Abstract
在病毒性脑炎的发病机制的研究中，感染的方法是至关重要的。第一的两个主要感染途径到大脑的是血源性途径，其中涉及内皮细胞和脑的周细胞的感染。第二个是脑室内（ICV）的路线。一旦中枢神经系统（CNS）内，病毒可能会传播到经由脑脊液蛛网膜下腔，脑膜，和脉络丛。在实验模型中，中枢神经系统的病毒式分发的最初阶段不充分表征，并且目前还不清楚只有某些细胞是否最初感染。这里，我们已经分析了在感染的急性期巨细胞病毒（CMV）颗粒的分布，被称为主血症，ICV或血管内（IV）注射以下到新生小鼠的大脑。在ICV注射模型，5微升小鼠CMV（MCMV）或荧光微珠在midpoi分别注入侧脑室NT使用一个27克针10微升注射器耳朵和眼睛之间。在IV注射模型中，使用1-ml注射器用35克针。一个透射被用于可视化颞浅（面）新生小鼠的静脉中。我们注入50微升MCMV或荧光微球进入颞浅静脉。脑收集在不同时间点后喷射。 原位杂交方法，使用该检测MCMV基因组。通过荧光显微镜观察荧光微球或绿色荧光蛋白表达重组MCMV颗粒。这些技术可以应用到许多其它病原体调查脑炎的发病机制。
Introduction
当研究病毒性脑炎，病毒颗粒的初始分布是非常重要的，以了解疾病的发病机制和大脑识别病毒靶。大多数病毒范围从20至300纳米的尺寸，虽然潘多拉病毒是大小为1超过700nm。在感染的急性期的病毒颗粒的分布可取决于颗粒的尺寸，细胞受体的分布，或所述细胞受体的病毒的亲和性。在动物模型中，脑室内（ICV），腹膜内，直接胎盘和静脉内（IV）的感染已被用于研究病毒性脑炎的发病机制。 ICV接种病毒经常被用来建立在小鼠的中枢神经系统（CNS）的感染。使用这种技术的研究报告广泛感染，尤其是在脑室周围区域的细胞，并在与所述脑脊液（CSF），simila直接接触的大脑区域R以病毒ventriculoencephalitis的效果。腺相关病毒（AAV）的颗粒尺寸小（20 -直径为25纳米）有利于在整个ICV感染2-4大脑及其传播。 5腹腔内，胎盘直接6和静脉注射7代表造血全身用药。通过血-脑屏障（BBB）的病毒颗粒的渗透允许它们到达新生儿脑的实质，表示漫小胶质结节8,9。
巨细胞病毒（CMV）是属于疱疹病毒科的共同病毒。在美国，50％ - 在80％的人有过巨细胞病毒感染的40岁CMV感染是很少有害的，但可能会导致免疫功能低下患者和胎儿疾病。所有交付的，为0.2％ - 2％是天生的巨细胞病毒10，产生严重的症状，如小头畸形，脑室周围钙化，小脑发育不全，MICR眼炎，视神经萎缩11,12。此外，智力低下，耳聋，视觉缺陷，癫痫发作和癫痫发生非致命感染巨细胞病毒的婴儿13,14 10％左右。的CNS功能障碍是CMV先天性异常的最常见的典型症状。更多的孩子被永久每年由先天性巨细胞病毒不是唐氏综合症，胎儿酒精综合征或脊柱裂15禁用。有对抗CMV没有接种疫苗可在目前，要求需要一种安全有效的疫苗。研究在感染的最早阶段与它们的受体的CMV颗粒的相互作用是重要的是了解疫苗接种的效果。
Ventriculoencephalitis和小胶质细胞弥漫性结节是CMV的两个主要病理特征脑炎16。 （ - 300纳米150）在感染的急性期传播通过大脑的CMV粒子如何它一直不明朗第二如何细胞受体的分布以及它们的病毒的亲和性向病毒传播。川崎等人已经评估ICV和从颗粒以及它们在病毒感染的早期阶段受体（β1整合）的分布的透视IV感染。我们已发现，巨细胞病毒颗粒和β1整合素的表达的传播感染的两个侧脑室和IV感染8的最早阶段是公相关。 ICV感染是ventriculoencephalitis模型和IV感染是弥漫性结节小胶质细胞的典范。研究病毒或荧光颗粒的动力学将使颗粒尺寸，与细胞受体的病毒的相互作用，和BBB渗透的大脑中的机构的作用的有用信息。以下方案可用于调查在CNS任何病毒感染和病毒载体。
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Protocol
所有实验方案由医学院的滨松大学动物保护委员会的批准。
1.巨细胞病毒（史密斯株）和重组的制备M32增强型绿色荧光蛋白（EGFP）-MCMV
- 根据该方法产生的重组M32-EGFP-MCMV如下（1.2 - 1.9）和如前所述8。
