Abstract
I undersøgelsen om patogenesen af virale encephalitis, infektionen metoden er kritisk. Den første af de to vigtigste smitsomme ruter til hjernen er den hæmatogen rute, som indebærer infektion af endotelceller og pericytter i hjernen. Det andet er intracerebroventrikulær (ICV) rute. Gang inden for det centrale nervesystem (CNS), kan virus spredes til subarachnoidealrummet, hjernehinderne, og choroid plexus via cerebrospinalvæsken. I eksperimentelle modeller, er de tidligste stadier af CNS viral fordeling ikke godt karakteriseret, og det er uklart, om kun bestemte celler oprindeligt er inficeret. Her har vi analyseret fordelingen af cytomegalovirus (CMV) partikler under den akutte fase af infektion, betegnet primære viræmi, efter ICV eller intravaskulær (IV) injektion i neonatal musehjerne. I ICV injektion model blev 5 pi murin CMV (MCMV) eller fluorescerende mikroperler injiceret i den laterale ventrikel ved midpoint mellem øret og øjet under anvendelse af en 10-pi sprøjte med en 27 G nål. I IV injektion model, blev en 1 ml sprøjte med en 35 G nål anvendes. En transilluminator blev anvendt til at visualisere den overfladiske temporale (facial) vene i neonatale mus. Vi infused 50 pi MCMV eller fluorescerende mikroperler i den overfladiske temporale vene. Hjerner blev høstet på forskellige tidspunkter efter injektion. MCMV genomer blev påvist under anvendelse af in situ hybridisering metode. Fluorescerende mikroperler eller grønt fluorescerende protein udtrykker rekombinante MCMV partikler blev observeret af fluorescensmikroskopi. Disse teknikker kan anvendes på mange andre patogener til at undersøge patogenesen af encephalitis.
Introduction
Når man studerer viral encephalitis, den indledende fordeling af viruspartikler er meget vigtigt at forstå sygdommen patogenese og identificere virale mål i hjernen. De fleste vira varierer i størrelse fra 20 til 300 nm, selv om pandoravirus er mere end 700 nm i størrelse 1. Fordelingen af de virale partikler i den akutte fase af infektion kan afhænge af størrelsen af partiklerne, fordelingen af cellulære receptorer eller affiniteten af de cellulære receptorer for virus. I dyremodeller, intracerebroventrikulær (ICV), intraperitoneal, direkte placenta, og intravenøs (IV) infektioner er blevet anvendt til at studere patogenesen af virale encephalitis. ICV inokulation med virus bruges ofte til at oprette centrale nervesystem (CNS) infektioner i mus. Undersøgelser ved hjælp af denne teknik rapporterer udbredt infektion, især af celler i periventrikulære zoner og i områder af hjernen i direkte kontakt med cerebrospinalvæske (CSF), Similar over for virkningerne af viral ventriculoencephalitis. Den lille størrelse af adenoassocieret virus (AAV) partikler (20 - 25 Nm i diameter) letter deres udbredelse i hele hjernen i ICV infektioner 2-4. Intraperitoneale 5, direkte placenta 6, og IV injektioner 7 repræsenterer hematogenic systemisk administration. Indtrængen af viruspartikler gennem blod-hjerne-barrieren (BBB) tillader dem at nå parenkym af neonatal hjerne, svarende diffuse mikrogliaceller knuder 8,9.
Cytomegalovirus (CMV) er en almindelig virus, der hører til herpes virus-familien. I USA, 50% - har 80% af de mennesker havde CMV-infektion efter alder 40. CMV-infektioner er sjældent skadeligt, men kan forårsage sygdomme hos immunkompromitterede patienter og fostre. Af alle leverancer, 0,2% - er 2% født med CMV 10, hvilket resulterer i alvorlige symptomer såsom microcephaly, periventricular forkalkning, cerebellar hypoplasi, microphthalmitis, og synsnerven atrofi 11,12. Desuden opstår mental retardering, sensorineuralt høretab, visuelle defekter, beslaglæggelse, og epilepsi i omkring 10% af ikke-dødeligt CMV-inficerede spædbørn 13,14. CNS-dysfunktion er den mest almindelige karakteristiske symptomer på CMV medfødt anomali. Flere børn er permanent deaktiveret hvert år af medfødt CMV end ved Downs syndrom, føtalt alkoholsyndrom eller rygmarvsbrok 15. Der er ikke blevet vaccineret mod CMV rådighed på nuværende tidspunkt, der opfordrer til et behov for en sikker og effektiv vaccine. Studer interaktionen af CMV-partikler med deres receptorer i den tidligste fase af infektion er vigtigt at forstå virkningen af vaccination.
