Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحديد بيوفيلم بدء في الخلايا المصابة بالفيروسات من قبل البكتيريا والفطريات

Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54162
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Midwestern University

Abstract

دراسة التفاعلات متعدد المكروبات في جميع أنحاء الممالك التصنيفية التي تشمل البكتيريا والفطريات والفيروسات لم تفحص سابقا في ما يتعلق بكيفية أعضاء الفيروسي من microbiome يؤثر على التفاعلات ميكروب لاحقة مع الخلايا المضيفة المصابة بالفيروسات هذه. والعيش المشترك بين الفيروس مع البكتيريا والفطريات موجودة أساسا على الأسطح المخاطية لتجويف الفم والجهاز التناسلي. خلايا الغشاء المخاطي، ولا سيما مع العدوى الفيروسية الكامنة المزمنة أو الدائمة المستمرة، يمكن أن يكون له تأثير كبير على أعضاء microbiome من خلال تغيير الفيروس في عدد ونوع من المستقبلات التي أعرب عنها. أن التعديل في العمارة غشاء الخلية المضيفة يؤدي إلى القدرة غيرت من أعضاء لاحق من النباتات الطبيعية ومسببات الأمراض الانتهازية لبدء الخطوة الأولى في تشكيل بيوفيلم، أي التزام. توضح هذه الدراسة وسيلة لتحديد الكميات والفحص البصري للتأثير HSV على بدء biofilتشكيل م (الالتزام) س الذهبية وجيم البيض.

Introduction

يتضمن microbiome الإنسان الكائنات الحية المتنوعة من الممالك التصنيفية المتعددة التي تتقاسم مناطق جغرافية في الجسم. التمسك سطوح الخلايا هو خطوة أولى أساسية في تشكيل بيوفيلم، الذي هو جزء من عملية microbiome الاستعمار. وشملت في microbiome يمكن أن تكون الفيروسات التي تسبب الالتهابات المزمنة والمستمرة. عدوى الخلايا المزمن من قبل هذه الفيروسات يمكن أن تسبب تغيير في توفر مستقبلات المفترض 1،2 بالإضافة إلى ذلك، دخول الخلية عن طريق الجراثيم داخل الخلايا يمكن أن تؤثر أيضا على غشاء المضيف سيولة / للا مائية والتي بدورها قد يغير الحجز على أعضاء microbiome الآخرين، بما في ذلك البكتيريا والفطريات . من أجل فهم التفاعلات التي تحدث بين هذه الجراثيم المتعددة التي شاركت في توطين في مناطق جغرافية واحدة للمضيف البشري، يجب أن نكون قادرين على دراسة التفاعل من مسببات الأمراض التي تمثل طائفة من الممالك التصنيفية الحاضرة في سطح الغشاء المخاطي.