- 使用从野生型MCMV（登录号：U68299）的史密斯菌株的重组病毒。插入EGFP（4361个碱基对; bp）的37089和41450碱基对之间-在通过同源重组MCMV基因组中（M32 M31轨迹）。
- 通过聚合酶链反应扩增的MCMV M32（41450 - 39286碱基对，左侧翼序列和M31（37089 - 39246碱基对，使用下列引物右侧翼序列的基因位点：M32，5'- CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3'（正向引物），5 “-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3'（反向引物）; M31，5'- CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3'（正向引物），5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3'（反向引物）。
- 将M32轨迹成使用NheⅠ和BamHⅠ限制性位点的表达EGFP的载体。插入M31轨迹入M32-EGFP用AflII位和XbaI位点-recombinant质粒。切割M32 - EGFP -用NheⅠ和AflII位来自M32 M31序列- EGFP - M31重组质粒，并在H 2 O溶解
- 染裂解构建成MCMV（史密斯株）的细胞核使用电穿孔系统以诱导同源重组感染的NIH3T3细胞后24小时感染（HPI）。
- 第3天感染后，共培养以1/1000在6孔板用于感染细胞的表达EGFP的病灶的比率和屏未感染的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞。
- HarveST从含有绿色荧光灶孔中的含病毒的上清液和十倍稀释。为了纯化，选择单显示绿色荧光灶井。
- 当所有的焦点从限制稀释感染显示EGFP表达产生，病毒制剂是纯粹的，表示没有野生型病毒仍然存在。如前所述17通过空斑测定法量化病毒。
- 在生物安全2级认证的生物安全柜戴手套和屏蔽处理MCMV。
- 通道MCMV（史密斯应变）和重组MCMV在从12天龄的ICR小鼠胚胎制备的MEF先前所描述的17。
- 离心3000×g的16℃，从受感染的MEF培养上清细胞20分钟。
- 超速离心机在70000×g下将上清液40分钟。悬浮含有病毒体颗粒在1ml Tris缓冲盐水和转移到一个预制的线性小号orbitol梯度（25％ - 70％）。 60分钟18超速离心机再次7万×g的。
- 用注射器收获含有病毒体带。由7万×克额外的一步超速离心40分钟沉淀收获病毒颗粒。
- 重悬在1ml磷酸盐缓冲盐水（PBS），并存储的沉淀于-80℃直至感染实验。
- 如前所述19通过空斑测定法量化病毒滴度。
- 可视化（在489纳米，在508纳米的发射激发）通过荧光显微镜（ 图1A）和通过透射电子显微镜（TEM）8（ 图1B）的颗粒结构的重组MCMV颗粒的EGFP表达。
2.尼罗河红色荧光微球的制备
- 购买羧基荧光尼罗红微球，并把500微升微珠为根据管径管（0.04- 0.06微米，约3.63×10 12颗粒; 0.1 - 0.3微米，约5.75×10 10颗粒;和1.7 - 2.2微米，约6.85×10 7颗粒）。
- 治疗用500μl0.1M NaOH中的小珠约1天，以除去任何内毒素并在室温重新悬浮在无菌水中的珠。
- 吸附珠粒O / N与来自C57BL / 6小鼠在RT使用之前获得的10％的小鼠血清。
- 为了分离聚集，涡珠和使用前充分超声处理。
3，巨细胞病毒和荧光微球的ICV注入新生小鼠
- 保持12小时光照/黑暗周期下，在温度控制的设施正常妊娠ICR小鼠。新生儿是在出生的那一天指定为P 0.5。
- 消毒10微升注射器，并与70％的醇的27克针。
- 加载包含MCMV或荧光微注射溶液（5微升）珠成通过小心拉动注射器的柱塞的针头。
- 4分钟 - 通过将鼠标放在冰上3抑制新生小鼠（P 0.5）。一旦动物是麻醉下，使用脚趾捏反应方法来确定麻醉深度。
- 标记注射部位的位置处约0.7无毒的实验室笔- 1.0毫米外侧到矢状缝和0.7 -从新生儿前囟（ 图2A）1.0毫米尾。
- 插入针头在标记喷射站点2毫米深，在垂直于颅骨表面。作为参考，标记从针与无毒的制造者的尖端2毫米。