Ventriculoencephalitis og diffuse microgliale knuder er de to vigtigste patologiske karakteristika CMV encephalitis 16. Det har været usikkert, hvordan de CMV-partikler (150 - 300 nm) spredes gennem hjernen i den akutte fase af infektion and hvordan fordelingen af cellulære receptorer og deres affinitet for vira bidrager til viral spredning. Kawasaki et al. Har evalueret ICV og IV infektioner fra perspektivet af fordelingen af partikler og deres receptorer (β1 integrin) i den tidligste fase af infektion. Vi har fundet, at formidling af CMV partikler og udtryk for β1 integrin er godt korreleret i den tidligste fase af infektion i både ICV og IV infektioner 8. ICV-infektion er en model af ventriculoencephalitis og IV infektion er en model af diffuse microgliale knuder. Studer dynamik virale eller fluorescerende partikler ville give nyttige oplysninger om virkningen af partikelstørrelse, virale interaktioner med cellulære receptorer, og mekanismen for BBB penetration i hjernen. Følgende protokol kan anvendes til at undersøge enhver viral infektion og viral vektor i CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de eksperimentelle protokoller blev godkendt af Animal Care udvalg Hamamatsu Universitet School of Medicine.
1. Fremstilling af MCMV (Smith-stamme) og rekombinant M32-forstærket grønt fluorescerende protein (EGFP) -MCMV
- Generere rekombinant M32-EGFP-MCMV ifølge fremgangsmåden som følger (1,2 - 1,9) og som tidligere beskrevet 8.
- Brug rekombinante vira afledt fra Smith stammen af vildtype MCMV (accession nummer: U68299). Indsæt EGFP (4.361 basepar; bp) mellem 37.089 og 41.450 bp (M32 - M31 locus) i MCMV genomet ved homolog rekombination.
- Amplificere ved polymerasekædereaktion MCMV M32 (41.450 - 39.286 bp, venstre flankerende sekvens og M31 (37.089 - 39.246 bp, højre flankerende sekvens gen loci under anvendelse af følgende primere: M32, 5'-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(fremadrettet primer), 5 '-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT3 '(revers primer), M31, 5'-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3' (fremadrettet primer), 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 '(revers primer).
- Sæt M32 locus i EGFP-udtrykkende vektor ved anvendelse Nhel- og BamHI restriktionssites. Sæt M31 locus i M32-EGFP -recombinant plasmid bruge Aflll og Xbal sites. Spaltning af M32 - EGFP - M31 sekvens med NheI og AflII fra M32 - EGFP - M31 rekombination plasmid og opløses i H 2 O.
- Transficere den spaltede konstruktionen i kernerne i MCMV (Smith-stamme) inficerede NIH3T3-celler 24 timer efter infektion (HPI) under anvendelse af et elektroporation system til at inducere homolog rekombination.
- På 3 dage efter infektion, co-kultur cellerne med ikke-inficerede muse embryonale fibroblaster (MEF'er) ved et forhold på 1 / 1.000 i seks-brønds plader og screening for EGFP-udtrykkende foci af inficerede celler.
- Harvest de virusholdige supernatanter fra brøndene indeholdende grønt fluorescerende foci og fortyndet ti gange. Til rensning vælge brønde, der viser enkelte grønne fluorescerende foci.
- Når al foci fremkommer ved begrænsende fortynding infektion display EGFP-ekspression, viruspræparatet er ren, hvilket indikerer, at ingen vildtype virus forbliver. Kvantificere virus ved plaque-assay-metoden som tidligere beskrevet 17.
- Forkæl MCMV i certificerede biosikkerhed kabinetter på biosikkerhed niveau 2 iført handsker og maske.
- Passage MCMV (Smith-stamme) og rekombinant MCMV i MEF'er fremstillet ud fra 12 dage gamle ICR mus embryoner som tidligere beskrevet 17.
- Fjerne celler fra supernatanterne af inficerede MEF kulturer ved centrifugering ved 3000 x g i 20 minutter ved 16 ° C.
- Ultracentrifuge supernatanterne i 40 minutter ved 70.000 x g. Resuspendere pellets indeholdende virionerne i 1 ml Tris-bufret saltvand og overførsel til en foruddannet lineær sorbitol gradient (25% - 70%). Ultracentrifuge igen ved 70.000 x g i 60 minutter 18.
- Høst virionet-holdige bånd med en sprøjte. Pelletering af høstede virioner med yderligere ultracentrifugeringstrin på 70.000 x g i 40 min.
- Pellet resuspenderes i 1 ml phosphatbufret saltvand (PBS) og opbevares ved -80 ° C indtil infektionen eksperimenter.
- Kvantificere virustiteren ved plaque-assay-metoden som tidligere beskrevet 19.
- Visualisere EGFP ekspression af de rekombinante MCMV partikler (excitation ved 489 nm, emission ved 508 nm) ved fluorescensmikroskopi (Figur 1A) og partikelstrukturen ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) 8 (figur 1B).
2. Udarbejdelse af Nile Red Fluorescerende Microbeads
- Køb carboxyl fluorescerende nilrødt mikroperler og placere 500 pi mikroperler i rør ifølge diameter (0,04- 0,06 um, ca. 3,63 × 10 12 partikler; 0,1 - 0,3 um, ca. 5,75 × 10 10 partikler; og 1,7 - 2.2 um, ca. 6,85 × 10 7 partikler).
- Behandl perler med 500 pi 0,1 M NaOH i ca. 1 dag til fjerne eventuelle endotoksiner og resuspender perlerne i sterilt vand ved stuetemperatur.
- Adsorbere perlerne O / N med 10% museserum opnået fra C57BL / 6-mus ved stuetemperatur før anvendelse.
- For at adskille aggregater, vortex perlerne og lydbehandling grundigt før brug.
3. ICV Injektion af MCMV og fluorescerende Microbeads i neonatale mus
- Opretholde normale gravide ICR mus i en temperatur-kontrolleret facilitet under en 12 timers lys / mørke cyklus. De nyfødte er betegnet som P 0.5 på dagen for fødslen.
- Sterilisere en 10-pi sprøjte og en 27 G nål med 70% alkohol.
- Læg injektionsopløsningen (5 pi), der indeholder MCMV eller fluorescerende mikroperler ind kanylen ved forsigtigt at trække stemplet i sprøjten.
- Begrænse neonatal mus (P 0,5) ved at sætte musen på is i 3 - 4 minutter. Når dyret er under anæstesi, bruge tå-pinch respons metode til at bestemme dybden af anæstesi.
- Mark injektionsstedet med en ikke-toksisk laboratorium pen på en beliggenhed ca. 0,7 - 1,0 mm lateralt for det sagittale sutur og 0,7 - 1,0 mm caudale fra det neonatale bregma (figur 2A).
- Stik nålen 2 mm dybe, vinkelret på kraniet overflade på den markerede injektionsstedet. Som reference mark 2 mm fra spidsen af nålen med en ikke-toksisk maker.
- Langsomt injicere 5 pi MCMV (ca. 5 x 10 5 PFU) i den laterale ventrikel uden at åbne hovedbunden (figur 2B).
- I en anden gruppe af mus, indsprøjte en 5 pi opløsning indeholdende fluorescerende mikroperler (0,1 - 0,3 um, ca. 5,75 × 10 8 partikler) vedden samme metode.
- Fjern langsomt nålen 10 - 20 sek efter ophørende stemplet bevægelse for at forhindre tilbagestrømning.
- For at komme sig, holde musene i 5 - 10 min i en varm beholder indtil bevægelse og generel lydhørhed genoprettes.
- Høst hjernerne som beskrevet i afsnit 5 ved en række tidspunkter (3, 12, 24, 48 og 72 timer) efter injektion.
4. IV Injektion af MCMV eller fluorescerende Microbeads i neonatale mus
- Begrænse neonatal mus (P 0,5) ved at sætte musen på is i 3 - 4 minutter.
- Brug en 1 ml sprøjte med en 35 G nål til at udføre den intravenøse injektion af MCMV i P 0,5 nyfødte.
- Brug en transilluminator (vene finderen) at visualisere den overfladiske tidsmæssige (facial) vene. Før injektion, fastgør den nyfødte til transilluminator hjælp kirurgisk tape (figur 2C).