ر "> إن فيروسات هربسية هي عائلة من الميكروبات الموجودة في 100٪ من البشر كأعضاء دائمين في microbiome 3،4. وبالإضافة إلى ذلك يمكن أيضا أن تسلط باستمرار سواء في وجود وعدم وجود أعراض وعلى وجه التحديد، فيروس العقبول البسيط-1 وفيروس العقبول البسيط 2 (HSV-1 و HSV-2، على التوالي) أعضاء الدائمين في microbiome في oronasopharynx والجهاز التناسلي. في الأفراد المناعة المختصة، سواء HSV-1 و HSV-2 سبب التهاب اللثة، وكذلك الهربس التناسلي 5-8. في هذه المواقع، HSV يسبب العدوى الكامنة التي تتميز المزمن المستمر بدون أعراض الفيروسية تسليط 9. دخول HSV إلى نتائج الخلايا في إحداث تغييرات في التعبير سطح nectins، كبريتات heparan، الطوافات الدهنية وهربس دخول الوسيط نخر الورم / مستقبلات عامل (HVEM / TNFr) 10-25. هذه المستقبلات يحتمل أن تمثل المشتركة لبعض البكتيريا والفطريات، مثل بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية وجيم البيض، في حين أن الذي مسببات الأمراض الانتهازية،ويمكن أيضا أن يقيم كأعضاء في microbiome المخاطية للoronasopharynx 26،27. ضمن oronasopharynx س. الذهبية وجيم البيض تحتل موقعين متميزين من الاستعمار. في المضيفين مع الأسنان الطبيعية، ويشارك في الغشاء المخاطي للفم من قبل HSV-1 و C. البيض، في حين احتلت فتحتي الأنف الأنف الأمامية التي كتبها س. الذهبية 28. ومع ذلك، على الرغم من في المختبر النتائج أن S. الذهبية تلتزم الخلايا الظهارية الفم، 29،30 س. يتم عزل الذهبية نادرا من العينات عن طريق الفم عندما الأنسجة الطبيعية موجودة 29،30. ولا يعرف سوى القليل بشأن منافذ الجهاز المشارك الاستعمار التناسلية وراء النتائج السريرية التي S. ويرتبط الذهبية مع التهاب المهبل الهوائية، ويتميز بالتهاب الأعضاء التناسلية والتفريغ وعسر الجماع، بينما C. البيض تنتج الآفات المخاطية مماثلة لتلك التي لوحظت في تجويف الفم 31-35. وهكذا، على الرغم من أن هؤلاء الأعضاء من microbi عن طريق الفم والأعضاء التناسليةلى بعد الممالك التصنيفية عبر يعرف المتعلقة تفاعلها قليلا لأنه يؤثر قدرتها على الشروع في تشكيل بيوفيلم من خلال الانضمام إلى سطح الخلية المضيفة 5. وقد تم تطبيق هذا البروتوكول على نحو فعال لتحديد عواقب وظيفية المشترك الاستعمار / العدوى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. HSV سلالات والمناولة

ملاحظة: المؤتلف غير نشر HSV-1 (كوس) gL86 وHSV-2 (كوس) 333gJ - مع النشاط مراسل بيتا غالاكتوزيداز المستخدمة قدمتها خامسا Twiari 36،37.

  1. استخدام الفيروس من الكثير واحد ومخزن في -80 درجة مئوية في نسبة 1: 1 متوسطة تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) مع 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) والحليب الخالي من الدسم حتى الاستخدام. قبل الكثير تخزين الفيروسي، وتحديد تركيز الفيروس عن طريق س -nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) و 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-غال) فحص.
  2. تحديد الجدوى فيروس وافر من العدوى (وزارة الداخلية) التي كتبها X-غال تلطيخ لتشغيل كل فحص تجريبي باستخدام فيروس مراسل فحص دخول، كما هو موضح سابقا (الشكل 1) 14.
  3. تمييع فيروس (التقيد MEM) الى وزارة الداخلية المطلوبة. إصلاح الطبقات الوحيدة (لامتصاص العرق؛ 0.5 مل / جيد) قبل تلطيخ. وضع ضوابط بقاء الفيروس في العكبرية منفصلةلوحة ثالثا بالتوازي مع لوحات فحص متعدد المكروبات.

2. هيلا 299 التعامل مع خلية

  1. ينمو بمعدل 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 في DMEM مع 4.5 جم / لتر جلوكوز، 10٪ للحرارة المعطل الجنين المصل البقري (FBS)، جنتاميسين (50 ميكروغرام / مل) ولام الجلوتامين. خلايا مرور في 80٪ التقاء مع الحل التربسين (ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل، 0.53 M EDTA، 0.05٪ التربسين، 5 مل / قارورة).

3. C. البيض المناولة

ملاحظة: C. البيض الحصول عليها من مصدر المختبرات الطبية وتخزينها في -80 درجة مئوية في Remmel الحليب الخالي من الدسم 2X المتوسطة.

  1. ثقافة تجميد الأسهم على سابورو سكر العنب المتوسطة (37 درجة مئوية). بعد 24 ساعة ثقافة فرعية في C. البيض على Fungisel المتوسطة (37 درجة مئوية و 48 ساعة) للاستخدام.
  2. توليد أنبوب الجرثومية (GT) أشكال (اختيار المستعمرات التمثيلية؛ 3 مل FBS، 3 ساعة و 37 درجة مئوية، عبس 600، 0.3). بعد مرور فترة الحضانة، وغسل GT (HBSS، 2X، 4000 x ج). إضافة GT غسلها لHBSS حرارة (37 &# 176؛ ج. 0.32 عبس 600). وينبغي أن تكون أشكال GT 99٪ من الخلايا لوحظ على النحو الذي يحدده عدد عدادة الكريات.
  3. جعل المعلقات شكل الخميرة الأسهم (YF) عن طريق التقاط المستعمرات Fungisel التمثيلية (HBSS، 3 مل، 0.32 عبس 600). عد عدد من الأشكال YF / مل مجهريا باستخدام عدادة الكريات. وينبغي أن تكون أشكال YF 99٪ من الخلايا لوحظ على النحو الذي يحدده عدد عدادة الكريات.
  4. جعل العمل الأسهم الفطرية (250 ميكرولتر من GT أو الأسهم YF في 25 مل HBSS و 37 درجة مئوية و 10 5 خلية / مل)

4. س. الذهبية المناولة

  1. متجر س. الذهبية آي تي سي سي 25923 (-80 درجة مئوية؛ Remmel الخالي من الدسم 2X الحليب). ثقافة على أجار الدم الأغنام (5٪ و 37 درجة مئوية، و 24 ساعة). اختيار المستعمرات التمثيلية ونقل إلى مانيتول أملاح المتوسطة على بعد 2 أيام للسهم (37 درجة مئوية و 18 ساعة).
  2. جعل S. تعليق الذهبية الأسهم (3 مل HBSS، 1.32 عبس 600، 10 8 كفو / مل)
    1. جعل العمل س. الأسهم الذهبية (100 ميكرولترمن الأسهم في 25 مل HBSS. 10 5 خلية / مل).

5. المبيضات وس. الذهبية المعلقات

  1. جعل مختلطة C. البيض وس. الذهبية تعليق (250 YF ميكرولتر أو الأسهم GT و 100 ميكرولتر الأسهم بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية في 25 مل HBSS).

6. متعدد المكروبات بيوفيلم الفحص

  1. بذور 96 لوحات جيدا مع 200 ميكرولتر من 2 × 10 5 هيلا خلية / مل (85٪ مستوى التقاء). لوحات روك (30 - 45 دقيقة و 37 درجة مئوية) قبل الحضانة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 حاضنة و 18 ساعة). غسل الطبقات الوحيدة (1X، التقيد MEM) ثم البذور مع هامبورغ (HSV-1 (كوس) gL86 أو HSV-2 (كوس) 33 جيجا جول - في 100 ميكرولتر التقيد MEM، وزارة الداخلية 50 و 10). احتضان لوحات (3 ساعات و 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2). استخدام سلالة فيروسية واحدة فقط في اليوم الواحد.
  2. غسل الطبقات الوحيدة المصابة (1X، الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع المغنيسيوم والكالسيوم +2 +2؛ 100 ميكرولتر). استبدال برنامج تلفزيوني مع HBSS الدافئ ترك 25 & #181؛ ل في كل بئر.
    1. إضافة YF، GT و / أو س. الذهبية تعليق العمل (100 ميكرولتر، هدف إلى نسبة الخلايا = 5: 1، ن = 16). كما هو مبين في الجدول رقم 1 احتضان لوحات (ثابتة و 30 دقيقة و 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).
  3. بعد الحضانة، ونضح عمود واحد في وقت اعادة ملء فورا مع 300 ميكرولتر PBS مع المغنيسيوم والكالسيوم +2 +2. كرر هذه الخطوة مرتين ثم إضافة الراديو مناعي عازلة فحص تحلل (المعهد الملكي؛ مرشح وتعقيمها، 200 ميكرولتر من تخفيف 01:50).
  4. يسحن بسرعة الخلية المحللة هيلا ثم ضع 50 ميكرولتر على أملاح مانيتول (MS) و / أو وسائل الإعلام Fungisel (F) (الشكل 2). نشر المحللة باستخدام عازمة الزجاج قضيب بزاوية 90 درجة. احتضان لوحات (18 ساعة على 37 درجة مئوية). حساب عدد من المستعمرات في لوحة يدويا. تتكون ضوابط S. الذهبية و / أو جيم البيض الالتزام خلايا هيلا غير مصاب HSV.

7. دراسات التصوير </ P>

  1. يغسل كل ساترة الزجاج الجولة (12 مم، و 50 مل الأسيتون في 100 مل دورق). coverslips الجافة وتعقيم (Kimwipes، أطباق بتري زجاجي). ضع coverslips معقمة جافة في آبار العقيمة 24 لوحات جيدة مع الكحول لهب ملقط معقم.
  2. إضافة خلايا هيلا (1 مل، حجم 5X تستخدم لمدة 96 لوحات جيدة) إلى الآبار من 24 لوحات جيدة تحتوي على العقيمة coverslips الزجاج الجولة غسلها. إضافة الفيروسات والبكتيريا والفطريات وفقا للنموذج (الجدول 2) في 5X الحجم المستخدم ل96 لوحات جيدا، ثم احتضان وعملية كما هو موضح في الخطوات 6.2.1 إلى 6.4 أعلاه.
  3. بعد غسل النهائي، وتحديد الخلايا للفحص المجهري عن طريق إغراق الشريحة مع الميثانول والسماح له لتتبخر. تخزين لوحات في RT حتى تلطيخ.
  4. للفحص المجهري مشرق الميدان (1،000x التكبير الأصلي النهائي) ملء الآبار التي تحتوي على coverslips ثابت الميثانول مع الماء منزوع الأيونات. نضح الماء على الفور. تغطية كل ساترة مع غرام البنفسجي الكريستال. غسل coverslips خالية من البقع غير المربوطة (الماء منزوع الأيونات). coverslips الجافة في الموقع ثم الالتزام بها مع مجموعة من الصعب متوسطة إلى شريحة وصفت تركيب (الشكل 3).
  5. للفحص المجهري الفلورسنت (الهدف 100X، 1،000x الأصلي التكبير النهائي) غسل coverslips خالية من الميثانول أساسا كما هو موضح في الخطوة 7.4. تجفيف coverslips في الآبار.
    1. بعد التجفيف، وإزالة زلات الغطاء ووضعها على الشرائح المسمى. ثم إضافة كمية كافية من 1:20 التخفيف من ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) -conjugated العقبول البسيط نوع الفيروس 1 + 2 GD الأجسام المضادة لتغطية ساترة (1-5 ميكرولتر).
    2. احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد مرور فترة الحضانة، وغسل لل coverslips في 4 تغييرات في برنامج تلفزيوني.
    3. بعد غسل النهائي، والعودة ساترة إلى الشريحة المسمى. وصمة عار مع 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي، غرفة رطوبة و 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة). بعد مرور فترة الحضانة غسل لل coverslips في 4 تشانغيس من برنامج تلفزيوني، ثم يضعوا على الشريحة المسمى مع مجموعة من الصعب المتوسطة المتزايدة.
    4. السماح للمتوسطة متزايدة لعلاج لمدة 24 ساعة على RT في الظلام. دراسة لل coverslips تحت هدف النفط على أي المجهر مشرق الميدان أو المجهر الفلورسنت مع مرشحات قطع FITC ودابي. دراسة الصور لا يقل عن 50 حقول (100 خلية في الحد الأدنى الحي) للمشاركة في التعريب (الشكل 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يظهر مستوى متانة البيانات التي يمكن الحصول عليها من النظام المذكور في هذا التقرير في الشكل 2 AF 38. من خلال استخدام هذا النظام لتعديل من التفاعل المكورات العنقودية والفطرية مع الخلايا المصابة فيروسي وتأثيرها على التزام كل منهما ويمكن تحديد. هذه الأنواع من الدراسات تتطلب الفحص المجهري للتفاعل كما هو موضح في أرقام 3 و 4 38 من أجل تحديد ما إذا كان التفاعل متعدد المكروبات التي تحدث في الخلايا نفسها. في هذه الدراسة لوحظ تفاعل الخلايا التفاضلي نتيجة لHSV-تعديل التقيد المكورات العنقودية والفطرية التي هي الأنواع الفيروسية محددة.

بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية وC. البيض (GT وYF) انضمت إلى نفس الخلايا السيطرة هيلا HSV-غير المصابة. هذا التعاون توطين على الخلايا يدل على عدم فيز من المرجح HSV بوساطة (الشكل 3A، A1) 38 الاستدلال كال مع خلية الالتزام هيلا بعضهم البعض وأن مستويات قياس الالتزام التفاضلي قياس. ومع ذلك، عند HSV-1 أو HSV-2 الخلايا المصابة هيلا لا يشارك في توطين المكورات العنقودية وC. وقد لوحظ البيض. (أرقام 3B، B1، B2، B3، C1، C2). باستخدام المجهر فلوري (FITC مترافق مكافحة HSV-GD حيدة النسيلة الأجسام المضادة) وأكد كذلك أن س. لم الذهبية لا تظهر للمشاركة في توطين مع C. البيض ولا HSV-1 أو HSV-2 (الأرقام 4A، A1، A2، A3، A4، B1، B2، B3). تمديد هذا التعاون بين هامبورغ والمبيضات إلى كل من الخميرة والجرثومية أشكال أنبوب (أرقام 2A-F) من C. البيض. هذه خصوصية العلاقة بين ثالوث الميكروبات تعكس خصوصية الاستعمار ينظر على نطاق أوسع بكثير في الغشاء المخاطي oronasopharynx المضيف.

1 "> شكل 1
الشكل 1. X-غال تلطيخ صور من الجرعة تابع HSV-1 العدوى في خلايا هيلا. خلايا هيلا المصابين HSV-1 على مختلف زارة الداخلية وX-غال الملون. خلايا (A) هيلا في بئر من 96 لوحة جيدا مع X-غال الملون سيطرة خلية هيلا وهمية المصابة. 20x والتكبير الأولي. (ب) خلايا هيلا في بئر من 96 لوحة جيدا مع خلية هيلا X-غال الملون المصابين HSV-1 في وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 10؛ 20x والتكبير الأولي. خلايا (C) هيلا في بئر من 96 لوحة جيدا مع خلية هيلا X-غال الملون المصابين HSV-1 في وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 50؛ 20x والتكبير الأولي. على نطاق وينطبق شريط للجميع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملفات / ftp_upload / 54162 / 54162fig2.jpg "/>
الرقم 2. تأثير HSV-1 (لوحات A، C، E) وHSV-2 (لوحات B، D، F) في مولتيبليكيتييس من العدوى (وزارة الداخلية) في 50 و 10 على الالتزام س الذهبية و / أو جيم البيض إلى خلايا هيلا. (A) س. الذهبية (سا) ملزمة لHSV-1 الخلايا المصابة في وجود C. أنابيب البيض الجرثومية (GT) أو أشكال الخميرة (YF)؛ (ب) س. الذهبية (سا) ملزمة لHSV-2 الخلايا المصابة في وجود C. أنابيب البيض الجرثومية (GT) أو أشكال الخميرة (YF)؛ (C) C. أنابيب البيض الجرثومية (GT) ملزمة لHSV-1 الخلايا المصابة في وجود S. الذهبية (سا)؛ (د) C. أنابيب البيض الجرثومية (GT) ملزمة لHSV-2 الخلايا المصابة في وجود S. الذهبية (سا)؛ (E) C. أشكال الخميرة البيض (YF) ملزمة لHSV-1 الخلايا المصابة في وجود S. الذهبية (سا)؛ (F) C. أشكال الخميرة البيض (YF) ملزمة لHSV-2 الخلايا المصابة في وجود S. الذهبية (سا). جميع نقاط البيانات هي متوسط ​​+/- SEM، ن = 16 تطبيع للسيطرة خالية من الفيروسات. * = اختلافا كبيرا (ع <0.05) من غير المصابة سيطرة خلية هيلا. # = اختلافا كبيرا (ع <0.05) من وجهة الاقتران يدل على قوس. ينطبق شريط مقياس للجميع. 38 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. عدم وجود S. الذهبية وجيم البيض التفاعلات على HSV-1 و HSV-2 خلايا هيلا المصابة. HSV-1 و HSV-2 المصابين (وزارة الداخلية 50) هيلا الطبقات الوحيدة الخلية مع س. الذهبية وجيم البيض (5: 1 هدف في الخلية). لحقل مشرق المجهر، كانت ملطخة الطبقات الوحيدة الخلية مع البنفسجي الكريستال غرام، ثم فحصها بواسطة المجهر الضوئي. الخلايا التي كانت إيجابية للالمبيضات أو S. الذهبية (100 الخلايا الفردية في إشارة ميكروب / في ساترة) تم فحصها بشكل ثانوي لوجود إشارات إضافية ميكروب شارك في الترجمة (1،000x التكبير الأولي). (A & A1) س. الذهبية (سا) وجيم أشكال البيض الخميرة (YF) أو أشكال أنبوب الجرثومية (GT) شارك في توطين على خلايا هيلا غير المصابة. (A2، إدراج). في المئة من خلايا هيلا مع مترجمة شارك أو الفردية الميكروبات. (B - B3) عدم وجود س. الذهبية وجيم البيض شارك في التعريب في وجود HSV-1؛ (C - C2) عدم وجود S. الذهبية وجيم البيض شارك في التعريب في وجود HSV-2. يعني ± SEM. ينطبق شريط مقياس للجميع. 38r يمكنك الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. عدم وجود المشارك توطين س. الذهبية مع C. البيض على HSV-1 أو HSV-2 خلايا هيلا المصابة. HSV-المصابين هيلا الطبقات الوحيدة الخلية التحدي مع س. الذهبية وجيم البيض (5: 1 الهدف لخلية) الملون (FITC مترافق مكافحة HSV GD الأجسام المضادة، ودابي). الصور هي تمثيلية من النتائج من فحص الخلايا التي كانت إشارة إيجابية لفيروس الهربس البسيط ثم مسحها ضوئيا لالمبيضات وس. الذهبية (100 الخلايا الفردية في إشارة ميكروب في ساترة) التي تم مسحها ضوئيا ثم ثانيا لوجود إشارات إضافية ميكروب شارك في الترجمة (1،000x التكبير الأولي، نيكون). (A - A4) C. البيض (A2، إدراج، تلوين دابي) شارك في توطين مع HSV-1؛ (ب- B3) C. البيض مع HSV-2 (B1، إدراج، C. المبيضة البيضاء تلطيخ دابي) مترجم المشترك. يعني ± SEM. ينطبق شريط مقياس للجميع. 38 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1 2 3 4 6 7 8 9 10 11 12
أنابيب GT YF MSSA GT / MSSA YF / MSSA GT YF MSSA GT / MSSA YF / MSSA
وسائل الإعلام F F الآنسة الآنسة F الآنسة F F F الآنسة الآنسة F الآنسة F
ا
ب
C
د
ه
F
G
H

الجدول 1.
تحديد قالب العام الميكروبية الالتزام في متعدد المكروبات التفاعلات GT = المبيضات البيض أنبوب الجرثومية النمط الظاهري؛ YF = C. البيض شكل الخميرة النمط الظاهري. MSSA = ميثيسيلين حساسة العنقودية الذهبية المكورات العنقودية. MS = أملاح مانيتول المتوسطة. F = Fungisel المتوسطة. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

لوحة 1 1 2 3 4 5 6
خلايا هيلا فقط هيلا + GT هيلا + YF هيلا + سا هيلا + GT + سا هيلا + YF + سا
ا
ب
C
د
لوحة 2
HSV خلايا هيلا + HSV HSV + هيلا + GT > HSV + هيلا + YF HSV + هيلا + سا HSV + هيلا + GT + سا HSV + هيلا + YF + سا
ا
ب
C
د

الجدول 2.
قالب العام ل Visual تحليل متعدد المكروبات التفاعل مع الخلايا المصابة HSV وغير مصاب هيلا GT = المبيضات البيض أنبوب الجرثومية النمط الظاهري؛ YF = C. البيض شكل الخميرة النمط الظاهري. SA = ميثيسيلين حساسية المكورات العنقودية الذهبية. HSV = فيروس الهربس البسيط.ve.com/files/ftp_upload/54162/54162table2.xlsx "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

حاليا يتوفر على التفاعلات المعقدة بين الأعضاء الدائمين وشبه دائم في microbiome المضيفة التي تعبر متعددة المجالات التصنيفية، أي بدائيات النوى، حقيقيات النوى والفيروسية أية معلومات. لذلك وضعنا رواية في نظام نموذجي المختبر لدراسة بدء بيوفيلم من قبل س. الذهبية وجيم البيض على HSV-1 أو HSV-2 المصابين هيلا 229 (هيلا) خلايا 38. يقدم نظام هيلا نموذج خلية ميزة فريدة من نوعها. ويرجع ذلك إلى نقص في التعبير الفيبرونكتين السطح، والتي هي بمثابة مستقبلات لكل من س. الذهبية وجيم البيض 39-41. منذ قمي 42 سطح الظهارة المخاطية تفتقر عادة فبرونيكتين، وهذا النظام بشكل وثيق يقلد تلك التي لوحظت في العدوى الطبيعية والاستعمار 43-47. وهكذا، ونحن قادرون على دراسة أكثر مباشرة دور محددة المسرحيات الفيروسي دوران دخول مستقبلات في الانضمام لاحق من قبل أعضاء آخرين من microbiome.

عن طريق دخول يتقن غير نشر HSV-1 و HSV-2، وتشير هذه النتائج إلى أن دخول خلية من HSV-1 أو HSV-2 يجعل خلايا مقاومة للحرارة إلى super-العدوى مع S. الذهبية، مع تعزيز C. تمسك البيض بطريقة تعتمد على تركيز الفيروس (الشكل 4). ومن المثير للاهتمام، وآثار HSV-1 على أشكال GT مقابل YF، كان العكس من ذلك قياس لHSV-2، وهو الاكتشاف الذي قد يكون له تأثير كبير على تعزيز داء المبيضات المهبلي في العروض السريرية 48-51. من وجهة نظر المرضية، ومن المسلم به عموما أن النمط الظاهري GT من C. البيض هو الشكل المسببة للأمراض، مع YF الدولة المتعايشة 51-54. تمسك C. البيض GT التي كانت تشارك في المحتضنة مع س. أظهرت الذهبية نمط تغير ملزمة لخلايا هيلا المصابين HSV، بالمقارنة مع أن قياس لYF - S. الذهبية ملزمة. HSV-1 تعزيز التزام GT إلى خلايا هيلا، ولكن لسيج بدرجة أقل nificantly (ع <0.05) من أن قياس لالتزام YF، على النحو المذكور أعلاه، أي السيطرة 270٪ لتمسك YF والسيطرة 190٪ لتمسك GT. وبالإضافة إلى ذلك، في حين س. كان الذهبية أي تأثير على HSV-1 تعزيز GT ملزمة، انتفى مكورة تمسك تعزيز بوساطة وجود HSV-2. وقد لوحظ نمط عكسي لس. تأثير الذهبية على التفاعل YF مع الخلايا المصابة بالفيروس. هذا الميل لأشكال الفطرية المختلفة التي HSV-1 (YF) مقابل HSV-2 (GT) قد تلعب دورا توجيه صيانة الدولة المتعايشة في الجسم الحي. وفيما يتعلق تأثير شكل GT على س. الذهبية ملزمة، وGT ألغيت تماما تقريبا تثبيط HSV-1 من الالتزام العنقودية إلى خلايا هيلا. في المقابل، على الرغم من قدرة GT لربط مع HSV-2 الخلايا المصابة وزيادة كبيرة بالمقارنة مع HSV-1، وجود S. منعت الذهبية للتوسط زيادة HSV-2 في الالتزام.

الصورة = "jove_content"> إن مسألة ما إذا كان أي تغييرات في الالتزام ميكروب هي نتيجة لمستقبلات المفترضة محددة غيرت الوقت الحاضر، أو بسبب عائق ميكانيكي الفراغية يمكن أجاب في هذا النموذج. من خلال الجمع بين استخدام الكميات من التفاعلات ميكروب خلايا (كفو العد)، والفحص المجهري للتفاعلات، تمكنا من تحديد أن HSV-1 و HSV-2 تظهر لمنع S. -cell الذهبية التفاعل، منذ S. انضمت الذهبية فقط لخلايا هيلا غير المصابة. وعلاوة على ذلك، الفحص المجهري للخلايا تبين أن المبيضات وHSV-1 و HSV-2 المشارك المترجمة. تستخدم جنبا إلى جنب هنا نتائج هذه الدراسة موازية في الجسم الحي الملاحظات الموقع خصوصية للاستعمار مما يدل على فائدة من هذا النموذج لدراسة التفاعلات متعدد المكروبات.

الاستخدام الفعال للبروتوكول الموصوفة هنا يعتمد على مجموعة متنوعة من العوامل. أولا، استخدام انتشار فيروس نقص. وهذا يمكن examina نظيفةنشوئها من تأثير الفيروسية الدخول والخلية إشارات له على التفاعلات ميكروب لاحقة، دون مضاعفات التغيرات التي يمكن أن تحدث نتيجة ليطوق الاستحواذ قبل مغادرة الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام فيروس معيب يسمح لبيئة أكثر أمانا للتعامل مع السلامة الأحيائية الدرجة مسببات الأمراض اثنين. ثانيا، يسمح هذا البروتوكول لاستخدام كلا الخيارين الالتزام الفيروسية والجراثيم. استخدام المتغيرات التي تربط فقط لمستقبلات محددة يسمح ترسيم مستقبلات المشتركة بين الميكروبات، أو بدلا من الكشف عن مستقبلات جديدة. من خلال استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لمستقبلات، هناك احتمال لرؤية توطين adhesin على سطح الميكروب ويوفر أداة لدراسة التعبير adhesin تغير. هذا البروتوكول ليست مناسبة لدراسة الميكروبات التي لا يمكن أن تكون معزولة بشكل انتقائي على وسط التفاضلية. منهجية تعتمد أيضا على توافر الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للبروتينات الفيروس محددة. على الرغم من أنوتعززت nalysis في هذه الدراسة، والفرق بين حجم الخميرة والبكتيريا، واستخدام تفاضلي الموسومة fluorescently، مثل تكساس الأحمر، ميكروب الأجسام المضادة وحيدة النسيلة محدد من شأنه أن يكون فعالا عمل حول أن الميكروبات في مسألة تكون مشابهة في الشكل والحجم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose BD 211584
Fungisel Agar Dot Scientific 7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar Troy Biologicals 7143B
Sheep blood agar Troy Biologicals 221239
Hela cells
1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate Corning 10-017-CM
Gentamicin 50 mg/ml Sigma 1397 50 µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x Corning 25-052-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150 10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG Thermo Scientific 34055
Ultra-Pure X gal Invitrogen 15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) Corning 20-021-CV
1x PBS Dot Scientific 30042-500
RIPA Lysis Life Technologies 89901
Staining
Methanol Fisher Scientific A433P-4
HSV 1&2, specific for gD ViroStat 196
DAPI SIGMA D8417-5MG
Gram Crystal Violet Troy Biologicals 212527
Supplies
Petri dish 100 x 15 Dot Scientific 229693 
Petri dish 150 x 15 Kord Valmark 2902
96-Well plates Evergreen Scientific 222-8030-01F
24-well plates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Culture tubes 100 x 13 Thomas Scientific 9187L61
Cover slip circles, 12 mm Deckglaser CB00120RA1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
  2. Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
  3. Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
  4. Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
  5. Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
  6. Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
  7. Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
  8. Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
  9. Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
  10. Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
  11. Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
  12. Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
  13. Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
  14. Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
  15. Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
  16. Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
  17. Hauck, C. R. Cell adhesion receptors - signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
  18. Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
  19. Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
  20. Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
  21. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
  22. Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
  23. Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, http://dx.doi.org/10.1016/j.expneurol.2006.04.026 461-469 (2006).
  24. Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
  25. Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
  26. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
  27. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
  28. Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
  29. Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
  30. Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
  31. Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
  32. Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
  33. Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
  34. Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
  35. Nenoff, P., et al. Mycology - an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
  36. Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
  37. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
  38. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. , (2016).
  39. Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. , (2014).
  40. Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, Suppl 4 400-403 (1987).
  41. Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
  42. Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
  43. Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, (Pt 5) 569-581 (1997).
  44. Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
  45. Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
  46. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, http://dx.doi.org/10.1016/j.matbio.2005.06.008 389-399 (2005).
  47. Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
  48. Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
  49. Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
  50. Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
  51. Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
  52. Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
  53. Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
  54. Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).

Tags

عدوى، العدد 113، متعدد المكروبات، بيوفيلم، فيروس الهربس البسيط،
تحديد بيوفيلم بدء في الخلايا المصابة بالفيروسات من قبل البكتيريا والفطريات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Plotkin, B. J., Sigar, I. M.,… More

Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter