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Immunology and Infection

Bestimmung von Biofilm Initiation auf Virus-infizierte Zellen durch Bakterien und Fungi

Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54162
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Midwestern University

Abstract

Die Studie von polymikrobiellen Interaktionen über die taxonomische Königreiche, die Pilze, Bakterien und Viren sind nicht zuvor in Bezug auf, wie virale Mitglieder des microbiome beeinflussen nachfolgende Mikroben-Interaktionen mit diesen Virus infizierten Wirtszellen untersucht worden. Das Zusammenleben von Virus mit Bakterien und Pilzen besteht hauptsächlich darin, die auf den Schleimhäuten der Mundhöhle und des Genitaltrakts. Mucosal Zellen, insbesondere solche mit persistenten chronischen oder persistenten latenten Virusinfektionen, könnte einen erheblichen Einfluss auf die Mitglieder des microbiome durch Virus Veränderung in der Anzahl und Art der Rezeptoren zum Ausdruck gebracht haben. Änderung in Wirtszellmembran Architektur in veränderter Fähigkeit der nachfolgenden Mitglieder der normalen Flora und opportunistischen Erregern würde den ersten Schritt in die Biofilmbildung, das heißt, die Einhaltung zu initiieren. Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Quantifizierung und visuelle Untersuchung des HSV Wirkung auf die Einleitung BIOFILm - Bildung (Adhärenz) von S. aureus und C. albicans.

Introduction

Der menschliche microbiome umfasst unterschiedliche Organismen aus verschiedenen taxonomischen Königreiche, die im Körper geografischen Regionen teilen. Die Einhaltung der Zelloberflächen ist ein wichtiger erster Schritt in die Biofilmbildung, die Teil des microbiome Kolonisierung ist. Eingeschlossen in die microbiome können Viren sein, die chronische und persistente Infektionen verursachen. Die chronische Zellinfektion durch diese Viren kann eine Veränderung in mutmaßlichen Rezeptor Verfügbarkeit führen. 1,2 Zusätzlich Zelleintritt durch intrazelluläre Erreger auch Wirts Membranfluidität / Hydrophobizität, die wiederum verändern können Anbringung weiterer microbiome Mitglieder, einschließlich Bakterien und Pilzen beeinflussen könnten . Um die Wechselwirkungen zu verstehen, die zwischen diesen mehrere Krankheitserreger, die Co-Lokalisierung in den gleichen Regionen des menschlichen Wirts auftreten können, müssen wir die Wechselwirkung von Krankheitserregern zu studieren können, die das Spektrum von taxonomischen Königreiche, die an der Schleimhautoberfläche darstellen.

t "> Die Herpesviridae sind eine Familie von Mikroben in 100% der Menschen als ständige Mitglieder des microbiome 3,4. Darüber hinaus können sie auch beide beharrlich vergossen werden in Gegenwart und in Abwesenheit von Symptomen. Insbesondere Herpes - simplex - Virus-1 und Herpes-simplex-Virus-2 (HSV-1 und HSV-2, jeweils) sind permanent Mitglieder der microbiome im oronasopharynx und Genitaltrakt. in immunkompetenten Individuen sowohl HSV-1 und HSV-2 verursachen Gingivostomatitis, sowie Genital - Herpes 5-8. an diesen Stellen verursacht HSV eine latente durch chronische persistente asymptomatischen Virus gekennzeichnet Infektion zu vergießen 9. Eintritt von HSV in Zellen führt zu Veränderungen in der Oberflächenexpression von nectins, Heparansulfat, Lipid Rafts und Herpes - Virus Eintrag Mediator / Tumor - Nekrose Faktor - Rezeptor (HVEM / TNFr) 25.10. Diese potenziell gemeinsamen Rezeptoren für einige Bakterien und Pilze darstellen, zB S. aureus und C. albicans, die während opportunistische Erreger,können auch als Mitglieder der Schleimhaut microbiome des oronasopharynx 26,27 befinden. Innerhalb des oronasopharynx S. aureus und C. albicans belegen zwei verschiedene Stellen der Besiedlung. In Hosts mit natürlichen Zähnen wird die Mundschleimhaut durch HSV-1 geteilt und C. albicans, während die vorderen Nasen nares werden von S. besetzt aureus 28. Doch trotz in - vitro - Ergebnisse , dass S. aureus hält sich an den Mund Epithelzellen, 29,30 S. aureus ist selten von oralen Proben isoliert , wenn die normale Gewebe vorhanden 29,30 ist. Es ist wenig bekannt , Genitaltrakt über Co-Kolonisation Nischen jenseits der klinischen Befunde , dass S. aureus ist mit aerober Vaginitis verbunden sind , gekennzeichnet durch Genital - Entzündung, Entladung und Dyspareunie, während C. albicans erzeugt Schleimhautläsionen ähnlich der in der Mundhöhle beobachtet 31-35. Obwohl also diese Mitglieder der Mund- und Genital microbiome Quer taxonomischen Reiche wenig bekannt ist , ihre Interaktion , wie sie Auswirkungen ihrer Fähigkeit , die Bildung von Biofilmen durch die Einhaltung der Wirtszelloberfläche 5 über einzuleiten. Dieses Protokoll wurde effektiv die funktionellen Folgen der Co-Kolonisation / Infektion zu bestimmen, angewandt.

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Protocol

1. HSV-Stämme und Handhabung

Hinweis: Recombinant kein Ausbreiten HSV-1 (KOS) gL86 und HSV-2 (KOS) 333gJ - mit beta-Galactosidase - Reporteraktivität verwendet wurden von V. Twiari 36,37 zur Verfügung gestellt.

  1. Verwenden Sie Virus aus einem Los und bei -80 ° C bei einer 1: 1-Verhältnis von Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) und Magermilch bis zur Verwendung. Vor viral Menge Lagerung, Viruskonzentration von o - Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) Assay bestimmen.
  2. Bestimmen die Lebensfähigkeit des Virus und Multiplizität der Infektion (MOI) von X-Gal - Färbung für jeden experimentellen Testlauf unter Verwendung von Reporter - Virus Eintrag Assay, wie vorstehend beschrieben (Figur 1) 14.
  3. Verdünnte-Virus (Opt-MEM), um die gewünschten MOI. Fix Monolayern (Paraformaldehyd, 0,5 ml / Vertiefung) vor der Färbung. Platzieren Sie die Lebensfähigkeit des Virus Kontrollen in einem separaten microtiter Platte parallel zu polymikrobiellen Testplatten.

2. HeLa 299 Cell Handling

  1. Wachsen bei 37 ° C, 5% CO 2 in DMEM mit 4,5 g / L Glucose, 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), Gentamicin (50 ug / ml) und L-Glutamin. Passage-Zellen bei 80% Konfluenz mit Trypsin-Lösung (Ethylendiamintetraessigsäure, 0,53 M EDTA; 0,05% Trypsin; 5 ml / Kolben).

3. C. albicans Handhabung

Hinweis: C. albicans aus einem klinischen Labor Quelle erhalten wird bei -80 ° C in Remmel Magermilch 2x Medium gespeichert.

  1. Kultur gefroren Lager auf Sabouraud-Dextrose-Medium (37 ° C). Nach 24 Stunden Subkultur der C. albicans auf Fungisel Medium (37 ° C; 48 h) zur Verwendung.
  2. Generieren Keimschlauch (GT) Formen (Pick repräsentative Kolonien; 3 ml FBS; 3 h; 37 ° C; Abs 600, 0,3). Nach der Inkubation waschen GT (HBSS; 2x; 4000 · g). In gewaschen GT erwärmt HBSS (37 &# 176; C; 0,32 Abs 600). GT Formulare sollten 99% der Zellen beobachtet, wie er durch Haemocytometerzählung bestimmt.
  3. Machen Sie Hefeform (YF) Stoffsuspensionen durch Picken Vertreter Fungisel Kolonien (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs 600). Zählen Sie die Anzahl von YF Formen / ml unter Verwendung von mikroskopisch einer Zählkammer. YF Formulare sollten 99% der Zellen beobachtet, wie er durch Haemocytometerzählung bestimmt.
  4. Machen Sie arbeiten Pilz-Lager (250 ul GT oder YF Lager in 25 ml HBSS; 37 ° C; 10 5 KBE / ml)

4. S. aureus Handhabung

  1. Shop S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel Milch 2x abschöpfen). Kultur auf Schafblut-Agar (5%; 37 ° C; 24 h). Wählen repräsentative Kolonien und übertragen Salze Mannit Medium innerhalb von 2 Tagen für Lager (37 ° C; 18 h).
  2. Machen Sie S. aureus Stoffsuspension (3 ml HBSS; 1.32 Abs 600; 10 8 KBE / ml)
    1. Machen Sie S. Arbeits aureus Lager (100 & mgr; lder Lager in 25 ml HBSS; 10 5 CFU / ml).

5. Candida und S. aureus Suspensions

  1. Machen Sie Misch C. albicans und S. aureus - Suspension (250 ul YF oder GT Lager und 100 & mgr; l S. aureus Lager in 25 ml HBSS).

6. polymikrobiellen Biofilm-Assay

  1. Seed Platten mit 96 Vertiefungen mit 200 ul 2 x 10 5 HeLa - Zellen / ml (85% Konfluenz Ebene). Gesteinsplatten (30 - 45 min; 37 ° C) vor der Inkubation (37 ° C; 5% CO 2 -Inkubator; 18 h). Wash Monolayern (1x; Opt-MEM) dann Samen mit HSV (HSV-1 (KOS) gL86 oder HSV-2 (KOS) 33 gJ - in 100 ul Opt-MEM; MOI 50 und 10). Inkubieren Platten (3 h; 37 ° C; 5% CO 2). Verwenden Sie nur einen Virusstamm pro Tag.
  2. Waschen infizierten Monoschichten (1x; phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit Mg +2 und Ca +2; 100 & mgr; l). Ersetzen PBS mit warmem HBSS verlassen 25 & #181; l in jeder Vertiefung.
    1. In YF, GT und / oder S. aureus Arbeits Suspensionen (100 & mgr; l, Ziel zu Zellenverhältnis = 5: 1; n = 16) dar . Wie in Tabelle 1 angegeben inkubieren Platten (static; 30 min; 37 ° C; 5% CO 2).
  3. Nach der Inkubation aspirate eine Spalte zu einer Zeit sofort mit 300 & mgr; l PBS mit Mg +2 und Ca +2 Nachfüllen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal fügen Sie dann Radio-Immunopräzipitation Lysepuffer (RIPA; Filter sterilisiert; 200 ul einer Verdünnung von 1:50).
  4. Verreiben schnell die HeLa Zelllysat anschießend auf 50 & mgr; l Mannit Salze (MS) und / oder Fungisel (F) Medien (Abbildung 2). Verbreiten Sie das Lysat mit einem Glasstab gebogen in einem 90 ° Winkel mit. Inkubiere die Platten (18 h bei 37 ° C). zählen manuell die Anzahl der Kolonien pro Platte. Kontrollen bestehen aus S. aureus und / oder C. albicans Einhaltung der HSV-nicht infizierten HeLa - Zellen.

7. Imaging Studies </ P>

  1. Waschen Sie jede Runde Deckglas (12 mm; 50 ml Aceton in 100-ml-Becher). Trockene und sterilisieren Deck (Kimwipes; Petrischalen aus Glas). Legen Sie trockene sterile Deckgläschen in die Vertiefungen von sterilen 24-Well-Platten mit Alkohol Flamme sterilisierten Pinzette.
  2. Hinzufügen HeLa-Zellen (1 ml; 5x Volumen für 96-Well-Platten verwendet werden) in die Vertiefungen von 24-Well-Platten die gewaschenen sterilen Rundglasplättchen enthält. Fügen Sie die Viren, Bakterien und Pilze nach der Vorlage (Tabelle 2) bei 5x das Volumen der 96 - Well - Platten verwendet, dann brüten und Verfahren , wie 6.2.1 bis 6.4 oben in den Schritten beschrieben.
  3. Nach dem letzten Waschen, Fixieren der Zellen für die Mikroskopie durch die Folie mit Methanol überschwemmen und ermöglicht es zu verdampfen. Lagern Sie die Platten bei RT bis zur Färbung.
  4. Für Hellfeldmikroskopie (1,000x letzte Originalvergrößerung) füllen die Vertiefungen mit Methanol fixierten Deck mit entsalztem Wasser enthält. Ab sofort absaugen Wasser. Cover jede Deckglas mit Grams Kristallviolett. Wash Deckgläser frei von nicht gebundenen Fleck (VE-Wasser). Dry Deck in situ haften sie dann mit harten Satz Eindeckmediums zu einem markierten Schieber (Abbildung 3).
  5. Für Fluoreszenzmikroskopie (100x Objektiv; 1,000x letzte Originalvergrößerung) waschen Deckgläser frei im wesentlichen aus Methanol, wie in Schritt 7.4 beschrieben. Trocknen Sie die Deckgläser in den Vertiefungen.
    1. die Deckgläser Nach dem Trocknen entfernen und sie auf markierten Folien. Dann fügen Sie eine ausreichende Menge an 1:20 Verdünnung von Fluorescein (FITC) -konjugierte Herpes Simplex Virus Typ 1 + 2 gD-Antikörper das Deckglas zu bedecken (1 - 5 ul).
    2. Inkubieren der Objektträger in einer feuchten Kammer bei 37 ° C für 30 min. Nach der Inkubation waschen Sie die Deckgläser in vier Änderungen von PBS.
    3. Nach dem letzten Waschen, bringen Sie das Deckglas an die markierte Folie. Fleck mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; Feuchtigkeitskammer; 37 ° C für 30 min). Nach der Inkubation waschen Sie die Deckgläser in 4 changes von PBS, dann zu dem markierten Schlitten mit harten Satz Eindeckmediums befestigen.
    4. Ermöglichen die Befestigungsmittel für 24 h bei RT im Dunkeln zu heilen. Untersuchen Sie die Deckgläser unter Öl-Objektiv entweder auf einem Hellfeld-Mikroskop oder Fluoreszenzmikroskop mit FITC und DAPI Cutoff-Filter. Untersuchen Sie Bilder von mindestens 50 Felder (100 Zellen pro Organismus Minimum) für die Co-Lokalisierung (Abbildung 4).

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Representative Results

Der Grad der Zuverlässigkeit der Daten , die aus System in diesem Bericht beschrieben wird , in Abbildung 2 af 38 gezeigt. Durch die Verwendung dieses Systems die Modulation von Staphylokokken und Pilz Wechselwirkung mit viral infizierte Zellen und deren Wirkung auf jedes Anhaften des anderen können abgegrenzt werden. Diese Arten von Studien erfordern mikroskopische Untersuchung der Wechselwirkung , wie in den 3 und 4 gezeigt 38 , um zu bestimmen , ob die Wechselwirkung polymicrobial auf den gleichen Zellen auftritt. In dieser Studie Differential Zell-Interaktion als Ergebnis der HSV-Modulation von Staphylokokken und Pilz Anhaften beobachtet, die virale Spezies spezifisch ist.

S. aureus und C. albicans (GT und YF) , die an den gleichen HSV-nicht - infizierten HeLa - Kontrollzellen. Diese Co-Lokalisation auf Zellen zeigt einen Mangel an phys sche Inferenz mit jeder Einhaltung HeLa - Zellen des anderen und dass die gemessenen Werte der gemessenen Differenz Einhaltung waren wahrscheinlich HSV-vermittelte (3A, A1) 38. Doch bei HSV-1 oder HSV-2 infizierten HeLa - Zellen keine Co-Lokalisation von Staphylokokken und C. albicans beobachtet. (3B, B1, B2, B3, C1, C2). Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie (FITC-konjugierter anti-HSV-gD monoklonaler Antikörper) bestätigte weiterhin , daß S. aureus schien nicht mit C zusammen lokalisieren albicans oder HSV-1 oder HSV-2 (4A, A1, A2, A3, A4, B1, B2, B3). Diese Zusammenarbeit zwischen HSV und Candida erweitert , um beide Hefe und Keimschlauch Formen (2A-F) von C. albicans. Diese Spezifität der Assoziation zwischen der Triade von Mikroben spiegelt die Spezifität der Kolonisierung auf einer viel breiteren Skala in der Wirts oronasopharynx Schleimhaut gesehen.

1 "> Abbildung 1
Abbildung 1. X-gal - Färbung Bilder von Dosage Dependent HSV-1 - Infektion in HeLa - Zellen. HeLa - Zellen , infiziert mit HSV-1 bei verschiedenen MOI und X-Gal gefärbt. (A) HeLa - Zellen in Vertiefung von 96 - Well - Platte mit X-Gal gefärbt mock-infizierten HeLa - Zellen Kontrolle; 20x Anfangsvergrößerung; (B) HeLa - Zellen in Vertiefung 96 Well - Platte mit X-Gal gefärbt HeLa Zellen , infiziert mit HSV-1 bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10; 20x Anfangsvergrößerung; (C) HeLa - Zellen in Vertiefung 96 Well - Platte mit X-Gal gefärbt HeLa Zellen mit HSV-1 infiziert bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 50; 20x Anfangsvergrößerung; Maßstab für alle gilt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Fig . 2 Wirkung von HSV-1 (Panels A, C, E) und HSV-2 (Panels B, D, F) bei Multiplizitäten der Infektion (MOI) von 50 und 10 auf die Einhaltung von S. aureus und / oder C. albicans zu HeLa - Zellen. (A) S. aureus (Sa) Bindung an HSV-1 - infizierten Zellen in Gegenwart von C. albicans Keimschläuche (GT) oder Hefeformen (YF); (B) S. aureus (Sa) Bindung an HSV-2 - infizierten Zellen in Gegenwart von C. albicans Keimschläuche (GT) oder Hefeformen (YF); (C) C. albicans Keimschläuche (GT) Bindung an HSV-1 - infizierten Zellen in Gegenwart von S. aureus (Sa), (D) C. albicans Keimschläuche (GT) Bindung an HSV-2 - infizierten Zellen in Gegenwart von S. aureus (Sa); (E) C. albicans Hefeformen (YF) zu HSV-1 - infizierten Zellen in Gegenwart von S. Bindungs aureus (Sa); (F) C. albicans Hefeformen (YF) an HSV-2 - infizierten Zellen in Gegenwart von S. Bindungs aureus (Sa). Alle Datenpunkte sind Mittel +/- SEM, n = 16 normiert auf virenfrei Kontrolle. * = Signifikant unterschiedlich (p <0,05) von nicht - infizierten HeLa - Zellkontrolle. # = Signifikant unterschiedlich (p <0,05) von paarigen Punkt durch die Klammer angedeutet; Maßstab gilt für alle. 38 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Mangel an S. aureus und C. albicans - Interaktionen auf HSV-1 und HSV-2 infizierten HeLa - Zellen. HSV-1 und HSV-2 infiziert (MOI 50) , HeLa - Zellmonoschichten mit S. aureus und C. albicans (5: 1 Target - Zelle). Für Hellfeld Mikroskopie-Zellmonolayern wurden mit Gram Kristallviolett gefärbt und dann unter dem Lichtmikroskop untersucht. Zellen , die für Candida oder S. positiv waren aureus (100 individuelle Zellen pro Mikrobe Signal / pro Deckglas) wurden in zweiter Linie auf das Vorhandensein von zusätzlichen Mikrobe Kolokalisation Signale (1,000x Anfangsvergrößerung) abgetastet. (A & A1) S. aureus (Sa) und C. albicans Hefeformen (YF) oder Keimschlauch Formen (GT) co-lokalisieren auf nicht - infizierten HeLa - Zellen; (A2, einfügen). Prozent der HeLa-Zellen mit co-lokalisierten oder einzelne Mikroben; (B - B3) Mangel an S.. aureus und C. albicans Kolokalisation in Gegenwart von HSV-1; (C - C2) Mangel an S. aureus und C. albicans Kolokalisation in Gegenwart von HSV-2. Mittelwert ± SEM; Maßstab gilt für alle. 38rget = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Der Mangel an Co-Lokalisation von S. aureus mit C. albicans auf HSV-1 oder HSV-2 infizierten HeLa - Zellen. HSV-infizierten HeLa - Zellmonolayern Herausforderung mit S. aureus und C. albicans (5: 1 Target - Zelle) gefärbt (FITC-konjugiertem anti HSV gD - Antikörper und DAPI). Die Bilder sind repräsentativ für Erkenntnisse aus der Screening von Zellen , die Signal für den HSV positiv waren dann für Candida und S. gescannt aureus (100 individuelle Zellen pro Mikrobe Signal pro Deckglas) , die dann sekundär auf das Vorhandensein von zusätzlichen Mikrobe Kolokalisation Signale (1,000x anfängliche Vergrößerung, Nikon) abgetastet wurden. (A - A4) C. albicans (A2, Einsatz; DAPI - Färbung) co-lokalisieren mit HSV-1; (B- B3) C. albicans co-lokalisiert mit HSV-2 (B1, Einsatz, C. albicans DAPI - Färbung). Mittelwert ± SEM; Maßstab gilt für alle. 38 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

1 2 3 4 6 7 8 9 10 11 12
Tubes GT YF MSSA GT / MSSA YF / MSSA GT YF MSSA GT / MSSA YF / MSSA
MEDIEN F F FRAU FRAU F FRAU F F F FRAU FRAU F FRAU F
EIN
B
C
D
E
F
G
H