- 缓缓注入5μl的MCMV（约5×10 5 PFU）进入侧脑室无需打开头皮（ 图2B）。
- 在另一组老鼠，注入含有荧光微球有5微升的解决方案-通过（0.10.3μm以下，约为5.75×10 8颗粒）同样的方法。
- 停止柱塞运动，以防止回流后20秒 - 慢慢取出针10。
- 要恢复，保持小鼠5 - 10分钟，在一个温暖的容器中，直到运动和一般的响应能力得到恢复。
- 作为一系列时间点（3，12，24，48，和72小时）注射后在第5节收获的大脑。
4.静脉注射MCMV或荧光微球进入新生小鼠
- 4分钟 - 通过将鼠标放在冰上3抑制新生小鼠（P 0.5）。
- 用1-ml注射器用35克针P中执行MCMV的静脉注射0.5新生儿。
- 使用透照（静脉取景器），以可视化的颞浅（面）静脉。注射前，确保新生儿使用外科胶带（ 图2C）的透射。
- 虽然戴着放大镜（1.5X），慢慢注入50微升MCMV（约5.45×的; 10 9颗粒）或荧光微珠（0.04 - 0.06微米，约3.63×10 11颗粒; 0.1 - 0.3微米，约5.75×10 9颗粒;和1.7 - 2.2微米，约6.85×10 6个颗粒）到颞浅静脉（ 图2D）。
- 除去针后，使用含有70％乙醇的纱布直至出血停止压力施加到注射部位。
- 给新生儿约5分钟，在一个温暖的容器将其返回到笼子前恢复。
- 作为在一系列的时间点（3，12，24，和72小时）后喷射在部分5中所述收获的大脑。
5.脑组织样品制备石蜡切片
- 将注入的新生儿在碎冰上一个小塑料盘。
- 一旦动物是麻醉下，使用脚趾捏反应方法来确定anesthes的深度IA。
- 使通过肋骨一个中心或两端横向末端切口打开胸腔。
- 制作与锋利的剪刀中庭削减。注入4％低聚甲醛（PFA）溶液进入心房。在观察到肝脏的自发运动（PFA舞）和减轻色停止灌注。不要抽血。
- 通过首先去除用剪子的头部解剖的新生儿（如前所述20）。
- 使从颈部沿珠中线切开鼻子，露出头骨。
- 一对虹膜剪刀的尖底放入枕骨大孔一侧，沿着头骨的内表面滑动谨慎。
- 使延伸到后颅骨表面的末端边缘的切口，使在对侧的相同切。清除周围的小脑的头骨。
- 小心剥离背面的头骨的一侧，以防止脑损伤。重复此过程对大脑的另一侧。
- 使用刮刀，断绝嗅球和神经连接沿脑的腹侧表面。
- 轻轻大脑从头部分离，修整仍然大脑连接到使用剪刀的头骨和消除大脑硬膜所有。
- 放置脑在含4％PFA的至少10倍，在4℃下的脑部24小时的量的固定剂的小瓶。
- 通过一系列梯度乙醇浴脱水组织以置换水，然后用石蜡渗透，形成一个块。用切片机到4微米厚的片21切蜡块。
- Deparaffinize和再水合感染脑22的滑动。继续原位杂交石蜡切片。
6.脑组织样品制备冰冻切片
- 消除大脑以下5.1中列出的步骤 - 5.11。
- 观察荧光微球和M32-EGFP-MCMV，将切除大脑的平底cryomolds。添加包埋介质完全覆盖大脑样本。捕捉冻结预冷正己烷 （-80℃）的cryomolds，把它连接到夹头使用镊子举行cryomolds的边缘前。
- 对于切片，附着在低温恒温预冷盘冷冻的组织块。传送与卡盘的冷冻组织成一个低温恒温器腔和降低温度至-10和-20℃之间，并切割片约8 - 10微米厚的23。
- 通过喷雾固定用cytofixative（异丙醇和聚乙二醇的混合物）的部分。空气干燥在RT 30分钟的部分喷雾后立即，并将它们存储在 - 80ºC直至进一步使用。
- 平衡的部分回至室温，并用PBS洗三次。
- 染色用荧光素异硫氰酸酯（FITC）缀合的G中的各节riffonia simplicifolia凝集素B4以1:1的浓度：100在室温在PBS中的10分钟（ 图5）或用PE缀合的CD31抗体以1:1的浓度：100在室温在PBS 30分钟（ 图6）。
- 用PBS洗三次的章节。
- 洗涤后，染色切片用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）来可视化细胞核。安装在防褪色剂和图像DAPI的部分（激发波长345纳米，455纳米发射），EGFP（在489 nm激发，在508 nm发射）和尼罗红（激发波长553纳米，637纳米发射）用荧光显微镜（ 图3，图5，图6）。
7. 荧光原位杂交（FISH）用于石蜡切片
