail fongique (250 pi de GT ou YF stock en 25 ml de HBSS; 37 ° C; 10 5 UFC / ml)

4. S. aureus Manipulation

  1. Magasin S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel écrémé 2x lait). La culture sur de la gélose au sang de mouton (5%, 37 ° C; 24 h). Prélever des colonies représentatives et transfert à mannitol sels moyenne dans les 2 jours pour le stock (37 ° C; 18 h).
  2. Faire S. aureus suspension stock (3 ml HBSS; 1,32 Abs 600; 10 8 UFC / ml)
    1. Faire S. travail aureus actions (100 pidu stock dans 25 ml de HBSS; 10 5 UFC / ml).

5. Candida et S. aureus Suspensions

  1. Faire mixte C. albicans et S. aureus suspension (250 pl YF ou GT stock et 100 pi de S. aureus disponible dans 25 ml de HBSS).

6. polymicrobienne biofilm Assay

  1. Semences des plaques à 96 puits avec 200 pi de 2 x 10 5 cellules HeLa / ml (taux de confluence de 85%). Plaques de roche (30 - 45 min; 37 ° C) avant l' incubation (37 ° C, 5% de CO 2 incubateur; 18 h). Monocouches Wash (1x; Opt-MEM) , puis ensemencer avec HSV (HSV-1 (KOS) gL86 ou HSV-2 (KOS) 33 gJ - dans 100 ul Opt-MEM; MOI 50 et 10). Incuber les plaques (3 h, 37 ° C; 5% CO 2). Utilisez une seule souche virale par jour.
  2. Laver les monocouches infectées (1x; tampon phosphate salin (PBS) avec du Mg et du Ca 2 2; 100 ul). Remplacer PBS avec HBSS chaud laissant 25 & #181; l dans chaque puits.
    1. Ajouter YF, GT et / ou S. Les suspensions aureus travail (100 ul; rapport cible cellulaire = 5: 1; n = 16). comme il est indiqué dans le tableau 1 Incuber les plaques (statiques; 30 min; 37 ° C; 5% CO 2).
  3. Après incubation, aspirer une colonne à la fois le remplissage immédiatement avec 300 ul de PBS avec Mg +2 et Ca +2. Répétez cette étape deux fois, puis ajouter le tampon test lyse radio immunoprécipitation (RIPA, filtre stérilisé; 200 ul d'une dilution au 1:50).
  4. Rapidement triturer la cellule lysat HeLa puis placer 50 ul sur des sels de mannitol (MS) et / ou Fungisel (F) médias (figure 2). Passez le lysat en utilisant une tige coudée de verre à un angle de 90 °. Incuber les plaques (18 h à 37 ° C). compter manuellement le nombre de colonies par plaque. Les contrôles sont constitués de S. aureus et / ou C. albicans adhérence aux cellules HeLa HSV-non infectées.