Tabelle 1.
Allgemeine Vorlage Bestimmung der mikrobiellen Adherence in polymikrobiellen Wechselwirkungen GT = Candida albicans Keimschlauch Phänotyp. YF = C. albicans Hefeform Phänotyp; MSSA = Methicillin empfindlichen Staphylococcus aureus; MS = Mannit Salzmedium; F = Fungisel Medium. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

Platte 1 1 2 3 4 5 6
HeLa-Zellen nur HeLa + GT HeLa + YF HeLa + Sa HeLa + GT + Sa HeLa + YF + Sa
EIN
B
C
D
Plate 2
HSV HeLa-Zellen + HSV HSV + HeLa + GT > HSV + HeLa + YF HSV + HeLa + Sa HSV + HeLa + GT + Sa HSV + HeLa + YF + Sa
EIN
B
C
D

Tabelle 2.
Allgemeine Vorlage für die visuelle Analyse von polymikrobiellen Wechselwirkungen mit HSV-infizierten und nicht infizierten HeLa - Zellen GT = Candida albicans Keimschlauch Phänotyp. YF = C. albicans Hefeform Phänotyp; SA = Methicillin empfindlichen Staphylococcus aureus; HSV = Herpes simplex Virus.ve.com/files/ftp_upload/54162/54162table2.xlsx "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Derzeit liegen keine Informationen über komplexe Wechselwirkungen zwischen permanent zu semi-permanenten Mitglieder des Host microbiome , die mehrere taxonomische Domänen kreuzen, dh prokaryotischen, eukaryotischen und viral. Deshalb entwickelten wir ein neuartiges in System - vitro - Modell Biofilm Einleitung von S. zu studieren aureus und C. albicans auf HSV-1 oder HSV-2 infizierten HeLa 229 (HeLa - Zellen) 38. Die HeLa-Zellen Modellsystem stellt einen einzigartigen Vorteil. Dies ist aufgrund ihrer mangelnden Oberfläche Fibronektin, die sowohl S. als Rezeptor dient aureus und C. albicans 39-41. Da die apikal 42 Oberfläche der Schleimhaut Epithelien fehlt normalerweise Fibronektin, dieses System genauer imitiert , die 43-47 in einer natürlichen Infektion und Besiedlung beobachtet. So sind wir untersuchen können, um direkt die Rolle spezifische virale Eintrag Rezeptor Umsatz spielt in den Folge Einhaltung von anderen Mitgliedern der microbiome.

Mit Eintrag beherrschen nicht die Verbreitung HSV-1 und HSV-2, diese Ergebnisse zeigen , dass Zelleintritt von HSV-1 oder HSV-2 - Zellen resistent gegen Superinfektion mit S. macht aureus, während C. Verbesserung albicans Anhaften in einem Virus konzentrationsabhängiger Weise (Figur 4). Interessanterweise war die Wirkung von HSV-1 auf GT Formen gegen YF, das Gegenteil von dem , für HSV-2 gemessen, eine Feststellung , die 48-51 einen erheblichen Einfluss auf die Förderung der vaginalen Candidiasis in klinischen Präsentationen haben. Aus einer Pathogenese Sicht ist es im allgemeinen , daß der Phänotyp von C. GT akzeptiert albicans ist die pathogene Form, mit dem YF der commensal Zustand 51-54. Die Einhaltung von C. albicans GT , die mit S. zusammen inkubiert wurden aureus zeigten eine veränderte Muster zu HSV-infizierten HeLa - Zellen zu binden, im Vergleich zu derjenigen für YF gemessen - S. aureus - Bindung. HSV-1 Anhaften von GT zu HeLa-Zellen verbessert, aber zu einer siglich geringeren Ausmaß (p <0,05) als die für die Einhaltung YF gemessen, wie oben erörtert, das heißt 270% -Kontrolle für YF Adhärenz und 190% -Kontrolle für GT Adhärenz. Darüber hinaus, während S. aureus hatte keinen Effekt auf HSV-1 Verbesserung der GT Bindung, negiert die coccus die durch die Anwesenheit von HSV-2 - vermittelte Adhärenz verbessert. Das umgekehrte Muster wurde für S. beobachtet aureus Wirkung auf YF Interaktion mit Virus infizierten Zellen. Diese Vorliebe für verschiedene Pilzformen durch HSV-1 (YF) gegen HSV-2 (GT) eine Rolle lenken Wartung des commensal Zustand in vivo spielen. Im Hinblick auf die Wirkung der GT Form auf S. aureus - Bindung, die GT schaffte fast vollständig die HSV-1 Hemmung der Staphylokokken - Einhaltung von HeLa - Zellen. Im Gegensatz dazu, obwohl die Fähigkeit von GT mit HSV-2 infizierten Zellen zuzuordnen war signifikant im Vergleich zu HSV-1 erhöht wird , die Anwesenheit von S. aureus blockierte die HSV-2 - vermittelten Erhöhung der Haftung.