- 使用包含整个MCMV DNA根细菌人工染色体准备缺口翻译用荧光标记，直接用于DNA 原位杂交FISH探针OME（pSM3fr）19。的FISH探针的浓度为0.1微克/微升。
- Deparaffinize和再水合感染脑22的滑动。
- 治疗用RNase（PBS中100μg/ ml的）的组织切片以检测病毒DNA。
- 98℃20分钟 - 用0.05％NP40，在95的0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）进行抗原修复。冷却该滑动至室温20分钟。
- 在玻璃科普林染色缸，洗涤载玻片在纯水中三次，每次2分钟。执行与0.06％的胃蛋白酶，在37℃下5分钟0.01当量的HCl溶液中的附加抗原修复步骤。
- 漂洗在玻璃科普林染色缸每次滑动在纯水三次2分钟。
- 通过将载玻片从70％的乙醇转印再次脱水组织切片，以85％的乙醇，然后至100％的乙醇。
- 为了制备杂交缓冲液的10毫升，混合1.25毫升原位杂交的盐（3M氯化钠，100毫摩尔Tris-HCl pH 8.0的，100mM磷酸钠pH 6.8的50毫摩尔EDTA）用5毫升去离子甲酰胺，2.5毫升50％硫酸葡聚糖，250μl的50×Denhardt氏溶液，125微升100毫克/毫升的tRNA，和875微升H 2 O
- 稀释直接标记与随机识别整个MCMV基因组中的杂交缓冲液中的荧光团的DNA探针。的最终体积为10微升（7微升杂交缓冲液，1微升探针（0.1微克/微升），和2μl蒸馏水）。
- 探针混合物（10微升）添加至每个载玻片，并用盖玻片（15×15mm）的覆盖。密封橡胶水泥盖玻片。变性5分钟的探针混合物在85°C，并完成杂交步骤O / N在42℃。
- 洗用0.3％NP40，0.4倍的SSC载玻片在73℃，2分钟;用0.1％NP40，在73℃1分钟0.4倍的SSC;并用2×SSC两次。
- 染液用DAPI（10毫微克/毫升）和盖上盖玻片幻灯片中的细胞核。
- 安装在防褪色试剂和图像的DAPI（激发在345纳米，在455纳米发射）和EGFP（激发在489纳米，在508纳米发射）的部分用荧光显微镜（ 图4）。
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Representative Results
在病毒性脑炎的发病机理的研究，感染的方法是很重要的。血行路线表示内皮细胞和脑的周细胞的急性感染，而ICV路线表示急性感染通过蛛网膜下腔经由脑脊液蔓延，延伸到脑膜和脉络丛。为了分析在急性脑炎颗粒的第一分配，原位杂交检测MCMV基因组和M32-EGFP-MCMV颗粒或荧光微珠直接观察被使用。
MCMV重组生成（M32-EGFP-MCMV）
该协议说明了M32-GFP-MCMV是如何产生的重组。 EGFP插入在通过同源重组的基因组MCMV和37089 BP 41450（M32-M31座）之间。一个EGFP protein用病毒蛋白（M32）稠和EGFP是在病毒颗粒内表达。同源重组后，病毒制剂被认为是纯当从限制稀释感染造成的所有病灶显示EGFP表达，这表明没有野生型病毒仍然存在。它可能需要多个稀释过程来纯化重组病毒。 图1A示出纯化的重组MCMV（M32-EGFP-MCMV）的EGFP信号和图1B示出了包含在病毒核心的病毒基因组M32-EGFP-MCMV粒子的TEM图像。
侧脑室注射和血管内注射
图2示出了病毒或微珠被通过ICV途径或静脉注射途径注射新生小鼠（P 0.5）的注射部位。在ICV，注射部位处于之间的中点耳朵和眼睛，在位置约0.7 - 1.0毫米外侧到矢状缝和0.7 -从新生儿前囟（ 图2A）1.0毫米尾。针应注入侧脑室2毫米深，在垂直于颅骨表面（ 图2B）。 图2C和2D表明MCMV或微珠被注入新生小鼠的颞面部静脉。一个透射和放大镜是有用的工具，能清楚地看出小静脉。
病毒颗粒/基因组和荧光微球的分布