7. Des études d'imagerie </ P>

  1. Laver chaque lamelle de verre ronde (12 mm, 50 ml d'acétone dans bêcher de 100 ml). Sec et stériliser les lamelles (Kimwipes; boîtes de Pétri en verre). Placer les lamelles stériles secs dans les puits de plaques à 24 puits stériles, avec de l'alcool flamme pinces stérilisées.
  2. Ajouter des cellules HeLa (1 ml; volume de 5x utilisé pour plaques à 96 puits) dans les puits de plaques à 24 puits contenant des lamelles de verre rondes lavées stériles. Ajouter les virus, les bactéries et les champignons selon le modèle (tableau 2) à 5x le volume utilisé pour les plaques à 96 puits, puis incuber et procédé tel que décrit dans les étapes 6.2.1 à 6.4 ci - dessus.
  3. Après le lavage final, fixer les cellules pour la microscopie en inondant la lame avec du methanol et en le laissant évaporer. Stocker les plaques à la température ambiante jusqu'à ce que la coloration.
  4. Pour la microscopie en champ clair (1,000x finale d'agrandissement d'origine) remplir les puits contenant des lamelles de méthanol fixe avec de l'eau déminéralisée. Immédiatement aspirer l'eau. Couvrir chaque lamelle avec du cristal violet Grams. Lavez lamelles de libre tache non liée (eau déminéralisée). Lamelles sèches in situ puis les adhèrent avec l' ensemble de dureté moyenne à une diapositive marquée de montage (Figure 3).
  5. Pour la microscopie (objectif 100x; 1,000x finale grossissement) fluorescent lavage exempt de lamelles de méthanol essentiellement comme décrit dans l'étape 7.4. Sécher les lamelles dans les puits.
    1. Après séchage, enlever les lamelles et les placer sur des lames marquées. Puis ajouter une quantité suffisante de dilution de 1:20 isothiocyanate de fluorescéine (FITC) de l'Herpès Simplex Virus Type 1 + 2 gD anticorps pour couvrir la lamelle couvre-objet (1 - 5 ul).
    2. Incuber les lames dans une chambre d'humidité à 37 ° C pendant 30 min. Après incubation, laver les lamelles en 4 changements de PBS.
    3. Après le lavage final, le retour de la lamelle à la diapositive marquée. Tache avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, la chambre d'humidité, 37 ° C pendant 30 minutes). Après incubation, laver les lamelles dans 4 changements de PBS, puis apposer sur la diapositive marquée avec jeu dur milieu de montage.
    4. Laisser le milieu de montage durcir pendant 24 heures à température ambiante dans l'obscurité. Examiner les lamelles sous l'objectif du pétrole soit sur un microscope à fond clair ou microscope à fluorescence avec des filtres de coupure FITC et DAPI. Examiner les images d'au moins 50 champs (100 cellules par organisme minimum) pour la co-localisation (Figure 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Le niveau de la solidité des données obtenues à partir du système décrit dans le présent rapport est illustré à la figure 2 af 38. Grâce à l'utilisation de ce système, la modulation de l'interaction staphylococcique et fongique avec des cellules infectées par des virus et de leur effet sur l'adhésion de l'autre peut être délimitée. Ces types d'études nécessitent un examen au microscope de l'interaction , comme illustré sur les figures 3 et 4 38 afin de déterminer si l'interaction polymicrobienne se produit sur ​​les mêmes cellules. Dans cette étude, l'interaction cellule différentielle est observée à la suite de HSV-modulation de l'adhérence staphylococcique et fongique qui est une espèce virale spécifique.

S. aureus et C. Albicans (GT et YF) ont adhéré aux mêmes cellules témoins non infectées par le HSV HeLa. Cette co-localisation sur les cellules indique un manque de phys inférence ical avec l' adhérence des cellules HeLa les uns des autres et que les niveaux mesurés d'adhérence différentielle mesurées étaient susceptibles HSV-médiée (figure 3A, A1) 38. Cependant, lors du HSV-1 ou HSV-2 Des cellules HeLa infectées par pas de co-localisation de staphylocoques et C. albicans n'a été observée. (Figures 3B, B1, B2, B3, C1, C2). En utilisant la microscopie à fluorescence (FITC conjugué anti-HSV-gD d'anticorps monoclonal) a également confirmé que S. aureus ne semble pas de co-localiser avec C. Albicans ni HSV-1 ou HSV-2 (figures 4A, A1, A2, A3, A4, B1, B2, B3). Cette coopération entre le HSV et Candida étendu à la fois la levure et germinales forme de tube (figures 2A-F) de C. albicans. Cette spécificité de l'association entre la triade des microbes reflète la spécificité de la colonisation vu sur une échelle beaucoup plus large dans la muqueuse oronasopharynx hôte.

1 "> Figure 1
Figure 1. X-gal Coloration Photos de Dosage dépendante HSV-1 infection dans les cellules HeLa. Cellules HeLa infectées par le HSV-1 à différentes MOI et X-Gal tachée. Cellules (A) HeLa en puits de plaque à 96 puits avec X-Gal contrôle tachée de cellules HeLa faussement infectées; Grossissement de 20x initial; (B) des cellules HeLa en puits de plaque à 96 puits avec la cellule X-Gal teinté HeLa infectées par le HSV-1 à une multiplicité d'infection (MOI) de 10; Grossissement de 20x initial; Cellules (C) HeLa en puits de plaque à 96 puits avec la cellule X-Gal teinté HeLa infectées par le HSV-1 à une multiplicité d'infection (MOI) de 50; Grossissement de 20x initial; échelle bar applique à tous. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