- Mens iført forstørrelsesglas (1,5X), langsomt indgyde 50 gi MCMV (ca. 5,45 ×; 10 9 partikler) eller fluorescerende mikroperler (0,04 - 0,06 um, ca. 3,63 × 10 11 partikler; 0,1 - 0,3 um, ca. 5,75 × 10 9 partikler, og 1,7 - 2,2 um, ca. 6,85 × 10 6 partikler) i det overfladiske temporale vene (Figur 2D).
- Efter fjernelse af nålen, bruge gaze indeholder 70% alkohol til at lægge pres på injektionsstedet, indtil blødningen er ophørt.
- Giv den nyfødte ca. 5 min i en varm beholder til at inddrive inden den sendes tilbage til buret.
- Høst hjernerne som beskrevet i afsnit 5 ved en række tidspunkter (3, 12, 24 og 72 timer) efter injektion.
5. Brain Tissue Sample Forberedelse til Paraffinsnit
- Placer de injicerede nyfødte i en lille plastik skål på knust is.
- Når dyret er under anæstesi, bruge tå-pinch respons metode til at bestemme dybden af anesthesia.
- Lav en central eller to ende vandrette ende skærer gennem brystkassen at åbne brysthulen.
- Lav et snit i atrium med skarpe saks. Indgyde 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning i atrium. Stop perfusion, når der konstateres spontan bevægelse (PFA dans) og lettet-farve af leveren. Må ikke exsanguinate.
- Dissekere nyfødte (som tidligere beskrevet 20) ved først at fjerne hovedet under anvendelse af en saks.
- Foretag en midtlinjeincision langs Integument fra halsen til næsen for at blotlægge kraniet.
- Anbring den skarpe ende af et par af iris saks i foramen magnum på den ene side, omhyggeligt glide langs den indre overflade af kraniet.
- Lave et snit, der strækker sig til den distale kant af den bageste kraniet overflade, og foretage en identisk snit på den kontralaterale side. Ryd væk kraniet omkring lillehjernen.
- Træk forsigtigt tilbage kraniet på den ene side at undgå beskadigelse af hjernen. Gentag detteprocedure på den anden side af hjernen.
- Ved hjælp af en spatel, skille de olfaktoriske pærer og nervøse forbindelser langs den ventrale overflade af hjernen.
- Forsigtigt adskille hjernen fra hovedet, trimning enhver dura, der stadig forbinde hjernen til kraniet med en saks, og fjern hjernen.
- Placer hjernen i et hætteglas med fiksativ indeholdende 4% PFA mindst 10 gange volumenet af hjernen i 24 timer ved 4 ° C.
- Dehydrere væv gennem en serie af graduerede ethanol bade at fortrænge vand og derefter infiltrere med paraffinvoks og danner en blok. Skær paraffin blok med en mikrotom i skiver 4 um tyk 21.
- Afparaffiniser og rehydrere de lysbilleder af de inficerede hjerner 22. Fortsæt til in situ hybridisering til paraffin indlejrede sektioner.
6. Brain Tissue Prøveforberedelse for frosne Sektioner
- Fjern hjernen efter trinene i 5,1-5,11.
- At observere de fluorescerende mikrokugler og M32-EGFP-MCMV placere resekterede hjerne på flade bund cryomolds. Tilføj indlejring medium til helt at dække hjernen prøven. Snap fryse cryomolds i forkølede n-hexan (-80 ºC), ved hjælp af en pincet til at holde kanten af cryomolds før det sidder i borepatronen.
- For sektionering, vedhæfte den frosne væv blok på forkølede kryostat chuck. Overfør det frosne væv med borepatronen i en kryostatkammeret og sænke temperaturen til mellem -10 og -20 ° C, og skæres skiverne ca. 8 - 10 um tykke 23.
- Fastgør sektioner med cytofixative (blanding af isopropylalkohol og polyethylenglycol) ved sprøjtning. Lufttørre sektionerne i 30 minutter ved RT umiddelbart efter sprøjtning, og gemme dem på - 80 ºC indtil videre anvendelse.
- Ækvilibrere afsnittene tilbage til RT og vaske tre gange med PBS.
- Farv afsnittene med fluorescein (FITC) -konjugeret Griffonia simplicifolia isolectin B4 i en koncentration på 1: 100 i 10 minutter i PBS ved RT (figur 5) eller med PE-konjugeret CD31-antistof i en koncentration på 1: 100 i 30 minutter i PBS ved stuetemperatur (figur 6).