S. zu blockieren aureus -Zell Interaktion, da S. aureus haften ausschließlich auf nicht - infizierten HeLa - Zellen. Weiterhin zeigen mikroskopische Untersuchung von Zellen , die Candida und HSV-1 und HSV-2 co-lokalisiert. Zusammen hier die Ergebnisse aus dieser Studie parallel zu der in - vivo - Beobachtungen Ortsspezifität für die Besiedlung , welche die Nützlichkeit dieses Modell für die Untersuchung von polymikrobiellen Wechselwirkungen.

Eine effektive Nutzung der hierin beschriebenen Protokoll ist auf einer Vielzahl von Faktoren abhängig. Erstens, die Verwendung von Spread-defizienten Virus. Dies ermöglicht eine saubere Prütion der Wirkung Viruseintritt und Zellsignalisierung weist auf nachfolgende Mikrobe Wechselwirkungen, ohne die Komplikation der Änderungen, die aufgrund umhüllen Erlangungs vor dem Verlassen der Zelle auftreten kann. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von defekten Virus für eine sicherere Umgebung für die Handhabung von Biosicherheit Klasse Zwei Pathogens. Zweitens erlaubt dieses Protokoll für die Verwendung von sowohl virale und mikroben Adhärenz Varianten. Verwendung von Varianten, die nur an bestimmte Rezeptoren binden, ermöglicht Abgrenzung geteilt Rezeptoren zwischen Mikroben oder alternativ den Nachweis von neuen Rezeptoren. Durch die Verwendung von monoklonalen Antikörpern, an die Rezeptoren, besteht das Potential zur Visualisierung von Adhäsin Lokalisierung auf der Mikrobe Oberfläche und stellt ein Werkzeug veränderten Adhäsin Expression zu untersuchen. Dieses Protokoll ist für die Untersuchung von Mikroben nicht geeignet, die nicht selektiv auf Differenzierungsmedium isoliert werden kann. Die Methodik ist auch abhängig von der Verfügbarkeit von monoklonalem Antikörper an virusspezifischen Proteinen. Obwohl einnalysis in dieser Studie wurde durch die Größe Differenz zwischen Hefe verbessert und Bakterien, die Verwendung von differentiell fluoreszierend markiert, beispielsweise Texas red, mikrobenspezifische monoklonale Antikörper eine effektive Arbeit-around die Mikroben in Frage sollte in der Morphologie und Größe ähnlich sein würde.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose BD 211584
Fungisel Agar Dot Scientific 7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar Troy Biologicals 7143B
Sheep blood agar Troy Biologicals 221239
Hela cells
1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate Corning 10-017-CM
Gentamicin 50 mg/ml Sigma 1397 50 µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x Corning 25-052-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150 10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG Thermo Scientific 34055
Ultra-Pure X gal Invitrogen 15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) Corning 20-021-CV
1x PBS Dot Scientific 30042-500
RIPA Lysis Life Technologies 89901
Staining
Methanol Fisher Scientific A433P-4
HSV 1&2, specific for gD ViroStat 196
DAPI SIGMA D8417-5MG
Gram Crystal Violet Troy Biologicals 212527
Supplies
Petri dish 100 x 15 Dot Scientific 229693 
Petri dish 150 x 15 Kord Valmark 2902
96-Well plates Evergreen Scientific 222-8030-01F
24-well plates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Culture tubes 100 x 13 Thomas Scientific 9187L61
Cover slip circles, 12 mm Deckglaser CB00120RA1

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References

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Die Infektion Ausgabe 113 polymikrobiellen Biofilm Herpes-simplex-Virus, Die Einhaltung
Bestimmung von Biofilm Initiation auf Virus-infizierte Zellen durch Bakterien und Fungi
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Plotkin, B. J., Sigar, I. M.,… More

Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).

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