Abstract
Dans l'étude sur la pathogenèse de l'encéphalite virale, la méthode d'infection est critique. La première des deux voies principales infectieuses vers le cerveau est la voie hématogène, ce qui implique l'infection des cellules et les pericytes du cerveau endothéliales. Le second est le intracérébroventriculaire (ICV) itinéraire. Une fois dans le système nerveux central (SNC), les virus peuvent se propager dans l'espace sous-arachnoïdien, des méninges et plexus choroïde par le liquide céphalorachidien. Dans des modèles expérimentaux, les premiers stades de la distribution virale CNS ne sont pas bien caractérisées, et il est difficile de savoir si seules certaines cellules sont initialement infectées. Ici, nous avons analysé la distribution du cytomégalovirus (CMV) particules pendant la phase aiguë de l'infection, appelée virémie primaire, suivant ICV ou intravasculaire (IV) l'injection dans le cerveau de souris néonatale. Dans le modèle d'injection ICV, 5 pi de CMV murin (MCMV), ou des microbilles fluorescentes ont été injectées dans le ventricule latéral du midpoint entre l'oreille et l'oeil en utilisant une seringue de 10 ul avec une aiguille 27G. Dans le modèle d'injection intraveineuse, une seringue de 1 ml avec une aiguille de 35 G a été utilisée. Un transilluminateur a été utilisé pour visualiser le temps (faciale) veine superficielle de la souris néonatale. Nous infusé 50 pi de MCMV ou microbilles fluorescentes dans la veine temporale superficielle. Les cerveaux ont été récoltés à différents moments après l'injection. Génomes Mcmv ont été détectés en utilisant la méthode dans d'hybridation in situ. microbilles fluorescentes ou protéine fluorescente verte exprimant des particules Mcmv recombinantes ont été observées par microscopie à fluorescence. Ces techniques peuvent être appliquées à de nombreux autres agents pathogènes pour étudier la pathogenèse de l'encéphalite.
Introduction
Lorsque l'on étudie l'encéphalite virale, la distribution initiale des particules virales est très important de comprendre la pathogenèse de la maladie et d'identifier des cibles virales dans le cerveau. La plupart des virus varient en taille de 20 à 300 nm, bien que la pandoravirus est supérieure à 700 nm de taille 1. La distribution des particules virales dans la phase aiguë de l'infection peut dépendre de la taille des particules, la distribution des récepteurs cellulaires, ou l'affinité des récepteurs cellulaires pour le virus. Dans les modèles animaux, intracérébroventriculaire (ICV), intrapéritonéale, placentaires directe, et par voie intraveineuse (IV) infections ont été utilisées pour étudier la pathogenèse de l'encéphalite virale. ICV inoculation du virus est souvent utilisé pour établir le système nerveux (SNC) chez les souris centrales. Les études utilisant cette technique signalent une infection généralisée, en particulier de cellules dans les zones périventriculaires et dans les régions du cerveau en contact direct avec le liquide céphalo-rachidien (LCR), similar aux effets de ventriculoencephalitis virale. La petite taille du virus adéno-associé (AAV) , des particules (20 à 25 nm de diamètre) facilite leur diffusion dans le cerveau , dans les infections ICV 2-4. Intrapéritonéal 5, placentaires directe 6, et IV injections 7 représentent l' administration systémique hématogène. La pénétration des particules virales à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) leur permet d'atteindre le parenchyme du cerveau du nouveau - né, ce qui représente des nodules microgliales diffuses 8,9.
Cytomégalovirus (CMV) est un virus commun qui appartient à la famille des virus de l'herpès. Aux États-Unis, 50% - 80% des gens ont eu une infection à CMV par âge 40. les infections à CMV sont rarement dangereux, mais peuvent causer des maladies chez les patients immunodéprimés et les fœtus. De toutes les livraisons, 0,2% - 2% sont nés avec CMV 10, entraînant des symptômes sévères tels que microcéphalie, calcifications périventriculaires, hypoplasie cérébelleuse, microphtalmie, et le nerf optique atrophie 11,12. En outre, le retard mental, la surdité de perception, les défauts visuels, la saisie et l' épilepsie surviennent chez environ 10% des nourrissons infectées par le CMV non mortellement 13,14. un dysfonctionnement du SNC est le symptôme caractéristique la plus commune de CMV anomalie congénitale. Plus d' enfants sont handicapés de façon permanente chaque année par CMV congénitale que par le syndrome de Down, le syndrome d'alcoolisme foetal, ou le spina - bifida 15. Il n'y a pas de vaccins contre le CMV disponible à l'heure actuelle, appelant à un besoin d'un vaccin sûr et efficace. L'étude de l'interaction des particules CMV avec leurs récepteurs dans la première phase de l'infection est important de comprendre l'effet de la vaccination.