下面的附图示出病毒颗粒/基因组和在急性期的荧光微珠的分布; 图3示出脑的冷冻切片的微珠信号。 图3A和3B示出了的0.1的分布-为0.3μm荧光尼罗红在边缘区域微珠（马萨诸塞州）（ 图3A）和脉络丛和室下区（SVZ）（ 图3B）在2小时后的ICV注射图3C和3D示出了分配的0.1 - 0.3微米的荧光尼罗红在MA和血管区域（ 图3C）和脉络丛和SVZ（ 图3D）在2小时静脉注射后微珠。它是可能的，下面的ICV和IV注射，粒子没有立即整个实质均匀扩散。相反，他们住在SVZ，MA和血管面积在急性感染期。颗粒的大小是影响它们在以下ICV和IV注射大脑在急性期分布的主要因素。 图4示出了对大脑的石蜡包埋切片的MCMV基因组的鱼。在检测到MCMV基因（绿点）SVZ在3小时后的ICV注射（ 图4B）。在MA和血管面积在3小时静脉注射后（ 图4C）检测的基因组MCMV（绿点）。的MCMV（ 图4）和微珠（ 图3）的分布十分相似。 图5示出了在大脑中的IV注射后的冷冻切片微珠的尺寸依赖分布模式。 2.2微米（ 图5B），0.1 - - 0.3微米（ 图5D），和0.04 -直径1.7微珠0.06微米（ 图5E）中分别示出。较小的微珠不得不外渗出实质的血管区域的倾向。 图6示出M32-EGFP-MCMV颗粒在脑的冷冻切片的分布。 GFP点信号（M32-EGFP-MCMV颗粒）在MA（ 图6A）主要观察脉络丛和SVZ（
图 1： 重组M32-EGFP-MCMV（A） 的超离心M32-EGFP-MCMV粒子的产生被视为通过荧光显微镜绿色斑点。比例尺：2.4微米（B）透射电子显微镜显示，M32-EGFP-MCMV的颗粒具有典型的病毒结构。比例尺：77纳米。F =“https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig1large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图2：新生小鼠的注射部位。 （A，B）侧脑室注射5微升MCMV（约5×10 5 PFU）或5微升微珠（约5.75×10 9颗粒）。（A）注射部位是耳朵和眼睛之间的中点（在一个位置约0.7 - 1.0毫米外侧到矢状缝和0.7 - 1.0毫米尾从新生儿囟）（B）27克针用10微升注射器用于注射至侧脑室深2毫米，垂直于颅骨表面。（C，D）的MCMV或微珠被注入新生小鼠的颞面部静脉。（C）的 （D）的1毫升注射器用35克针用来执行MCMV的静脉注射。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：荧光尼罗红微珠大脑中的可视化 （A，B）0.1 - 0.3微米的荧光尼罗红微球（红色）在MA（A）和脉络丛和SVZ（B）在2小时的观测信号交的ICV注射（C，D）0.1 - 。在2小时后喷射引入到通过IV注射新生小鼠大脑0.3μm的荧光尼罗红微珠。尼罗红微珠在日观察ËMA和血管区（C）和脉络丛和SVZ（D）。白色正方形中的（D）右上角的放大放大插入（A，C）比例尺：50微米（B，D）比例尺：150微米。箭头指示尼罗红微珠。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 巨细胞病毒基因组分布在小鼠脑继ICV注射和静脉注射 （A）较低倍视图。白色方块指示了放大的图像（B）被抓获。（B）的基因组MCMV（绿点）首先在SVZ在3小时后侧脑室注射检测。 DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基）用于核酸（核）染色。比例尺：30μm的（C）中的MCMV基因组（绿色点）在血管区域和脑膜在12小时静脉注射后检测。 DAPI用作核酸染色。比例尺：30微米。箭头指示代表MCMV基因（绿点）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5： 微球的直径和微珠的分布的关系荧光尼罗红微珠（50微升）被引入到静脉注射新生小鼠的大脑。在冷冻切片制备2小时后喷射，尼罗红信号（红，由箭头指示）和周围的vascul观察实质的AR区。血管面积染色荧光凝集素（绿色）（A，B）1.7 - 2.2微米微珠（A）较低倍视图。白色方块指示了放大的图像（B）被抓获（B）的白色方形被放大为（B）的右上角的放大插入（C，D）0.1 - 。0.3微米的微球（三）较低的放大倍率视图。白色方块指示了放大的图像（D）被抓获（D）白方被放大为（D）的右上角的放大插入（E，F）0.04 - 。0.06微米微珠（五）较低的放大倍率视图。白色方块指示了放大的图像（F）被抓获。（F）的白色方形被放大在右上角放大插入
图6： 在急性感染期的病毒颗粒的观察。 （A，B）的EGFP点信号（M32-EGFP-MCMV颗粒）主要在马萨诸塞观察（由箭头表示; A）中 ，脉络丛和SVZ（用箭头表示; B）在2小时后的ICV注射。白色方块被放大为（A）和（B）的右上角的放大插入。比例尺：20μm的（C，D）在3小时静脉注射后，在MCMV粒子（绿色，由箭头表示）被发现的血管区域的内外的实质（C）中 ，脉络丛和SVZ（D）的 （红色：CD31阳性细胞）。白色方块被放大如在（C）和（D）的右上角的放大的插入。比例尺：20微米请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在动物模型中，ICV，腹膜内，直接胎盘和IV感染已被用于研究病毒性脑炎的发病机制。我们专注于新生小鼠的ICV和静脉注射模型的程序简单和直接喷射粒子的利益为目标区域。虽然腹腔内感染是一个简单的方法，病毒颗粒通过间接方法5,24全身蔓延。胎盘直接感染是一个很好的方法来研究胚胎全身感染。然而，该方法需要特别的训练，以产生稳定的结果，并具有低的成功率。感染的方法也可通过胎盘的间接过程，并且难以在每次试验6，以控制喷射量成胎儿。作为新生小鼠是病毒如CMV非常敏感，在本研究中，我们可以比较的病毒颗粒的分布和受感染的细胞在很早PHAS感染如在ICV注射模型是有益的研究绕过血脑屏障25的感染行为，而第四感染模型是一种全身性感染模型类似于自然感染包括与血脑屏障病毒的相互作用。
随着ICV注射法，我们确保穿透至少为2毫米深入颅。针保持脑室内进行约10 - 20秒，以防止倒流从心室26。当用心做，ICV注入是一个快速和容易在体内的方法。然而，有时不准确注射，包括不必要的回流或针大脑可能发生的深/浅的渗透。周密的程序和观察注射后必须成功执行此协议。考虑到注射错误，仅集中在不上数量的颗粒和分布模式，并没有观察到药物的治疗效果s或在我们的研究功能性抗体。
有几个步骤来执行新生小鼠静脉注射，通过几个网站，如颞浅静脉，颈外静脉和眶后窦。新生儿的颞浅静脉容易通过使用透射和放大透镜可视化。注射可以通过一个高的成功rate.We选择颞浅静脉为静脉注射的部位一个有经验的个人来完成。在IV注射方法需要一定的训练，例如定位新生小鼠和注射过程。新生小鼠的头应该用胶带被定位为颞静脉是顶部和平坦。在35克针应该被插入到容器中足够远，该针尖完全被容器包围。一个透射和放大镜是有用的工具，能清楚地看出小静脉。大量的注射高达100微升应缓慢输注来确认的内容的流动。在注射在第一次试验的失败的情况下，时间静脉的另一侧是可用于其它试验。注射后，幼崽经验最少的痛苦和快速恢复。目前还不清楚为什么一个人出来的幼崽20的平均经历重大的痛苦和不恢复。然而，此事件最低限度损害整个实验设计的发生率低。
作为IV注射方法具有较高的成功率（80％以上）中，我们可以在分布模式与无全身性治疗，如药物或功能性抗体进行比较。之前我们已经进行，其中新生小鼠（20微克/克50微升）或同型对照抗体抗β1整合功能阻断抗体注射（50微升20微克/克）到新生小鼠的颞浅静脉的实验。一小时后抗体注射，5×10MCMV的6 PFU（50微升）分别注入颞静脉的另一侧。每仓鼠抗大鼠CD29的部分MCMV阳性细胞的数量（β1整合链，克隆HA2 / 5）与同种型抗体处理脑8的比较时， -处理的脑均显著降低。在将来的调查用同样的方法，药物或中和抗体针对病毒的影响可通过观察病毒颗粒和病毒感染细胞的分布来确定。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH 6) x 10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50x) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/ml) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC 20x | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E |
References
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