fichiers / ftp_upload / 54162 / 54162fig2.jpg "/>
La figure 2. Effet de HSV-1 (panneaux A, C, E) et de HSV-2 (panneaux B, D, F) à des multiplicités d'infection (MOI) de 50 et 10 sur l' adhésion de S. aureus et / ou C. albicans aux cellules HeLa. (A) de S. aureus (Sa) se liant à HSV-1 des cellules infectées en présence de C. des tubes de germes albicans (GT) ou des formes de levure (YF); (B) S. aureus (Sa) se liant à HSV-2 des cellules infectées en présence de C. des tubes de germes albicans (GT) ou des formes de levure (YF); (C) C. des tubes de germes albicans (GT) se liant à HSV-1 des cellules infectées en présence de S. aureus (Sa), (D) C des tubes de germes albicans (GT) se liant à HSV-2 des cellules infectées en présence de S. aureus (SA); (E) C. Formes de levure albicans (YF) se liant à HSV-1 des cellules infectées en présence de S. aureus (SA); (F) C. Formes de levure albicans (YF) se liant à HSV-2 des cellules infectées en présence de S. aureus (Sa). Tous les points de données sont la moyenne +/- SEM, n = 16 normalisées par rapport à un contrôle sans virus. * = Significativement différent (p <0,05) du contrôle non infecté des cellules HeLa. # = Significativement différent (p <0,05) du point apparié indiqué par le support; barre d'échelle applique à tous. 38 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Manque de S. aureus et C. Les interactions albicans sur le HSV-1 et HSV-2 Des cellules HeLa infectées. HSV-1 et HSV-2 infectées (MOI 50) HeLa avec des monocouches de cellules de S. aureus et C. Albicans (5: 1 cible cellulaire). Pour champ clair microscopie, monocouches de cellules ont été colorées avec du cristal violet de Gram, puis examinés par microscopie optique. Les cellules qui ont été positifs pour Candida ou S. aureus (100 cellules individuelles par signal de microbe / par lamelle) ont été secondairement analysé pour la présence de signaux microbe co-localisation supplémentaires (1,000x agrandissement initial). (A et A1) , S. aureus (Sa) et C. formes albicans de levure (YF) ou des formes de tubes de germes (GT) co-localiser sur les cellules HeLa non infectées; (A2, insérer). Pour cent des cellules HeLa avec les microbes co-localisés ou individuels; (B - B3) Manque de S.. aureus et C. Albicans colocalisation en présence de HSV-1; (C - C2) Manque de S. aureus et C. Albicans colocalisation en présence de HSV-2. Moyenne ± ETM; barre d'échelle applique à tous. 38rget = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Manque de Co-localisation de S. aureus avec C. Albicans le HSV-1 ou HSV-2 Des cellules HeLa infectées. HeLa infectées par le HSV Des monocouches de cellules provocation avec S. aureus et C. Albicans (5: 1 cellule cible) colorée (anticorps anti-FITC conjugué à gD de HSV, et DAPI). Les photos sont représentatives des résultats du dépistage des cellules qui ont été un signal positif pour le HSV puis scannées pour Candida et S. aureus (100 cellules individuelles par signal de microbe par lamelle) qui ont ensuite été secondairement analysé pour la présence de signaux microbe co-localisation supplémentaires (1,000x grossissement initial; Nikon). (A - A4) C. albicans (A2, insert; coloration DAPI) co-localiser avec HSV-1; (B- B3) C. albicans co-localisée avec HSV-2 (B1, insert, C. albicans coloration DAPI). Moyenne ± ETM; barre d'échelle applique à tous. 38 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

1 2 3 4 6 7 8 9 dix 11 12
Tubes GT YF MSSA GT / SASM YF / SASM GT YF MSSA GT / SASM YF / SASM
MÉDIAS F F MME MME F MME F F F MME MME F MME F
UNE
B
C
E
F
g
H