- Vask sektioner med PBS tre gange.
- Efter vask, farvning af sektioner med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til at visualisere cellekerner. Monter afsnittene i anti-fade reagens og billede DAPI (excitation ved 345 nm, emission ved 455 nm), EGFP (excitation ved 489 nm, emission ved 508 nm), og Nilen rød (excitation ved 553 nm, emission ved 637 nm) med et fluorescerende mikroskop (figur 3, 5, 6).
7. Fluorescerende in situ hybridisering (FISH) for Paraffin Embedded Sektioner
- Forbered FISH-proben mærkes direkte med fluorofor for DNA in situ hybridisering ved nick-translation under anvendelse af et bakterielt kunstigt kromosom, som indeholder hele MCMV DNA genogle (pSM3fr) 19. Koncentrationen af FISH-proben er 0,1 pg / pl.
- Afparaffiniser og rehydrere de lysbilleder af de inficerede hjerner 22.
- Behandl vævssnit med RNase (100 ug / ml i PBS) for at detektere virus-DNA.
- Udføre antigen-genvinding med en 0,05% NP40, 0,01 M citratpuffer (pH 6,0) ved 95 - 98 ° C i 20 min. Køle objektglassene ned til stuetemperatur i 20 minutter.
- I et glas Coplin-farvning krukke vaskes objektglassene i rent vand tre gange i 2 minutter hver gang. Udfør en yderligere antigen hentning trin med en 0,06% pepsin, 0,01 N HCI-opløsning i 5 minutter ved 37 ° C.
- Skyl objektglassene tre gange i rent vand i 2 minutter hver gang i et glas Coplin-farvning krukke.
- Dehydrere vævssnit igen ved at overføre objektglassene fra 70% ethanol, 85% ethanol, og derefter til 100% ethanol.
- Til fremstilling 10 ml hybridiseringsbufferen, blandes 1,25 ml in situ hybridisering salte (3 M NaCl, 100 mM TrisHCI pH 8,0, 100 mM natriumphosphat pH 6,8, 50 mM EDTA) med 5 ml deioniseret formamid, 2,5 ml 50% dextransulfat, 250 pi 50x Denhardts opløsning, 125 pi 100 mg / ml tRNA, og 875 pi H 2 O.
- Fortynd DNA-proben er direkte mærket med fluoroforer, som genkender hele MCMV genomet tilfældigt i hybridiseringspuffer. Slutvolumenet bør være 10 pi (7 pi hybridiseringsbufferkomponenterne, 1 pi probe (0,1 pg / pl), og 2 pi destilleret vand).
- Tilføj sonden mix (10 pi) til hvert dias og dække med et dækglas (15 × 15 mm). Forsegl dækglasset med gummi cement. Denaturere probe mix i 5 minutter ved 85 ° C, og fuldføre hybridiseringstrinnet O / N ved 42 ° C.
- Vask dias med 0,3% NP40, 0,4x SSC ved 73 ° C i 2 minutter; med 0,1% NP40, 0,4x SSC ved 73 ° C i 1 min; og med 2 x SSC to gange.
- Kontrastfarve kernerne med DAPI (10 ng / ml) og dækker dias med et dækglas.
- Mountafsnittene i anti-fade reagens og billede DAPI (excitation ved 345 nm, emission ved 455 nm) og EGFP (excitation ved 489 nm, emission ved 508 nm) med et fluorescerende mikroskop (Figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I undersøgelser af patogenesen af virale encephalitis, infektionen metode er vigtig. Den hæmatogen rute udgør en akut infektion af endotelceller og pericytter i hjernen, mens ICV rute udgør en akut infektion spredes via CSF gennem subarachnoidealrummet, når ned til meninges og choroid plexus. For at analysere den første fordeling af partikler i akut encephalitis, in situ hybridisering detektering mCMV genomer og direkte observation af M32-EGFP-MCMV partikler eller fluorescerende mikroperler blev anvendt.
Generation af rekombinant MCMV (M32-EGFP-MCMV)
Protokollen illustrerer, hvordan rekombinant M32-GFP-MCMV blev genereret. EGFP blev indsat mellem 37.089 og 41.450 bp (M32-M31 locus) i MCMV genomet ved homolog rekombination. En EGFP protein blev fusioneret med et viralt protein (M32) og EGFP blev udtrykt i de virale partikler. Efter homolog rekombination blev en viruspræparat anses rent, når alle foci fremkommer ved begrænsende fortynding infektion vises EGFP-ekspression, hvilket indikerer, at ingen vildtypevirus blev tilbage. Det kan tage flere fortyndingsprocedurer at oprense det rekombinante virus. Figur 1A viser EGFP signaler af oprenset rekombinant MCMV (M32-EGFP-MCMV) og Figur 1B viser et TEM billede af M32-EGFP-MCMV partikler indeholdende virusgenomet i den virale kerne .
Intracerebroventrikulær Injektion og intravaskulær injektion
Figur 2 viser injektionsstederne af neonatal mus (P 0,5), hvor virus eller mikroperler blev injiceret gennem ICV rute eller intravenøst. I ICV, injektionsstedet er ved midtpunktet mellemøret og øjet, på et sted ca. 0,7 - 1,0 mm lateralt til den sagittale sutur og 0,7 - 1,0 mm caudale fra det neonatale bregma (figur 2A). Nålen bør injiceres i den laterale ventrikel 2 mm dybe, vinkelret på kraniet overflade (figur 2B). Figur 2C og 2D viser, at MCMV eller mikroperler injiceres i den tidsmæssige facial vene neonatale mus. A transilluminator og forstørrelsesglas er nyttige værktøjer til klart visualisere små vener.
Fordelingen af viruspartikler / genomer og Fluorescerende Microbeads
De følgende figurer viser fordelingen af virale partikler / genomer og fluorescerende mikroperler i den akutte fase. Figur 3 viser mikroperlen signaler af frosne snit af hjernen. Figur 3A og 3B viser denfordeling af de 0,1 -. 0,3 um fluorescerende nilrødt mikroperler i det marginale område (MA) (figur 3A) og choroid plexus og subventrikulære zone (SVZ) (figur 3B) ved 2 timer efter ICV injektion figur 3C og 3D viser fordelingen af de 0,1 - 0,3 um fluorescerende nilrødt mikroperler i MA og vaskulære område (figur 3C) og choroid plexus og SVZ (figur 3D) ved 2 timer efter iv injektion. Det er sandsynligt, at efter ICV og IV injektion partikler ikke straks fordelt ensartet over parenkym. Tværtimod, de holdt i SVZ, MA, og vaskulær område i den akutte infektion fase. Størrelsen af partiklerne er den primære faktor, der påvirker deres fordeling i hjernen i den akutte fase efter ICV og IV injektion. Figur 4 viser fisk af MCMV-genomet på paraffinindlejrede sektioner af hjernen. MCMV genom (grønne pletter) blev påvist iSVZ på 3 timer efter ICV injektion (figur 4B). MCMV genomer (grønne pletter) blev påvist i MA og vaskulær område på 3 timer efter IV injektion (figur 4C). Fordelingen af MCMV (figur 4) og mikroperler (figur 3) var temmelig ens. Figur 5 viser størrelsen-afhængige spredningsmønster mikroperler i frosne snit af hjernen efter IV injektion. Mikroperler med diametre 1,7 - 2,2 um (figur 5B), 0,1 - 0,3 um (fig 5D), og 0,04 - 0,06 um (figur 5E) er vist henholdsvis. Mindre mikroperler havde en tendens til at blive ekstravaseret ud af det vaskulære område i parenkym. Figur 6 viser fordelingen af M32-EGFP-MCMV-partikler i de frosne snit af hjernen. GFP dot signaler (M32-EGFP-MCMV partikler) blev primært observeret i MA (figur 6A) og choroid plexus og SVZ (
Figur 1:. Fremstilling af rekombinant M32-EGFP-MCMV (A) ultracentrifugeret M32-EGFP-MCMV partikler ses som grønne pletter ved fluorescensmikroskopi. Målestok:. 2.4 um (B) Transmission elektronmikroskopi afslører, at M32-EGFP-MCMV partikler i besiddelse af en typisk virus struktur. Scale bar: 77 nm.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Injection steder i Neonatal Mouse. (A, B) ICV injektion af 5 pi MCMV (ca. 5 x 10 5 PFU) eller af 5 ul mikroperler (ca. 5,75 × 10 9 partikler). (A) injektionsstedet er ved midtpunktet mellem øret og øjet (på en beliggenhed cirka 0,7 - 1,0 mm lateralt til den sagittale sutur og 0,7 -. 1,0 mm caudale fra det neonatale bregma) (B) en 27 G nål med en 10-pi sprøjte anvendes til injektion i den laterale ventrikel 2 mm dyb, vinkelret på kraniet overflade. (C, D) MCMV eller mikroperler injiceres i den tidsmæssige facial vene neonatale mus. (C) (D) En 1-ml sprøjte med en 35 G nål bruges til at udføre IV injektion af MCMV. Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 3: Visualisering af fluorescerende Nile Red Microbeads i hjernen (A, B) 0.1 - 0.3 um fluorescerende nilrødt mikroperler signaler (rød) der observeres i MA (A) og choroid plexus og SVZ (B) ved 2 timer stolpe ICV injektion (C, D) 0,1 -. 0,3 um fluorescerende nilrødt mikroperler indført i neonatal musehjerne ved IV injektion ved 2 timer efter injektion. Nile røde mikrokugler observeres i the MA og vaskulær område (C) og chorioideus plexus og SVZ (D). Den hvide firkant er forstørret i den udvidede indsats i øverste højre hjørne af (D) (A, C) Målestok:. 50 pm (B, D) Målestok:. 150 um. Pile angiver Nile røde mikrokugler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: MCMV Genome Distribution i Mouse Brain Efter ICV Injektion og IV Injection (A) Den nedre forstørrelse.. Den hvide firkant angiver, hvor det forstørrede billede (B) blev fanget. (B) den MCMV genomet (grønne pletter) først detekteres i SVZ'en ved 3 timer efter ICV injektion. DAPI (4 ';, 6-diamidino-2-phenylindol) anvendes til nuklear syre (nuklear) farvning. Målestok:. 30 um (C) The MCMV genom (grønne pletter) detekteres i det vaskulære område og meninges ved 12 timer efter IV injektion. DAPI anvendes til nuklear syre farvning. Målestok: 30 um. Pile angiver repræsentative MCMV genom (grønne pletter). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Forholdet mellem diameter Microbeads og distribution af mikroperlerne Fluorescent Nile røde mikrokugler (50 pi) indføres i neonatal musehjerner ved IV injektion. I frosne snit forberedt to timer efter injektion, Nile røde signaler (rød, angivet med pile) overholdes i og omkring Vascular område af parenkym. Det vaskulære område er farvet med fluorescerende lectin (grøn) (A, B) 1.7 -.. 2.2 um mikroperler (A) den lavere forstørrelse. Den hvide firkant angiver, hvor det forstørrede billede (B) blev fanget (B) Den hvide firkant er forstørret som det udvidede indsats i øverste højre hjørne af (B) (C, D) 0,1 -... 0,3 um mikroperler (C) Den lavere forstørrelse. Den hvide firkant angiver, hvor det forstørrede billede (D) blev fanget (D) Den hvide firkant er forstørret som det udvidede indsats i øverste højre hjørne af (D) (E, F) 0,04 -... 0,06 um mikroperler (E) Den lavere forstørrelse. Den hvide firkant angiver, hvor det forstørrede billede (F) blev fanget. (F) Den hvide firkant er forstørret som det udvidede indsats i øverste højre hjørne af
Figur 6: Observation af viruspartikler i den akutte infektion fase. (A, B) EGFP dot signaler (M32-EGFP-MCMV partikler) er hovedsageligt observeret i MA (angivet med pile, A), choroid plexus, og SVZ (angivet med pile b) ved 2 timer efter ICV injektion. De hvide firkanter er forstørret som de forstørrede indsætter i øverste højre hjørne af (A) og (B). Målestok:. 20 um (C, D) ved 3 timer efter IV injektion mCMV partikler (grøn, angivet med pile) fundet i og uden for det vaskulære områdeparenchym (C), choroid plexus, og SVZ (D) (rød: CD31-positive celler). De hvide firkanter er forstørret som de forstørrede indsætter i øverste højre hjørne af (C) og (D). Målestok:. 20 pm Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dyremodeller, ICV, intraperitoneale, direkte placenta og IV infektioner er blevet anvendt til at undersøge patogenesen af virale encephalitis. Vi fokuserede på ICV og IV injektion modeller af neonatale mus til enkelheden af procedurerne og fordelen ved direkte injektion af partikler ind i målområdet. Selvom intraperitoneal infektion er en nem metode, viruspartikler spredes systemisk via en indirekte proces 5,24. Direkte placenta infektion er en god metode til at studere embryonale systemisk infektion. Men denne metode kræver særlig uddannelse til opnåelse stabile resultater og har en lav succesrate. Infektionen Fremgangsmåden er også en indirekte proces gennem placenta og det er vanskeligt at styre mængden af injektion i fosteret ved hvert forsøg 6. Som den neonatale mus er meget modtagelige for vira, såsom CMV, i denne undersøgelse kunne vi sammenligne fordelingen af viruspartikler og af inficerede celler ved de meget tidlige PHA'ere for infektion. ICV injektion model er gavnligt at studere infektionen adfærd, der omgår BBB 25, hvorimod IV infektion model er en systemisk infektion model ligner naturlig infektion, herunder interaktionen af viruset med BBB.
Med ICV injektion metode, vi sørget for at trænge mindst 2 mm dybt ind i kraniet. Nålen blev holdt inde i de cerebrale ventrikler for cirka 10 - 20 sek for at forhindre tilbagestrømning fra ventriklerne 26. Når udføres omhyggeligt, ICV injektion er hurtig og nem in vivo-metoden. Men undertiden unøjagtige injektioner herunder uønsket tilbagestrømning eller dyb / overfladisk indtrængning af nålen til hjernen kan ske. Omhyggelige procedurer og observationer efter injektion er forpligtet til at udføre denne protokol med succes. I betragtning af de injektion fejl, vi kun fokuseret på de spredningsmønstre for partiklerne og ikke på mængden, og ikke observere behandlingseffekt af narkotikas eller funktionelle antistoffer i vores undersøgelse.
Der er flere procedurer til at udføre det murine neonatal IV injektion, gennem flere steder såsom overfladiske tidsmæssige vener, ekstern halsvene, og retro-orbital sinus. Den overfladiske temporale vene for neonatal let visualiseres ved anvendelse af en transilluminator og forstørrelse linse. Injektion kan være afsluttet ved en enkelt erfaren person med en høj succesrate rate.We valgte den overfladiske tidsmæssige vene som stedet for IV-injektion. Den IV injektion metode kræver en vis uddannelse, såsom at placere neonatal mus og injektionsproceduren. Lederen af den neonatale mus skal placeres med tape for den tidsmæssige vene at være på toppen og flad. Den 35 G nål bør indsættes i beholderen langt nok, at spidsen af nålen er helt omgivet af fartøjet. A transilluminator og forstørrelsesglas er nyttige værktøjer til klart visualisere små vener. Injektion af store volumener op til 100pi skal infunderes langsomt at bekræfte strømmen af indholdet. I tilfælde af svigt af injektionen ved første forsøg, den anden side af den tidsmæssige vene er tilgængelig for en anden undersøgelse. Efter injektion, hvalpe opleve minimal nød og komme sig hurtigt. Det er ikke klart, hvorfor et gennemsnit på én ud af 20 unger oplever stor nød og ikke komme sig. Men den lave forekomst af denne begivenhed minimalt skader hele eksperimentelle design.
Som iv injektion metode har en høj succesrate (over 80%), kunne vi sammenligne mønsteret fordelingen med og uden systemiske behandlinger såsom lægemidler eller funktionelle antistoffer. Vi har tidligere udført et eksperiment, hvor neonatale mus blev injiceret med anti-β1 integrin funktionelle blokerende antistoffer (50 pi ved 20 ug / g) eller isotypekontrol-antistoffer (50 pi ved 20 ug / g) i den overfladiske temporale vene neonatale mus. En time efter antistof injektionen, 5 × 106 PFU (50 pi) af MCMV blev infunderet i den anden side af den tidsmæssige vene. Antallet af MCMV-positive celler per sektion af hamster-anti-rotte-CD29 (β1 integrin kæde, klone Ha2 / 5) -behandlet hjerne var betydeligt lavere, når man sammenligner med den for isotype antistof-behandlede hjerne 8. Under anvendelse af den samme fremgangsmåde i fremtidige undersøgelser kan virkningen af lægemidler eller neutraliserende antistoffer mod virus bestemmes ved at observere fordelingen af virale partikler og inficerede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH 6) x 10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50x) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/ml) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC 20x | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E |
References
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
- Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
- Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. (93), e52037 (2014).
- Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
- Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
- Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
- Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
- Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
- Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
- Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
- Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
- Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
- Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13 (2010).
- Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308 (2007).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
- Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863 (2014).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).