Ventriculoencephalitis et nodules microgliales diffuses sont les deux principales caractéristiques pathologiques de CMV encéphalite 16. Il a été incertain comment les particules CMV (150-300 nm) répartis à travers le cerveau dans la phase aiguë de l'infection d'unnd comment la distribution des récepteurs cellulaires et leur affinité pour les virus contribuent à la propagation virale. Kawasaki et al. Ont évalué ICV et IV infections du point de vue de la distribution des particules et de leurs récepteurs (β1 intégrines) dans la première phase de l' infection. Nous avons constaté que la diffusion de particules CMV et l'expression de β1 intégrines sont bien corrélées à la première phase de l' infection dans les deux ICV et les infections IV 8. infection ICV est un modèle de ventriculoencephalitis et l'infection IV est un modèle de nodules microgliales diffuses. L'étude de la dynamique des particules virales ou fluorescentes donnerait des informations utiles sur l'effet de la taille des particules, les interactions virales avec des récepteurs cellulaires, et le mécanisme de pénétration BBB dans le cerveau. Le protocole suivant peut être utilisé pour enquêter sur toute infection virale et vecteur viral dans le SNC.
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Protocol
Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de l'Université Hamamatsu de l'École de médecine de soins aux animaux.
1. Préparation de MCMV (souche Smith) et recombinant M32-protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) -MCMV
- Générer des recombinants M32-EGFP MCMV selon le procédé de la manière suivante (1.2 - 1.9) et 8 comme décrit précédemment.
- Utilisez des virus recombinants dérivés de la souche Smith de type sauvage MCMV (numéro d'accession: U68299). Insérer EGFP (4,361 paires de bases; pb) entre 37089 et 41450 pb (M32 - locus M31) dans le génome MCMV par recombinaison homologue.
- Amplifier par réaction en chaîne de la polymérase du MCMV M32 (41450 - 39286 pb, à gauche séquence adjacente et M31 (37089 - 39246 pb, flanquant droit loci du gène de séquence en utilisant les amorces suivantes: M32, 5'-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(amorce sens), 5 '-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(Amorce inverse); M31, 5'-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3' (amorce sens), 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 '(amorce inverse).
- Insérer le locus dans le vecteur M32 exprimant EGFP en utilisant les sites de restriction Nhel et BamHl. Insérez le locus M31 dans le M32-EGFP -recombinant plasmide en utilisant des sites AflII et Xbal. Cliver le M32 - EGFP - séquence M31 avec Nhel et AflII du M32 - EGFP - M31 recombinaison plasmide et dissoudre dans H 2 O.
- Transfecter la construction clivée dans les noyaux de MCMV (souche Smith) infectés par des cellules NIH3T3 post-infection 24 h (hpi) en utilisant un système d'électroporation pour induire la recombinaison homologue.
- Au bout de 3 jours après l'infection, la co-culture, les cellules avec des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) non infectée dans un rapport de 1 / 1.000 dans des plaques à six puits et à l'écran pour les foyers exprimant EGFP des cellules infectées.
- Harvest les surnageants contenant le virus provenant des puits contenant des foyers vert fluorescent et on dilue dix fois. Pour la purification, choisissez des puits qui affichent simples foyers fluorescents verts.
- Lorsque tous les foyers résultant de l'affichage de l'infection EGFP expression de limitation de la dilution, la préparation de virus est pur, indiquant qu'aucun virus de type sauvage reste. Quantifier le virus par la méthode plaque-test comme décrit précédemment 17.
- Traiter MCMV dans des armoires de biosécurité certifiées au niveau de biosécurité 2 portant des gants et un masque.
- Passage MCMV (souche Smith) et MCMV recombinante dans MEFs préparés à partir de 12 jours d'âge des embryons de souris ICR comme décrit précédemment 17.
- Retirer les cellules des surnageants des cultures MEF infectées par centrifugation à 3000 x g pendant 20 min à 16 ° C.
- Ultracentrifugation des surnageants pendant 40 min à 70 000 x g. Remettre en suspension les culots contenant les virions dans 1 ml de solution saline tamponnée au Tris et transférer sur un linéaire de préformésorbitol à gradient (25% - 70%). Ultracentrifugeuse de nouveau à 70.000 x g pendant 60 min 18.
- La récolte de la bande contenant virion avec une seringue. Sédimenter les virions récoltées par une étape d'ultracentrifugation supplémentaire à 70 000 x g pendant 40 min.
- Remettre en suspension le culot dans 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et conserver à -80 ° C jusqu'à ce que les expériences d'infection.
- Quantifier le titre viral par la méthode de dosage sur plaque 19 comme décrit précédemment.
- Visualiser l'expression de l' EGFP des particules recombinantes MCMV (excitation à 489 nm, émission à 508 nm) , par microscopie à fluorescence (figure 1A) et la structure des particules par microscopie électronique à transmission (MET) 8 (figure 1B).
2. Préparation de microbilles Nile Red Fluorescent
- Achat carboxyle fluorescent Nil microbilles rouges et placer 500 ul de microbilles dans des tubes selon le diamètre (0,04- 0,06 pm, d' environ 3,63 × 10 12 particules; De 0,1 à 0,3 um, d' environ 5,75 x 10 10 particules; et 01.07 à 02.02 pm, d' environ 6,85 x 10 7 particules).
- Traiter perles avec 500 pi de NaOH 0,1 M pendant environ 1 jour pour enlever toutes les endotoxines et resuspendre les billes dans l'eau stérile à la température ambiante.
- Adsorber les billes O / N avec du sérum de souris à 10% obtenu à partir de souris C57BL / 6 à la température ambiante avant utilisation.
- Pour séparer les agrégats, les perles vortex et sonication soigneusement avant utilisation.
3. ICV Injection de mCMV et fluorescentes microbilles en souris néonatale
- Maintenir des souris ICR enceintes normales dans une installation à température contrôlée dans un cycle de 12 heures de lumière / obscurité. Les nouveau-nés sont désignés en tant que P 0,5 au jour de la naissance.
- Stériliser une seringue de 10 ul et une aiguille 27 G avec 70% d'alcool.
- Charger la solution d'injection (5 pl) contenant des micro MCMV ou fluorescentperles dans l'aiguille en tirant avec précaution le piston de la seringue.
- Retiens souris néonatale (P 0,5) en plaçant la souris sur la glace pendant 3 - 4 min. Une fois que l'animal est sous anesthésie, utilisez la méthode de réponse des orteils de pincement pour déterminer la profondeur de l'anesthésie.
- Marquer le site d'injection avec un stylo de laboratoire non-toxique à un endroit d' environ 0,7 à 1,0 mm latéralement à la suture sagittale et 0,7 à 1,0 mm caudale de la bregma néonatale (figure 2A).
- Insérer l'aiguille de 2 mm de profondeur, perpendiculairement à la surface du crâne au niveau du site d'injection marquée. Pour référence, marquer 2 mm de la pointe de l'aiguille avec une machine non-toxique.
- Injecter lentement 5 pi de MCMV (environ 5 x 10 5 pfu) dans le ventricule latéral sans ouvrir le cuir chevelu (Figure 2B).
- Dans un autre groupe de souris, injecter une solution de 5 ul contenant des microbilles fluorescentes (0,1 à 0,3 um, d' environ 5,75 x 10 8 particules) parla même méthode.
- Retirez lentement l'aiguille 10 - 20 secondes après l'arrêt du mouvement de piston pour empêcher le reflux.
- Pour récupérer, garder la souris pendant 5 - 10 min dans un récipient chaud jusqu'à ce que le mouvement et la réactivité générale sont restaurés.
- Récolter les cerveaux comme décrit dans la section 5, à une gamme de points de temps (3, 12, 24, 48, et 72 h) après l'injection.
4. IV Injection de mCMV ou fluorescentes microbilles en souris néonatale
- Retiens souris néonatale (P 0,5) en plaçant la souris sur la glace pendant 3 - 4 min.
- Utiliser une seringue de 1 ml avec une aiguille 35 G pour effectuer l'injection intraveineuse de 0,5 MCMV P nouveau-nés.
- Utilisez un transilluminateur (veine finder) pour visualiser le temporel (facial) veine superficielle. Avant injection, fixer le nouveau - né à l'transilluminateur en utilisant du ruban chirurgical (figure 2C).
- Tout en portant des lunettes grossissantes (1.5X), infuser lentement 50 pi de MCMV (environ 5,45 ×; 10 9 particules) ou des microbilles fluorescentes (0,04 - 0,06 um, d' environ 3,63 × 10 11 particules; 0,1 - 0,3 um, d' environ 5,75 × 10 9 particules; et 1,7 - 2,2 um, d' environ 6,85 x 10 6 particules) dans la veine temporale superficielle (figure 2D).
- Après avoir retiré l'aiguille, utiliser la gaze contenant 70% d'alcool pour faire pression sur le site d'injection jusqu'à ce que le saignement cesse.
- Donnez le nouveau-né environ 5 min dans un récipient chaud pour récupérer avant de le retourner à la cage.
- Récolter les cerveaux comme décrit dans la section 5, à une gamme de points de temps (3, 12, 24 et 72 heures) après l'injection.
5. Cerveau Préparation des échantillons de tissus pour les sections paraffiniques
- Placez les nouveau-nés injectés dans un petit plat en plastique sur la glace pilée.
- Une fois que l'animal est sous anesthésie, utilisez la méthode de réponse des orteils de pincement afin de déterminer la profondeur de anesthesia.
- Faire un coupes d'extrémité centrales ou deux extrémités horizontales à travers la cage thoracique pour ouvrir la cavité thoracique.
- Faire une coupe dans l'atrium avec des ciseaux pointus. Infuser paraformaldéhyde 4% (PFA) solution dans l'oreillette. Arrêter la perfusion lorsque le mouvement spontané (PFA de danse) et de couleur allégée du foie sont observés. Ne pas être exsangue.
- Disséquer le nouveau - né (comme décrit précédemment 20) en enlevant d' abord la tête à l' aide d' une paire de ciseaux.
- Faire une incision médiane le long du tégument du cou au nez pour exposer le crâne.
- Placez l'extrémité pointue d'une paire de ciseaux d'iris dans le foramen magnum d'un côté, soigneusement glisser le long de la surface interne du crâne.
- Faire une coupe étendant jusqu'au bord distal de la surface du crâne postérieur, et faire une coupe identique sur le côté opposé. Dégagez le crâne autour du cervelet.
- Retirer délicatement en arrière le crâne d'un côté pour éviter d'endommager le cerveau. Répétez cetteprocédure de l'autre côté du cerveau.
- Avec une spatule, couper les bulbes olfactifs et connexions nerveuses le long de la surface ventrale du cerveau.
- Séparez délicatement le cerveau de la tête, le parage toute dure qui relient encore le cerveau sur le crâne à l'aide de ciseaux, et retirer le cerveau.
- Placer le cerveau dans un flacon de fixatif contenant 4% de PFA au moins 10 fois le volume du cerveau pendant 24 heures à 4 ° C.
- Déshydrater le tissu à travers une série de bains d'éthanol graduées pour déplacer l'eau, puis avec de la cire de paraffine infiltrer, la formation d'un bloc. Couper le bloc de paraffine avec un microtome en tranches de 4 um d' épaisseur 21.
- Déparaffiner et réhydrater les diapositives des cerveaux infectés 22. Procéder à une hybridation in situ pour des sections de paraffine.
6. Cerveau Préparation des échantillons de tissus pour les sections congelées
- Retirez le cerveau en suivant les étapes décrites dans 05.01 à 05.11.
- Pour observer les microbilles fluorescentes et M32-EGFP-MCMV, placez le cerveau réséquée sur cryomoules fond plat. Ajouter milieu d'inclusion pour couvrir complètement l'échantillon de cerveau. Snap geler les cryomoules dans prérefroidi n - hexane (-80 ºC), en utilisant une pince pour maintenir le bord des cryomoules avant de fixer au mandrin.
- Pour sectionner, fixer le bloc de tissu congelé sur le cryostat chuck prérefroidi. Transférer le tissu congelé avec le mandrin dans une chambre de cryostat et abaisser la température entre -10 et -20 ° C, et couper les tranches d' environ 8 à 10 um d' épaisseur 23.
- Fixer les sections avec cytofixative (mélange d'alcool isopropylique et le polyéthylène glycol) par pulvérisation. Air sécher les sections pendant 30 min à température ambiante immédiatement après la pulvérisation, et les stocker à - 80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
- Equilibrer les sections de retour à température ambiante et laver trois fois avec PBS.
- Colorer les sections avec l' isothiocyanate de fluorescéine (FITC) Griffonia simplicifolia isolectine B4 à une concentration de 1: 100 pendant 10 min dans du PBS à la température ambiante (figure 5) ou avec un anticorps CD31 conjugué à PE , à une concentration de 1: 100 pendant 30 min dans du PBS à la température ambiante (figure 6).
- Laver les sections avec du PBS à trois reprises.
- Après le lavage, teinture avec les sections 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour visualiser les noyaux cellulaires. Monter les sections dans le réactif anti-fade et de l'image DAPI (excitation à 345 nm, émission à 455 nm), EGFP (excitation à 489 nm, émission à 508 nm) et rouge du Nil (excitation à 553 nm, émission à 637 nm) avec un microscope à fluorescence (figures 3, 5, 6).
7. Fluorescent in situ Hybridation (FISH) pour paraffine Sections
- Préparer la sonde FISH marqué directement avec fluorophore pour l' ADN hybridation in situ par translation de coupure en utilisant un chromosome bactérien artificiel contenant l'ensemble MCMV ADN genome (pSM3fr) 19. La concentration de la sonde FISH est de 0,1 pg / pl.
- Déparaffiner et réhydrater les diapositives des cerveaux infectés 22.
- Traiter les sections de tissu avec de la RNase (100 pg / ml dans du PBS) pour détecter l'ADN viral.
- Effectuer la récupération d'antigène avec du NP40 à 0,05%, 0,01 M de tampon citrate (pH 6,0) à 95-98 ° C pendant 20 min. Refroidir les lames jusqu'à la température ambiante pendant 20 min.
- Dans un bocal de coloration de Coplin en verre, laver les lames dans l'eau pure à trois reprises pendant 2 min à chaque fois. Effectuer une étape supplémentaire de récupération de l'antigène avec une pepsine 0,06%, 0,01 solution N HCl pendant 5 min à 37 ° C.
- Rincer les lames trois fois dans de l'eau pure pendant 2 min à chaque fois dans un bocal de Coplin de coloration du verre.
- Déshydrater les coupes de tissus en transférant à nouveau les lames de 70% d'éthanol, 85% d'éthanol, puis 100% d'éthanol.
- Pour la préparation de 10 ml du tampon d'hybridation, mélanger 1,25 ml de sels d'hybridation in situ (3 M de NaCl, 100 mM de Tris-HCl , PH 8,0, 100 mM de phosphate de sodium , pH 6,8, EDTA 50 mM) avec 5 ml de formamide désionisé, 2,5 ml de 50% de sulfate de dextran, 250 ul de 50 x solution de Denhardt, 125 ul de 100 mg / ml d' ARNt et 875 ul de H 2 O.
- Diluer la sonde d'ADN marqué directement avec des fluorophores qui reconnaissent la totalité du génome de MCMV de façon aléatoire dans le tampon d'hybridation. Le volume final doit être de 10 ul (tampon d'hybridation 7 ul, 1 ul de la sonde (0,1 ug / ul) et 2 ul d'eau distillée).
- Ajouter le mélange de sonde (10 pi) à chaque diapositive et couvrir avec une lamelle (15 × 15 mm). Sceller la lamelle couvre-objet avec du ciment de caoutchouc. Dénaturer le mélange de la sonde pendant 5 min à 85 ° C, et terminer l'étape d'hybridation O / N à 42 ° C.
- Laver les lames avec 0,3% de NP40, 0,4x SSC à 73 ° C pendant 2 minutes; avec 0,1% de NP40, 0,4 x SSC à 73 ° C pendant 1 min; et avec 2x SSC deux fois.
- Counterstain les noyaux avec DAPI (10 ng / ml) et couvrir la lame avec une lamelle.
- Monterles sections de réactif anti-fade et de l' image DAPI (excitation à 345 nm, émission à 455 nm) et EGFP (excitation à 489 nm, émission à 508 nm) avec un microscope à fluorescence (figure 4).
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Representative Results
Dans les études sur la pathogenèse de l'encéphalite virale, la méthode d'infection est importante. La voie hématogène représente une infection aiguë des cellules et des pericytes du cerveau endothéliales, alors que la route ICV représente une infection aiguë propagation via le CSF à travers l'espace méningée, atteignant les méninges et le plexus choroïde. À analyser la première distribution de particules dans l' encéphalite aiguë, une hybridation in situ pour la détection des génomes MCMV et de l' observation directe de particules M32-EGFP mCMV ou microbilles fluorescentes ont été utilisées.
Génération de recombinants MCMV (M32-EGFP-MCMV)
Le protocole illustre comment recombinant M32-GFP-MCMV a été généré. EGFP a été inséré entre 37089 et 41450 pb (locus M32-M31) dans le génome par recombinaison homologue MCMV. Un EGFP protein a été fusionnée avec une protéine virale (M32) et EGFP a été exprimée dans les particules virales. Après recombinaison homologue, une préparation de virus a été considéré comme pur quand tous les foyers résultant de l'infection de limitation de dilution affiché expression EGFP, indiquant qu'aucun virus de type sauvage est resté. Elle peut prendre des modes opératoires de dilution multiples pour purifier le virus recombinant. La figure 1A montre des signaux de EGFP de recombinant purifié MCMV (M32-EGFP-MCMV) et la figure 1B représente une image MET de particules M32-EGFP-MCMV contenant le génome viral dans le noyau viral .
Injection intracérébroventriculaire et intravasculaire Injection
La Figure 2 montre les sites d'injection de souris néonatale (P 0,5) , où le virus ou les microbilles ont été injectés par voie ICV ou par voie intraveineuse. Dans ICV, le site d'injection se trouve à mi-chemin entrel'oreille et l' oeil, à un endroit situé à environ 0,7 - 1,0 mm latéralement à la suture sagittale et 0,7 - 1,0 mm caudale à partir du bregma néonatale (figure 2A). L'aiguille doit être injectée dans le ventricule latéral de 2 mm de profondeur, perpendiculairement à la surface du crâne (figure 2B). Figure 2C et 2D montrent que MCMV ou microbilles sont injectés dans la veine temporale du visage de souris nouveau - nées. Un transilluminateur et loupes sont des outils utiles pour visualiser clairement les petites veines.
La distribution des particules virales / Génomes et microbilles fluorescentes
Les chiffres suivants montrent la répartition des particules virales / génomes et les microbilles fluorescentes dans la phase aiguë. La figure 3 montre les signaux de microbilles de coupes congelées du cerveau. Figure 3A et 3B montrent ladistribution des 0,1 -. 0,3 um fluorescentes Nil microbilles rouges dans la zone marginale (MA) (Figure 3A) et le plexus choroïde et de la zone sous- ventriculaire (SVZ) (figure 3B) à l' injection post-ICV 2 h Figure 3C et 3D montrent la distribution des 0,1 - 0,3 um fluorescentes Nil microbilles rouges dans la MA et de la zone vasculaire (figure 3C) et le plexus choroïde et SVZ (Figure 3D) à injection post-IV 2 h. Il est probable que, suite à l'injection ICV et IV, les particules ne sont pas réparties uniformément dans toute la suite parenchyme. Au contraire, ils sont restés dans le SVZ, MA, et la zone vasculaire dans la phase d'infection aiguë. La taille des particules est le principal facteur influant sur leur distribution dans le cerveau dans la phase aiguë qui suit ICV et l' injection IV. La figure 4 montre le FISH du génome MCMV sur les sections de paraffine du cerveau. Le génome du MCMV (taches vertes) a été détectée dans leSVZ au post - injection de ICV 3 h (figure 4B). Les génomes MCMV (taches vertes) ont été détectés dans la MA et la zone vasculaire à 3 heures après l' injection IV (figure 4C). La répartition de la MCMV (figure 4) et les microbilles (figure 3) étaient très semblables. La figure 5 montre les diagrammes de microbilles de distribution dépendant de la taille des coupes congelées de cerveau après l' injection intraveineuse. Les microbilles ayant un diamètre de 1,7 - 2,2 um (figure 5B), 0,1 - 0,3 pm (figure 5D), et de 0,04 à 0,06 um (figure 5E) sont représentées respectivement. Petites microperles ont une tendance à être extravasation hors de la zone vasculaire dans le parenchyme. La figure 6 montre la répartition des particules M32-EGFP mCMV dans les sections gelées du cerveau. Signaux GFP de points (particules M32-EGFP-MCMV) ont été principalement observées dans la MA (figure 6A) et le plexus choroïde et SVZ (
Figure 1:. Génération de particules recombinant M32-EGFP-MCMV (A) ultracentrifugation M32-EGFP-Mcmv sont considérés comme des taches vertes par microscopie à fluorescence. Barre d' échelle:. 2,4 um (B) , la microscopie électronique à transmission révèle que les particules M32-EGFP-MCMV possèdent une structure de virus typique. Barre d'échelle: 77 nm.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig1large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Sites d'injection de la souris néonatale. (A, B) injection ICV de 5 pi MCMV (environ 5 × 10 5 PFU) ou 5 microbilles de pi (environ 5,75 × 10 9 particules). (A) Le site d'injection est à mi - chemin entre l'oreille et l' œil (au un emplacement d' environ 0,7 - 1,0 mm latéralement à la suture sagittale et 0,7 -. 1,0 mm caudale à partir du bregma du nouveau - né) , (B) une aiguille de calibre 27 avec une seringue de 10 ul est utilisé pour l'injection dans le ventricule latéral de 2 mm de profondeur, perpendiculaire à la surface du crâne. (C, D) ou MCMV microbilles sont injectés dans la veine temporale du visage de souris nouveau - nées (C) . (D) Une seringue de 1 ml avec une aiguille 35 G est utilisé pour effectuer l'injection IV de MCMV. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 3: Visualisation des fluorescents Nil microbilles rouges dans le cerveau (A, B) 0,1 - 0,3 um fluorescent rouge Nil microbilles signaux (rouge) sont observées dans la MA (A) et le plexus choroïde et SVZ (B) à 2 h après l' injection ICV (C, D) 0,1 -. 0,3 um fluorescentes Nil microbilles rouges introduits dans le cerveau de souris néonatale par injection IV après l'injection de 2 heures. Nil microbilles rouges sont observées dans ee MA et de la zone vasculaire (C) et le plexus choroïde et SVZ (D). Le carré blanc est amplifié dans l'insert agrandie en haut à droite de (D) (A, C) Barre d' échelle:. 50 pm (B, D) Barre d'échelle:. 150 um. Les flèches indiquent le Nil microbilles rouge. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: MCMV Genome Distribution dans le cerveau de souris Après ICV injection et injection IV (A) La vue inférieure de grossissement.. Le carré blanc indique où l'image agrandie (B) a été capturé. (B) Le génome MCMV (taches vertes) est d' abord détectée dans le SVZ au post - injection de ICV 3 h. DAPI (4 ';, 6-diamidino-2-phénylindole) est utilisé pour l'acide nucléaire (nucléaire) la coloration. Barre d' échelle:. 30 pm (C) Le génome MCMV (taches vertes) est détectée dans la région et meninges vasculaire à l' injection post-IV 12 h. DAPI est utilisé pour la coloration de l'acide nucléaire. Barre d'échelle: 30 um. Les flèches indiquent le génome de MCMV représentant (taches vertes). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. La relation entre le diamètre des microbilles et de la distribution des microbilles fluorescentes Nil microbilles rouges (50 pi) sont introduits dans les cerveaux de souris néonatales par injection intraveineuse. Dans les coupes congelées préparé 2 après l'injection h, les signaux rouges du Nil (rouge, indiquées par des flèches) sont observées dans et autour de la vascular zone du parenchyme. La zone vasculaire est tachée de lectine fluorescente (vert) (A, B) 1,7 -.. 2,2 um microbilles (A) La vue inférieure de grossissement. Le carré blanc indique où l'image agrandie (B) a été capturé (B) Le carré blanc est amplifié à mesure que l'insert agrandie en haut à droite de (B) (C, D) 0,1 -... 0,3 um microbilles (C) Le vue faible grossissement. Le carré blanc indique où l'image agrandie (D) a été capturé (D) Le carré blanc est amplifié à mesure que l'insert agrandie en haut à droite de (D) (E, F) 0,04 -... 0,06 um microbilles (E) vue faible grossissement. Le carré blanc indique où l'image agrandie (F) a été capturé. (F) Le carré blanc est amplifié à mesure que l'insert agrandie en haut à droite de
Figure 6: Observation des particules de virus dans la phase d'infection aiguë. (A, B) signaux EGFP de points (particules M32-EGFP-MCMV) sont principalement observée dans la MA (indiqué par des flèches; A), le plexus choroïde et SVZ (indiqué par des flèches; B) à 2 heures après l' injection ICV. Les carrés blancs sont amplifiés que les inserts agrandies dans la partie supérieure droite de (A) et (B). Barre d' échelle:. 20 pm (C, D) A après l' injection IV de 3 heures, les particules MCMV (de vert, indiqués par des flèches) se trouvent à l' intérieur et à l' extérieur de la zone vasculairele parenchyme (C), plexus choroïde, et SVZ (D) , ( en rouge: les cellules CD31-positives). Les carrés blancs sont amplifiés que les inserts agrandies dans la partie supérieure droite de (C) et (D). Barre d' échelle:. 20 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans les modèles animaux, ICV, intrapéritonéale, placentaire directe, et les infections IV ont été utilisées pour étudier la pathogenèse de l'encéphalite virale. Nous nous sommes concentrés sur les modèles de ICV et d'injection IV de souris néonatales pour la simplicité des procédures et l'avantage de l'injection directe de particules dans la région cible. Bien que l' infection intrapéritonéale est une méthode facile, les particules virales se propagent de manière systémique par l' intermédiaire d' un processus 5,24 indirect. infection placentaire directe est une bonne méthode pour étudier l'infection systémique embryonnaire. Cependant, cette méthode nécessite une formation spéciale pour donner des résultats stables et a un faible taux de réussite. Le procédé d'infection est également un procédé indirect à travers le placenta , et il est difficile de contrôler la quantité d'injection dans le foetus lors de chaque essai 6. Comme la souris néonatale est très sensible aux virus tels que le CMV, dans cette étude, nous pourrions comparer la distribution des particules virales et des cellules infectées dès les premières pvvihe de l'infection. Le modèle d'injection ICV est bénéfique pour étudier le comportement de l' infection qui contourne le BBB 25, alors que le modèle d'infection IV est un modèle d'infection systémique ressemblant à une infection naturelle , y compris l'interaction du virus avec le BBB.
Avec la méthode d'injection de ICV, nous nous sommes assurés de pénétrer au moins 2 mm de profondeur dans le crâne. L'aiguille a été maintenu à l' intérieur des ventricules cérébraux pendant environ 10 - 20 sec pour empêcher le reflux de la ventricules 26. Quand cela est fait avec soin, l' injection ICV est un moyen rapide et facile méthode in vivo. Cependant, les injections parfois inexactes, y compris le reflux indésirable ou une pénétration profonde / peu profonde de l'aiguille vers le cerveau peut se produire. procédures et observations post-injection minutieuses sont nécessaires pour effectuer ce protocole avec succès. Compte tenu des erreurs d'injection, nous ne concentrons sur les modèles de distribution des particules et non pas sur la quantité, et n'a pas observé les effets du traitement de la drogues ou des anticorps fonctionnels dans notre étude.
Il existe plusieurs procédures pour effectuer l'injection IV néonatale murin, par le biais de plusieurs sites tels que les veines superficielles temporelles, veine jugulaire externe, et sinus rétro-orbital. La veine temporale superficielle du nouveau-né est facilement visualisées en utilisant un transilluminateur et le grossissement objectif. L'injection peut être complétée par une seule personne expérimentée avec un succès élevé rate.We a choisi la veine temporale superficielle comme le site de l'injection IV. Le procédé d'injection intraveineuse nécessite une formation telle que le positionnement de la souris néonatale et la procédure d'injection. Le chef de la souris néonatale doit être positionné avec du ruban adhésif pour la veine temporale soit sur le dessus et plat. L'aiguille 35 G doit être insérée dans le récipient suffisamment loin que la pointe de l'aiguille est complètement entourée par la cuve. Un transilluminateur et loupes sont des outils utiles pour visualiser clairement les petites veines. L'injection de grands volumes allant jusqu'à 100ul doit être perfusée lentement pour confirmer l'écoulement du contenu. En cas d'échec de l'injection au premier procès, l'autre côté de la veine temporale est disponible pour un autre essai. Après l'injection, les chiots éprouvent une détresse minimale et récupérer rapidement. On ne sait pas pourquoi une moyenne de chiots une sur 20 l'expérience de détresse majeure et ne récupère pas. Cependant, le taux d'occurrence de cet événement de dommages minimalement l'ensemble de la conception expérimentale faible.
Comme la méthode d'injection IV a un taux de réussite élevé (plus de 80%), nous pourrions comparer le modèle de distribution avec et sans traitements systémiques tels que des médicaments ou des anticorps fonctionnels. Nous avons déjà mené une expérience où les souris néonatales ont été injectés avec anti-β1 intégrine anticorps bloquants fonctionnels (50 pi à 20 pg / g) anticorps témoins ou isotype (50 pi à 20 pg / g) dans la veine temporale superficielle des souris néonatales. injection d'anticorps post d'une heure, 5 × 106 PFU (50 ul) de MCMV ont été perfusé dans l'autre côté de la veine temporale. Le nombre de cellules positives par MCMV-section du CD29 de hamster anti-rat (β1 chaîne de l' intégrine, le clone Ha2 / 5) , le cerveau -Traité étaient significativement plus faibles quand on compare avec celle d' un isotype d' anticorps traités par le cerveau 8. En utilisant le même procédé dans les enquêtes à venir, les effets des médicaments ou des anticorps neutralisants contre le virus peuvent être déterminés en observant la distribution des particules virales et des cellules infectées.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH 6) x 10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50x) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/ml) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC 20x | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E |
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