Tableau 1.
Modèle général Détermination of Microbial Adhérence en polymicrobienne Interactions GT = Candida albicans tube germinatif de phénotype. YF = C. albicans sous forme de levure phénotype; MSSA = méthicilline Staphylococcus aureus sensible; MS = sels de mannitol moyen; F = Fungisel moyen. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Planche 1 1 2 3 4 5 6
Des cellules HeLa seulement HeLa + GT HeLa + YF HeLa + Sa HeLa + GT + Sa HeLa + YF + Sa
UNE
B
C
Planche 2
HSV cellules HeLa + HSV HSV + HeLa + GT > HSV + HeLa + YF HSV + HeLa + Sa HSV + HeLa + GT + Sa HSV + HeLa + YF + Sa
UNE
B
C

Tableau 2.
Modèle général pour l' analyse visuelle des polymicrobienne interactions avec les cellules infectées par le HSV et non infectées HeLa GT = Candida albicans tube germinatif phénotype. YF = C. albicans sous forme de levure phénotype; SA = méthicilline Staphylococcus aureus sensible; HSV = virus de l'herpès simplex.ve.com/files/ftp_upload/54162/54162table2.xlsx "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Actuellement , aucune information est disponible sur les interactions complexes entre permanent aux membres semi-permanents du microbiome hôte qui traversent plusieurs domaines taxonomiques, à savoir, procaryotes, eucaryotes et virales. Nous avons donc développé un roman dans le système de modèle in vitro pour étudier biofilm initiation par S. aureus et C. albicans sur le HSV-1 ou HSV-2 infectées HeLa 229 (38 HeLa). Le système de modèle de cellules HeLa présente un avantage unique. Ceci est dû à leur manque d'expression de la fibronectine de surface, qui sert de récepteur à la fois S. aureus et C. albicans 39-41. Depuis la 42 surface apicale des épithéliums muqueux manque normalement fibronectine, ce système de plus près imite celle observée dans l' infection naturelle et la colonisation 43-47. Ainsi, nous sommes en mesure d'examiner plus directement les pièces de rotation du récepteur de l'entrée virale spécifiques de rôle dans l'adhésion ultérieure par d'autres membres du microbiome.

En utilisant l' entrée de non-maîtrise d' étalement de HSV-1 et HSV-2, ces résultats montrent que l' entrée dans la cellule de HSV-1 ou HSV-2 rend les cellules réfractaires super-infection avec S. aureus, tout en améliorant C. Albicans adhérence d'une manière dépendante de la concentration virale (figure 4). Fait intéressant, les effets du HSV-1 sur les formes GT vs YF, était l'inverse de celle mesurée pour le HSV-2, une constatation qui peut avoir un impact significatif sur la promotion de la candidose vaginale dans les présentations cliniques 48-51. Du point de vue pathogénétique, il est généralement admis que le phénotype GT de C. albicans est la forme pathogène, avec le YF le état ​​commensal 51-54. Le respect de C. albicans GT qui ont été co-incubée avec S. aureus a montré un motif altéré de se lier à des cellules HeLa infectées par le HSV, par rapport à celle mesurée pour YF - S. liaison aureus. HSV-1 adhérence améliorée de GT dans les cellules HeLa, mais à un sigsignificative moindre mesure (p <0,05) que celle mesurée pour YF adhérence, tel que discuté ci - dessus, à savoir, le contrôle de 270% pour YF adhérence et le contrôle de 190% pour la GT adhésion. En outre, alors que S. aureus n'a eu aucun effet sur ​​l' amélioration de HSV-1 de se lier GT, la cochenille réduit à néant l'adhérence accrue à médiation par la présence de HSV-2. La tendance inverse a été observée pour S. effet aureus sur l' interaction de YF avec des cellules infectées par le virus. Cette prédilection pour les différentes formes fongiques par HSV-1 (YF) vs. HSV-2 (GT) peut jouer un rôle dirigeant maintenance de l'état commensal in vivo. En ce qui concerne l'effet de la forme de GT sur S. la liaison aureus, la GT presque complètement aboli le HSV-1 inhibition de l' adhérence des staphylocoques aux cellules HeLa. En revanche, bien que la capacité de GT à associer à HSV-2 des cellules infectées a été significativement augmentée par rapport à HSV-1, la présence de S. aureus bloqué l'augmentation médiée par le HSV-2 dans l' adhésion.

S. aureus -Cell interaction, puisque S. aureus adhère uniquement aux cellules HeLa non infectées. En outre, l' examen au microscope de cellules montrent que Candida et de HSV-1 et HSV-2 co-localisés. Utilisés ensemble ici les résultats de cette étude parallèle l'observation in vivo site de spécificité pour la colonisation indiquant l'utilité de ce modèle pour l'étude des interactions polymicrobienne.

l'utilisation efficace du protocole décrit ci dépend d'une variété de facteurs. Tout d'abord, l'utilisation de la propagation du virus déficient. Cela permet à un exa propretion de l'entrée et de la cellule virale signalisation d'effet a sur les interactions microbiennes suivantes, sans la complication des changements qui peuvent survenir en raison d'envelopper l'acquisition avant de quitter la cellule. En outre, l'utilisation de virus défectueux permet un environnement plus sûr pour le traitement de biosécurité de classe Deux Pathogens. Deuxièmement, ce protocole permet l'utilisation des deux variantes virales et microbiennes adhérence. Utilisation de variants qui se lient à des récepteurs spécifiques ne permet la délimitation des récepteurs partagés entre les microbes, ou, en variante, la détection de nouveaux récepteurs. Grâce à l'utilisation d'anticorps monoclonaux aux récepteurs, il est possible que pour la visualisation de la localisation adhésine à la surface du microbe et fournit un outil pour étudier l'expression de l'adhésine modifiée. Ce protocole ne convient pas pour l'étude des micro-organismes qui ne peuvent pas être isolé de manière sélective sur un milieu différentiel. La méthodologie est également dépendante de la disponibilité de l'anticorps monoclonal à des protéines spécifiques du virus. Bien qu'unnalyse dans cette étude a été renforcée par la différence de taille entre les levures et les bactéries, l' utilisation de différentiellement fluorescence marqué, par exemple le rouge Texas, un anticorps monoclonal spécifique de microbe serait un travail efficace autour si les microbes en question similaire dans la morphologie et la taille.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose BD 211584
Fungisel Agar Dot Scientific 7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar Troy Biologicals 7143B
Sheep blood agar Troy Biologicals 221239
Hela cells
1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate Corning 10-017-CM
Gentamicin 50 mg/ml Sigma 1397 50 µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x Corning 25-052-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150 10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG Thermo Scientific 34055
Ultra-Pure X gal Invitrogen 15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) Corning 20-021-CV
1x PBS Dot Scientific 30042-500
RIPA Lysis Life Technologies 89901
Staining
Methanol Fisher Scientific A433P-4
HSV 1&2, specific for gD ViroStat 196
DAPI SIGMA D8417-5MG
Gram Crystal Violet Troy Biologicals 212527
Supplies
Petri dish 100 x 15 Dot Scientific 229693 
Petri dish 150 x 15 Kord Valmark 2902
96-Well plates Evergreen Scientific 222-8030-01F
24-well plates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Culture tubes 100 x 13 Thomas Scientific 9187L61
Cover slip circles, 12 mm Deckglaser CB00120RA1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
  2. Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
  3. Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
  4. Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
  5. Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
  6. Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
  7. Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
  8. Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
  9. Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
  10. Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
  11. Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
  12. Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
  13. Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
  14. Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
  15. Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
  16. Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
  17. Hauck, C. R. Cell adhesion receptors - signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
  18. Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
  19. Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
  20. Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
  21. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
  22. Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
  23. Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, http://dx.doi.org/10.1016/j.expneurol.2006.04.026 461-469 (2006).
  24. Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
  25. Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
  26. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
  27. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
  28. Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
  29. Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
  30. Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
  31. Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
  32. Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
  33. Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
  34. Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
  35. Nenoff, P., et al. Mycology - an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
  36. Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
  37. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
  38. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. (2016).
  39. Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. (2014).
  40. Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, Suppl 4 400-403 (1987).
  41. Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
  42. Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
  43. Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, (Pt 5) 569-581 (1997).
  44. Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
  45. Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
  46. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, http://dx.doi.org/10.1016/j.matbio.2005.06.008 389-399 (2005).
  47. Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
  48. Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
  49. Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
  50. Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
  51. Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
  52. Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
  53. Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
  54. Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).
Détermination de biofilm Initiation sur les cellules infectées par le virus par les bactéries et les champignons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).More

Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter